麥角甾醇在猴頭菌種質(zhì)評價中的應(yīng)用研究初探

蔣 俊 宋小亞 劉 昆 路新彥

麥角甾醇在猴頭菌種質(zhì)評價中的應(yīng)用研究初探

蔣 俊 宋小亞*劉 昆 路新彥

（麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000）

應(yīng)用HPLC法對23份猴頭菌種質(zhì)的麥角甾醇進行測定分析的結(jié)果，麥角甾醇含量總體以平均值為中心呈正態(tài)分布，栽培種質(zhì)、雜交選育種質(zhì)、野生種質(zhì)組內(nèi)與組間有明顯差異；分析液相圖譜發(fā)現(xiàn)，不同種質(zhì)甲醇提取物液相圖譜的峰數(shù)存在明顯差異，在一定程度上反映出種質(zhì)差異性。應(yīng)用HPLC法對麥角甾醇進行測定分析，適用于猴頭菌種質(zhì)資源的初步評價研究。

代謝產(chǎn)物；定向育種；甲醇提取物；麥角甾醇

猴頭菌（）是我國傳統(tǒng)的食藥用真菌，富含多糖類、甾醇類、萜類、酚類、生物堿類等多種生物活性成分，具有很高的食用和藥用價值。研究表明，甾醇類物質(zhì)對胃黏膜有保護作用，猴頭菌類藥物產(chǎn)品對胃炎的良好療效可能與猴頭菌中的甾醇類物質(zhì)有關(guān)[1-2]。麥角甾醇是真菌類的特征性成分，是細胞膜的重要組分，它在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性、細胞活力和物質(zhì)運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔肹3]。麥角甾醇是猴頭菌的重要成分，目前研究多集中在子實體、菌絲體、提取物及藥品中麥角甾醇含量測定方面，而對不同來源的種質(zhì)資源特別是野生種質(zhì)綜合分析評價的研究較少[4-9]。

種質(zhì)是培育優(yōu)良作物品種的物質(zhì)基礎(chǔ)，種質(zhì)評價可為種質(zhì)的合理開發(fā)利用及育種親本選擇提供科學(xué)依據(jù)。目前食用菌種質(zhì)評價主要圍繞農(nóng)藝性狀、遺傳多樣性等進行，對活性成分等品質(zhì)性狀關(guān)注較少[10, 11]。猴頭菌是食藥兼用菌，富含多種生物活性成分，對活性成分的測定分析應(yīng)是種質(zhì)評價的重要內(nèi)容。本文旨在以活性成分麥角甾醇為目標，對不同來源的猴頭菌種質(zhì)資源進行初步研究評價，以期為深入研究和合理開發(fā)利用相關(guān)種質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的23份猴頭菌種質(zhì)，含栽培種質(zhì)3份、自育種質(zhì)2份、野生種質(zhì)18份（表1）。

23份種質(zhì)于2018年底統(tǒng)一制種、接菌包。栽培袋規(guī)格為17×33（cm），培養(yǎng)料配方為棉籽殼∶麩皮∶石膏=93∶6∶1，含水量55%～60%，pH自然。隨機抽取6袋在本單位生產(chǎn)基地菇棚內(nèi)進行出菇管理，子實體成熟后采收，采收期為2019年3月中旬至6月中旬。采收后的子實體置于電熱恒溫鼓風干燥箱中60 ℃烘干；相同種質(zhì)采收期內(nèi)的干菇樣品合并混勻，置于中藥粉碎機粉碎，過30目篩，備用。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

儀器：Agilent1260 高效液相色譜儀（四元泵，自動進樣器，柱溫箱，VWD 檢測器，Agilent 化學(xué)工作站）；萬分之一天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；超聲清洗儀（昆山舒美超聲儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

藥劑：甲醇（色譜純），購自北京百靈威科技有限公司；麥角甾醇標準品（純度≥98%），購自合肥博美生物科技有限責任公司。

1.3 試驗方法

（1）麥角甾醇標準品制備。準確稱取10 mg麥角甾醇標準品，用甲醇溶解后定容至100 mL，配成100 μg/mL麥角甾醇標準品溶液，稀釋至20 μg/mL備用。

表1 種質(zhì)資源來源及收集年份

（2）供試樣品甲醇提取物溶液制備。精確稱量0.1 g食用菌干粉于25 mL容量瓶中，每個樣品3次重復(fù)，加入20 mL甲醇超聲1 h，用甲醇定容至刻度，取上清用0.22 μm有機微孔濾膜過濾后采用HPLC測定麥角甾醇含量[8]。

