HPLC法同時測定不同采收期珠子參中5種皂苷類成分含量

李 慧 鄒晨鑫 高 靜 顏永剛 張 崗 宋小妹 楊新杰

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 7120460

珠子參PanacisMajorisRhizoma(PMR)為五加科人參屬珠子參PanaxjaponicusC.A.Meg var.major (Burk.) C.Y.Wu et Feng ex C.Chow的干燥根莖，又名扣子七、珠兒參，主產(chǎn)于陜西、四川、云南、甘肅、寧夏、西藏等地，味苦、甘，性微寒，有滋陰養(yǎng)肺、止血活絡(luò)、益氣強身等功效[1]。珠子參根莖是主要的藥用部位，主要包含皂苷、多糖、黃酮、微量元素等，目前已經(jīng)從珠子參不同部位分離獲得多個單體皂苷，珠子參總皂苷具有一定的鎮(zhèn)痛抗炎[2]、增強免疫[3]、抗腫瘤[4-7]等活性。珠子參生長緩慢成藥周期長，多生長于蔭蔽的林下等地，目前野生珠子參已處于極度瀕危狀態(tài)，對珠子參的研究也多為化學(xué)成分、藥理活性等，而栽培、資源分布等較少，因此合理規(guī)劃其采收期是極其重要的。本實驗采用高效液相色譜法對5～7月不同采收期珠子參中5種化學(xué)成分含量變化，來確定珠子參最佳采收期。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀； GB204 型電子分析天平 (北京賽多利斯); KQ-200KED 超聲波清洗機 (江蘇昆山); GZX- 9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 (上海博迅)。

1.2 試藥 供試材料來源于陜西太白山種植基地，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級實驗師鑒定為五加科植物珠子參PanaxjaponicusC.A.Meg var.major (Burk.) C.Y.Wu et Feng。人參皂苷Ro(批號 111903-201805)和人參皂苷Rg1(批號110703-201933)均購于中國食品藥品檢定研究院，姜狀三七皂苷Rg1(批號B50413)，竹節(jié)參Ⅳa(批號B21676)，去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa(批號B24067)均購于上海源葉公司。

1.人參皂苷Rg1；2.人參皂苷Ro；3.竹節(jié)參皂苷Ⅳa；4.姜狀三七皂苷R1；5.去葡萄糖竹節(jié)參Ⅳa圖1 珠子參中5種成分供試品(A)與對照品(B)的高效液相色譜圖

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 珠子參根莖烘干，稱重，粉碎，取0.1 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱重。超聲處理40 min(功率500 W，頻率40kHz)，放至室溫，補足失量，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

2.2 混合對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用適量色譜甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，分別制成含人參皂苷Rg1 0.04 mg·mL-1、人參皂苷Ro 0.2 mg·mL-1、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.25 mg·mL-1、姜狀三七皂苷R1 0.1 mg·mL-1、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa 0.1 mg·mL-1的對照品儲備液，0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.3 色譜條件 色譜柱為Thermo C18 (5 μm，4.6 mm × 250 mm) 色譜柱；流動相為乙腈(A)-0.02%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～10 min: 5%～40%A; 10～22 min: 40%～75%A，22～34 min: 75%～90%A)，檢測波長203 nm，柱溫30℃，體積流量1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液1、5、10、 15、20 μL，按“2.3”項下色譜條件測定峰面積，以進樣量為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進行線性回歸，得回歸方程，見表1。

表1 5種化學(xué)成分回歸方程及線性范圍

圖2 竹節(jié)參皂苷Ⅳa回歸曲線

2.5 精密度實驗 精密吸取混合對照品溶液 10 μL，重復(fù)進樣 5 次，測定峰面積，計算得人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七皂苷R1、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為1.3%、2.1%、2.5%、2.4%、1.1%。

2.6 重復(fù)性實驗 精密稱取同一批樣品(采收時間2019年6月1日)6份，按“2.1”項下方法制備，吸取10 μL 進樣，測定峰面積，計算得人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為2.4%、1.2%、2.3%、1.5%、2.1%，符合要求。

2.7 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液(采收時間2019年6月1日)，分別于配制后0、3、6、9、12、24 h 進樣10 μL，測定峰面積，計算得人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為1.2%、2.3%、2.1%、1.6%、1.5%。 結(jié)果表明，供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收實驗 精密稱取同一批樣品(采收時間2019年6月1日)珠子參藥材0.1g，平行稱定6份。分別精密加入人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1、去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa對照品適量，按2.1項下方法制備成供試品溶液在上述色譜條件下測定，計算得到各成分平均加樣回收率為97.3～99.3%，RSD為1.8～2.5%，表明方法準(zhǔn)確度較好，結(jié)果見表2。

表2 方法學(xué)考察結(jié)果 (%，n=6)

續(xù)表2

2.9 不同采樣時間中5中化學(xué)成分的含量測定 精密稱取不同批次樣品珠子參藥材粗粉0.1 g，每組重復(fù)6 次，按“2.1”項下方法制備供試品，按“2.3”項 下條件進樣分析，測定峰面積，計算含量，結(jié)果見表 3。5種成分從5月份開始含量積累逐步增加，直至7月份達(dá)到最大，隨后開始下降，其中人參皂苷Ro與竹節(jié)參皂苷Ⅳa最為顯著。

表3 樣品含量 (%，n=6)

3 討論

中藥材有效成分含量對其質(zhì)量至關(guān)重要，直接影響藥材藥理活性[8]。靳維榮等[9]發(fā)現(xiàn)黃芩在9月份黃酮類含量最高，李雪營等[10]發(fā)現(xiàn)不同采收期對黔產(chǎn)鴨跖草若也有顯著影響，研究表明7、8月采收最為適宜。

珠子參作為秦巴山區(qū)特色藥材之一，具有多種化學(xué)成分，不同時期的珠子參成分含量相差甚遠(yuǎn)。本實驗首次建立HPLC法同時測定珠子參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七皂苷R1和去葡萄糖竹節(jié)參皂苷Ⅳa 5種皂苷類成分含量的方法，結(jié)果顯示，5種皂苷類成分含量在不同時期的含量都存在明顯差異，隨著不同時期的采收可以看出5種皂苷類成分含量有明顯差異，5種皂苷類成分含量都在逐步增高，其中人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量始終最高，7月份采收含量顯著高于其它月份采收樣品，說明珠子參適合夏末秋初采收，李淵源等[11]研究亦證實了這一點，本實驗結(jié)果與《陜西中草藥》[12]、15版《中國藥典》[1]中記載的珠子參采收期為“夏秋采挖”“秋季采收”有共同相似之處，為進一步證明傳統(tǒng)采收時間的合理性提供了科學(xué)依據(jù)，但具體時間還需根據(jù)氣候條件等考慮。本實驗只選取了5～8月份，且5種成分在7個時間點含量差距較大，分析原因可能是珠子參地上部分正在萌發(fā)從而導(dǎo)致根莖中的代謝產(chǎn)物質(zhì)量減小，此外除不同采收時間對含量有所影響，如土壤溫度、空氣溫度、濕度、光合有效輻射等生態(tài)因素的不同有效成分也會發(fā)生不同程度的變化[13-14]，氣候?qū)χ樽訁⒂行С煞址e累有待進一步研究。

綜上所述，經(jīng)方法學(xué)考察，本研究所建立的HPLC法線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好，可用于同時測定不同采收期珠子參藥材中5種有效成分的含量。