不同乙肝病毒DNA載量的慢性乙型肝炎患者外周血中Th17/Treg表達(dá)及意義

陳麗龍 向尹 陳小娟 陳俊良 劉楷

慢性乙型肝炎(chronic active hepaititis B，CHB)可經(jīng)血液、母嬰等方式傳播，近年來(lái)CHB發(fā)生率逐年升高[1]。乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)-DNA載量是評(píng)估CHB患者機(jī)體HBV活性的有效指標(biāo)，HBV-DNA載量高說(shuō)明HBV活性較強(qiáng)，傳染性高，且可能會(huì)加重肝細(xì)胞損傷[2]。既往臨床檢測(cè)HBV-DNA載量多采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、競(jìng)爭(zhēng)PCR等技術(shù)，此類(lèi)方式雖可明確HBV-DNA載量情況，但檢測(cè)時(shí)容易受其他因素干擾，且檢測(cè)要求嚴(yán)格，不利于基層醫(yī)院推廣[3]。因此，需尋求可能與CHB患者HBV-DNA載量有關(guān)的血清學(xué)指標(biāo)，輔助評(píng)估患者高HBV-DNA載量風(fēng)險(xiǎn)。研究指出，CHB的發(fā)生、發(fā)展與適應(yīng)性免疫存在密切關(guān)系，機(jī)體免疫功能異常是導(dǎo)致HBV感染慢性化及肝損傷加重的重要原因之一[4]。輔助性T細(xì)胞-17(hlper T cell-17，Th-17)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是維持機(jī)體免疫重要細(xì)胞，其中Th-17可輔助調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答，而Treg可抑制T細(xì)胞效應(yīng)及炎性反應(yīng)[5]。胡萍等[6]研究證實(shí)Th-17、Treg與GHB發(fā)病存在密切聯(lián)系，且可能會(huì)推進(jìn)疾病發(fā)展。鑒于此，本研究通過(guò)探討不同HBV-DNA載量的CHB患者外周血中Th17/Treg表達(dá)及臨床意義，重點(diǎn)分析Th17/Treg表達(dá)與CHB患者HBV-DNA載量的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻納入樂(lè)山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)的217例CHB患者為研究對(duì)象，男113例，女104例；年齡28～47歲，平均年齡(37.75±2.31)歲；體重指數(shù)(body mass index，BMI)17.2～24.7 kg/m2，平均(20.99±1.04)kg/m2；病程6～14個(gè)月，平均(10.33±1.22)個(gè)月。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①CHB符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；②在我院接受相關(guān)治療，且可獲得檢測(cè)標(biāo)本；③免疫系統(tǒng)正常；④精神正常，可配合研究。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲型、丙型等其他類(lèi)型肝炎；②合并肝癌或肝衰竭；③合并心肌炎、腎衰竭等其他臟器疾??；④接受抗病毒治療；⑤哺乳或妊娠期患者。

1.3 方法

1.3.1 HBV-DNA載量檢測(cè)及分組:采取患者入院時(shí)空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血5 ml，離心 3 000 r/10 min，取血清進(jìn)行乙肝DNA提取。180 μl乙肝DNA裂解液+80 μl血清+3 μl內(nèi)標(biāo)，充分震蕩混勻瞬離后，金屬浴加熱，100℃ 10 min，隨后用低溫高速離心機(jī)進(jìn)行離心。取上層清液20UL加入反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的乙肝DNA檢測(cè)試劑盒)。先在93℃環(huán)境下預(yù)變性2 min，然后分別在93℃環(huán)境下反應(yīng)45 s、55℃環(huán)境下反應(yīng)60 s，共10個(gè)循環(huán)、93℃環(huán)境下反應(yīng)30 s、55℃環(huán)境下反應(yīng)45 s，共30個(gè)循環(huán)，最后采用全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(宏石公司，型號(hào)：SLAN- 96P)測(cè)定HBV-DNA載量。根據(jù)HBV-DNA載量檢測(cè)結(jié)果，將CHB患者分為低HBV-DNA載量組(<500 copies/ml)、中HBV-DNA載量組(500～1 000 copies/ml)、高HBV-DNA載量組(>1 000 copies/ml)。