圖1 標準品的液相圖譜

圖2 樣品的液相圖譜

（3）色譜條件。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（100 mm × 4. 6 mm，3.5 μm）；流動相：100%甲醇溶液；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：282 nm；進樣體積：20 μL[12]。

（4）方法學(xué)考察。為驗證該色譜條件是否適合猴頭菌樣品麥角甾醇含量的測定，進行專屬性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率、線性關(guān)系考察等試驗。

專屬性試驗：取猴頭菇樣品（h73），按“1.3（2）”項制備猴頭菇甲醇提取物，按“1.3（3）”項分析測定。由圖1、圖2可知，在樣品的麥角甾醇色譜峰出峰位置處無干擾，表明猴頭菇甲醇提取物麥角甾醇的檢測方法專屬性良好。

精密度試驗：按“1.3（2）”項制備標準品溶液，按“1.3（3）”項色譜條件連續(xù)進樣6次，考察樣品中麥角甾醇的相對保留時間和相對峰面積。麥角甾醇相對保留時間RSD為0.34%，麥角甾醇峰面積比RSD為0.13%，表明精密度良好。

重復(fù)性試驗：取猴頭菇樣品（h73）6 份，按 “1.3（2）”項制備猴頭菇甲醇提取物，按“1.3（3）”項下色譜條件測定?？疾鞓悠分宣溄晴薮嫉南鄬ΡＡ魰r間和相對峰面積，各共有峰的相對保留時間RSD小于0.51%，峰面積比RSD小于1.12%，表明方法重復(fù)性良好。

表2 加樣回收率試驗

穩(wěn)定性試驗：取猴頭菇樣品（h73），按 “1.3（2）”項制備備猴頭菇甲醇提取物，按“1.3（3）”項下色譜條件在0、2、4、8、12 h測定麥角甾醇的含量。考察不同進樣時間，樣品中麥角甾醇的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果顯示12 h 內(nèi)麥角甾醇的相對保留時間 RSD為 1.18%，峰面積比 RSD 為0.31%，表明猴頭菇甲醇提取物供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收率試驗：取已知含量猴頭菇粉末0.1000 g，共6 份，分別加入麥角甾醇對照品適量，依照“1.3（2）”項方法制備供試品溶液，并按“1.3（3）”項下色譜條件進行測定，計算所得回收率分別為96.97%～101.65%，平均回收率為99.50%，麥角甾醇峰的相對保留時間RSD為0.21%，峰面積比RSD值為1.94%（表2）。表明準確度良好，符合試驗要求。

表3 各種質(zhì)的麥角甾醇含量測定結(jié)果

圖3 各種質(zhì)麥角甾醇含量分布圖

線性關(guān)系考察：取“1.3（2）”項下對照品儲備液，以8 μL、16 μL、24 μL、32 μL、40 μL，按“1.3（3）”項下色譜條件進行分析，以測得的峰面積積分值為縱坐標，對照品進樣量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。=21.706－0.0867，R=1。由結(jié)果可知，麥角甾醇在8～40 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

系統(tǒng)的方法學(xué)考察結(jié)果表明，所采用的麥角甾醇檢測方法精密度高、重復(fù)性好；樣品溶液在12 h內(nèi)，穩(wěn)定性好；在實驗濃度范圍內(nèi)，峰面積與麥角甾醇的濃度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。表明該方法適用于猴頭菌中麥角甾醇的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種質(zhì)麥角甾醇的含量

從測定結(jié)果（表3）可以看出，部分種質(zhì)間的麥角甾醇含量差異明顯。23份猴頭菌種質(zhì)的麥角甾醇含量在2.23±0.02‰～4.39±0.02‰之間，平均值為3.26‰，含量最高的WH1比最低的WH3高96.8%。由含量分布圖（圖3）可知，猴頭菌種質(zhì)麥角甾醇含量以平均值為中心，基本呈正態(tài)分布，大部分種質(zhì)麥角甾醇含量在2.4‰～4.2‰，占比達87.0%；高于4.2‰的種質(zhì)有1個，占比4.3%。

栽培種質(zhì)、雜交菌株、野生種質(zhì)組內(nèi)與組間有明顯差異。栽培種質(zhì)麥角甾醇含量平均值為2.93‰，其中，D的含量較高，為3.53±0.01‰，較平均值高20.5%；A的含量較低，為2.56±0.01‰。雜交菌株h73、h92的麥角甾醇含量分別為3.84±0.03‰和3.17±0.05‰，平均值為3.51‰，h73較平均值高9.4%。野生種質(zhì)麥角甾醇含量平均值為3.28‰，其中，含量最高的WH1為4.39±0.02‰，比平均值高33.8%；WH3含量最低，僅為2.23±0.02‰。

