不同產(chǎn)地桑葉中黃酮類成分含量分析

張憲，李岳

(北京市藥品檢驗所 儀器檢測中心， 北京 102206)

桑樹在我國南北各地均有廣泛種植，因此桑葉的產(chǎn)量極為豐富。桑葉為?？?Moraceae)桑屬落葉喬木或灌木桑(MorusalbaL.)的葉，含有黃酮類、多糖類、生物堿類、氨基酸類、香豆素類、維生素類、脂類、礦物質(zhì)等諸多化學(xué)成分[1-2]。中醫(yī)藥學(xué)認為桑葉具有疏風(fēng)散熱，清肺、肝的作用，可以用于治療風(fēng)熱型感冒、肺熱型咳嗽以及頭暈、頭痛、眼花等，此外還具有降血壓、血脂、血糖，預(yù)防心肌梗塞等功效，可直接抑制凝血、降低心率，促使血壓下降[3-4]。桑葉對糖尿病及其并發(fā)癥的療效已得到醫(yī)學(xué)界的廣泛認可，并且已知桑葉中發(fā)揮降糖效果的主要化學(xué)成分即為黃酮類[5-6]，此外，桑葉提取的黃酮類成分在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、提高免疫力等諸多方面起到重要的作用。本研究選取了河南商丘、湖北襄陽、湖南邵陽、浙江桐鄉(xiāng)、江蘇泰興、四川綿陽、安徽亳州、廣西玉林等8個產(chǎn)地的桑葉，采用高效液相色譜法(HPLC)測定了不同地區(qū)桑葉中黃酮成分的含量，為桑葉的采集與藥理作用開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究選取我國8個省份不同地區(qū)的桑葉，總共分為22個批次，經(jīng)鑒定所有藥材均為真品。 桑葉產(chǎn)地來源詳見表1。

表1 桑葉藥材樣品來源

1.2 儀器與試劑

1200型HPLC儀(美國安捷倫科技公司)；1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；毛蕊異黃酮苷和毛蕊異黃酮對照品(上海純優(yōu)生物科技有限公司)，槲皮苷、芒柄花苷、異槲皮苷以及芒柄花素的對照品(北京萬佳首化生物科技有限公司)，上述對照品的純度均大于98%；試劑乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 研究方法

1.3.1 色譜條件及溶液制備

紫外檢測器，Sepex C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為360 nm，流速1.0 mL/min，進樣體積10 μL，柱溫30 ℃。取適量的桑葉干燥后進行粉碎，精確稱量3.0 g粉末放入容器中，加入體積分數(shù)60 %的乙醇100 mL，90 ℃水浴1.5 h，回流提取，減壓濃縮后取出溶液，冷卻后稱重過濾(0.45 μm 微孔濾膜)[7]。

1—槲皮苷；2—毛蕊異黃酮苷；3—毛蕊異黃酮；4—異槲皮苷；5—芒柄花苷；6—芒柄花素。圖1 樣品及混合對照品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of the sample and mixed reference substance

混合對照品液的配置：分別精密稱取適量的毛蕊異黃酮苷、槲皮苷、芒柄花苷、異槲皮苷、毛蕊異黃酮以及芒柄花素6種對照品，用乙醇溶解后定容至50 mL，振蕩均勻，制備對照品濃度分別為0.204 1、0.785 4、0.174 6、0.153 6、0.026 4、0.032 9 mg/mL的混合對照品溶液[8]。樣品及混合對照品的高效液相色譜圖見圖1。

1.3.2 線性范圍試驗驗

取上述配備的對照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2 mL，使用甲醇定量至10 mL，用 0.45 μm微孔濾膜過濾后作為對照品溶液B，然后取B溶液1 mL，甲醇定容至5 mL作為溶液C，高效液相色譜條件下分別測定混合對照品溶液(5 μL)、溶液B(10 μL)和溶液C(10 μL)的峰面積的相對標準偏差(RSD)。

1.3.3 精密度試驗

稱取適量桑葉樣品，按照1.3.1項下方法制備供試溶液，取適量對照品混合溶液，按照色譜條件，連續(xù)進樣6次，同時記錄峰面積RSD。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗

取1.3.1中制備的供試品溶液，分別測定 0、2、4、8、10、12 h各種成分的峰面積RSD[9-10]。

1.3.5 重復(fù)性試驗

取同一批次已知總黃酮含量的桑葉樣品6份，每份3 g，按照1.3.1項下方法制備供試品溶液并進行色譜分析，利用建立的標準曲線分別計算各供試品溶液中各成分含量[11]。