1.3.2 外周血Th17、Treg檢測(cè):取患者入院時(shí)空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血5 ml，用密度梯度離心法提出外周中單個(gè)核細(xì)胞；選取1×106個(gè)細(xì)胞標(biāo)本，依次滴加佛波酯50 ng/ml、離子霉素1 μg/ml，并將標(biāo)本置于1640培養(yǎng)基(含有高爾基蛋白轉(zhuǎn)換抑制劑)中；待刺激5 h后，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行離心、固定、染色處理，然后用流式細(xì)胞儀(BD公司，型號(hào)：BD FACS canto PLUS)測(cè)定外周血Th17、Treg表達(dá)，并計(jì)算Th17/Treg；檢測(cè)試劑及試劑盒均購(gòu)自BD公司。

1.3.3 主要肝纖維化指標(biāo)檢測(cè):取患者入院時(shí)空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血5 ml，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，使用血清用全自動(dòng)生化分析儀(日立LABOSPECT，型號(hào)：008)測(cè)定谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門(mén)冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

2 結(jié)果

2.1 CHB患者HBV-DNA載量情況及相關(guān)基線資料比較 217例CHB患者中低HBV-DNA載量64例，占29.49%(64/217)，中HBV-DNA載量118例，占54.38%(118/217)，高HBV-DNA載量35例，占16.13%(35/217)。3組間性別比、年齡、BMI等基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同HBV-DNA 載量CHB 患者相關(guān)基線資料比較

2.2 不同HBV-DNA載量CHB患者相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 高HBV-DNA載量組ALT、AST、Th17、Treg、Th17/Treg水平均高于中HBV-DNA載量組、低HBV-DNA載量組，且中HBV-DNA載量組ALT、AST、Th17、Treg、Th17/Treg水平高于低HBV-DNA載量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同HBV-DNA 載量CHB 患者相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.3 各主要變量與CHB患者HBV-DNA載量的關(guān)系分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)，CHB患者HBV-DNA載量與Th17/Treg、ALT、AST均呈正相關(guān)(r>0，P<0.05)，Th17/Treg分別與ALT、AST呈正相關(guān)(r>0，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各主要變量與CHB 患者HBV-DNA 載量的關(guān)系分析結(jié)果

3 討論

HBV作為嗜肝DNA病毒，入侵機(jī)體后會(huì)結(jié)合肝細(xì)胞膜，損傷肝細(xì)胞，且可能會(huì)引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，加重肝細(xì)胞損傷[8]。據(jù)報(bào)道，HBV感染引起的CHB，隨著病情的進(jìn)展容易出現(xiàn)肝纖維化，且可能會(huì)增加肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，威脅患者生命安全[9]。因此，尋求HBV-DNA載量相關(guān)血清指標(biāo)，對(duì)輔助評(píng)估CHB患者HBV活性，指導(dǎo)早期干預(yù)尤為重要。

據(jù)報(bào)道，CHB患者HBV-DNA載量與肝纖維化程度存在一定關(guān)系，隨著HBV-DNA載量的增加，肝纖維化程度加重[18]。ALT、AST是評(píng)估肝纖維化程度重要指標(biāo)，二者高表達(dá)提示肝功能損傷嚴(yán)重[19]。本研究通過(guò)初步比較不同HBV-DNA載CHB患者ALT、AST表達(dá)，后經(jīng)Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示，CHB患者HBV-DNA載量與ALT、AST均呈正相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg與ALT、AST也呈正相關(guān)，說(shuō)明隨著Th17/Treg的升高，ALT、AST水平上升，即肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)增加或程度加重。分析原因在于，Th17/Treg失衡可能會(huì)減弱對(duì)HBV復(fù)制抵抗作用，從而導(dǎo)致HBV快速?gòu)?fù)制，加重肝細(xì)胞損傷，繼而增加肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)或加重已經(jīng)發(fā)生肝纖維化患者的干纖維化程度[20]。但本研究并未探討Th17/Treg預(yù)測(cè)CHB患者肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值，研究結(jié)果存有局限，未來(lái)仍需展開(kāi)大樣本量、前瞻性研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，CHB患者HBV-DNA載量與外周血Th17/Treg呈正相關(guān)，且肝纖維化的發(fā)展也可能與Th17/Treg失衡有關(guān)，考慮未來(lái)可檢測(cè)患者入院時(shí)Th17/Treg，輔助評(píng)估患者病情與肝纖維化情況，可能對(duì)遏制疾病進(jìn)展有積極意義。