從各組麥角甾醇含量的平均值看，雜交菌株（由高麥角甾醇含量的親本種質(zhì)雜交選育而來，未同批次栽培，故本研究未一起分析）高于野生種質(zhì)，野生種質(zhì)高于常規(guī)栽培種質(zhì)；野生種質(zhì)的含量分布范圍較廣，高麥角甾醇含量的野生種質(zhì)有望定向馴化栽培或作為育種親本使用。

圖4 猴頭菌種質(zhì)的液相圖譜

2.2 種質(zhì)液相圖譜的差異分析

圖4為種質(zhì)A、h73、D的液相圖譜，從中可以看出，采用該測定方法，猴頭菌種質(zhì)麥角甾醇峰的特異性良好、峰形銳、對稱性好，具有較好的分離度。

猴頭菌種質(zhì)甲醇提取物的液相圖譜在出峰位置、峰數(shù)量、峰面積上都呈現(xiàn)出明顯的差異性，表明種質(zhì)的化學(xué)成分存在較大差異?；瘜W(xué)成分為生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，種質(zhì)的生物活性可能也存在較大的差異，液相色譜圖的上述差異可初步反映出種質(zhì)的差異性。

3 討 論

本試驗結(jié)果表明，不同來源的猴頭菌種質(zhì)的麥角甾醇含量不一，含量高低與其來源之間沒有相關(guān)性。栽培和野生種質(zhì)中的麥角甾醇含量均有高有低，相同地域來源的野生種質(zhì)中麥角甾醇含量也各不相同。由此說明，猴頭菌種質(zhì)對麥角甾醇含量的影響較大，這與王金艷等對不同原料來源靈芝孢子粉的研究結(jié)論相似[13]。

麥角甾醇為生物生長過程中的次級代謝產(chǎn)物，其合成和積累不但受遺傳控制，還受培養(yǎng)基質(zhì)、生長發(fā)育階段、環(huán)境條件等因素的影響。為客觀反映不同猴頭菌種質(zhì)的麥角甾醇的含量水平，本文所用研究材料為相同生產(chǎn)管理條件下的全周期子實體樣本，采收標準一致，所測含量為采收期內(nèi)所有子實體中麥角甾醇含量的平均值。

應(yīng)用HPLC法對不同來源猴頭菌種質(zhì)的甲醇提取物進行測定分析，可以準確、靈敏、快速地測定不同種質(zhì)的麥角甾醇含量，并在一定程度上反映子實體中化學(xué)成分的差異，說明該方法適用于猴頭菌種質(zhì)的初步評價，對育種親本選擇和活性物質(zhì)篩選具有指導(dǎo)意義?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，許多植物藥的藥理作用與其所含的次生代謝物質(zhì)有關(guān)，藥物的質(zhì)量取決于次生代謝產(chǎn)物的積累，保持其藥材質(zhì)量及有效性的基礎(chǔ)是植物的次生代謝[14]。麥角甾醇是猴頭菌重要的次生代謝產(chǎn)物，具有良好的生理活性。因此，對不同來源猴頭菌種質(zhì)的麥角甾醇含量進行測定分析，對于開展種質(zhì)評價、定向馴化栽培及育種親本選擇具有重要意義。

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Preliminary application research of ergosterol in germplasm evaluation of

Jiang Jun Song Xiaoya*Liu Kun Lu Xinyan

（Lishui Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Lishui, Zhejiang 323000, China）

The contents of ergosterol in 23germplasm were determined by HPLC. The results showed that ergosterol content in different germplasm was significantly different, ergosterol content was normally distributed at the center of average value, and there were significant differences between germplasm groups in cultivated germplasm, hybridized germplasm and wild germplasm. Analysis of liquid chromatogram showed that there were obvious differences in the number of peak of methanol extract from different germplasm, which could reflect the difference of germplasm to some extent. The germplasm ofcould be evaluated rapidly by HPLC of ergosterol determination.

metabolites; oriented breeding; methanol extraction; ergosterol

S646

B

2095-0934（2021）04-323-05

麗水市高層次人才資助項目2017RC06；麗水市科技計劃項目2014XPZ07

蔣?。?986—），男，助理研究員，從事食藥用菌栽培及其生物活性研究。E-mail：jiangj-1@163.com。

宋小亞，女，高級農(nóng)藝師，主要從事食藥用菌育種研究。E-mail：lssyj323000@163.com。