1.3.6 加樣回收率試驗

精密稱取不同省份產(chǎn)地測定后的桑葉樣品，每個產(chǎn)地稱取6份，每份0.5 g。不同產(chǎn)地樣品均精密加入含毛蕊異黃酮苷24.21 μg/mL、槲皮苷 229.2 μg/mL、芒柄花苷241.4 μg/mL、異槲皮苷58.78 μg/mL、毛蕊異黃酮65.03 μg/mL、芒柄花素245.61 μg/mL的混合對照品溶液10 mL[12]，按照1.3.1項下方法制成供試品溶液，分析計算回收率。

1.3.7 樣品含量測定

分別精密稱定不同產(chǎn)地桑葉粉末2.0 g，按1.3.1項下方法制備供試品溶液和測定峰面積，并用外標法計算樣品中6種黃酮的含量[13]。

2 結(jié)果

2.1 回歸方程及線性關(guān)系分析

分析不同產(chǎn)地桑葉的質(zhì)量分數(shù)及峰面積，以進樣量標記為橫坐標(X)，各成分峰面積標記為縱坐標(Y)，其回歸方程及線性范圍結(jié)果顯示桑葉中提取的6種黃酮類成分在線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(表2)。

表2 6種黃酮類化合物的回歸方程及線性范圍

2.2 精密度試驗結(jié)果

精密度試驗結(jié)果顯示6種黃酮類成分的峰面積RSD分別為毛蕊異黃酮苷0.24%、槲皮苷0.36%、芒柄花苷0.56%、異槲皮苷0.29%、毛蕊異黃酮0.33%、芒柄花素0.16%，表明本研究檢測儀器的精密度符合要求。

2.3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

穩(wěn)定性檢測結(jié)果顯示，桑葉提取的6種黃酮類成分的峰面積RSD分別為毛蕊異黃酮苷0.13%、槲皮苷0.37%、芒柄花苷0.24%、異槲皮苷0.41%、毛蕊異黃酮0.44%、芒柄花素0.25%，表明供試品溶液12 h內(nèi)能夠基本保持穩(wěn)定，其穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果

重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，樣品中毛蕊異黃酮苷、槲皮苷、芒柄花苷、異槲皮苷、毛蕊異黃酮以及芒柄花素的平均含量分別為1.848 0%、0.373 0%、0.153 0%、1.446 0%、0.217 0%、0.006 3%，重復(fù)性試驗的RSD值分別為1.83%、1.77%、1.14%、2.16%、1.75%，結(jié)果表明試驗檢測結(jié)果的重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收試驗結(jié)果

不同產(chǎn)地6種黃酮類成分的平均回收率分別為毛蕊異黃酮苷99.61%、 槲皮苷96.05%、芒柄花苷99.98%、異槲皮苷97.97%、毛蕊異黃酮99.30%、芒柄花素96.42%；RSD 分別為 0.34%、2.17%、0.68%、0.31%、0.48%、0.71%。表明檢測方法的準確度良好。

2.6 樣品的黃酮類成分含量測定結(jié)果

檢測結(jié)果顯示，安徽亳州、四川綿陽、廣西玉林地區(qū)采集的桑葉中黃酮總量較高，其次是河南商丘、浙江桐鄉(xiāng)、江蘇泰興、湖北襄陽、湖南邵陽桑葉的總黃酮量最少，提示不同省份各產(chǎn)地桑葉的黃酮含量差異明顯，詳細數(shù)據(jù)見表3，其中，相同產(chǎn)地取不同批次的黃酮類成分的平均含量。

表3 不同產(chǎn)地桑葉中6中黃酮類成分含量測定結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法分析檢測我國8個省份不同產(chǎn)地的桑葉中6種黃酮類成分含量。結(jié)果顯示，桑葉中所含的黃酮總量，以四川綿陽、安徽亳州、廣西玉林地區(qū)較高，其次是河南商丘、浙江桐鄉(xiāng)、江蘇泰興、湖北襄陽，而湖南邵陽桑葉的黃酮總量最少。提示在選擇桑葉作為中藥材時，可酌情根據(jù)黃酮類化學(xué)成分對不同疾病的療效，進而選擇不同省份的桑葉產(chǎn)品。不同品種和不同產(chǎn)地的桑葉中黃酮類成分含量的差異可能既受到生長環(huán)境、桑葉位置、采摘時間等外部因素的影響，也與品種的差異等內(nèi)部因素有關(guān)[14]。桑樹中黃酮類化合物的含量多少與桑樹的抗逆性呈現(xiàn)相關(guān)性，其中抗逆性強的桑品種的桑葉中黃酮含量明顯較高[15]?？傊?，本研究提示高效液相色譜法測定桑葉中黃酮類成分的含量具有操作簡單、穩(wěn)定性佳及重復(fù)性好的特點，不同產(chǎn)地采集和生產(chǎn)的桑葉藥材中各類黃酮成分及總量均有差異。