指紋光譜病原菌快速檢測研究進展與趨勢

廖文龍，劉坤平，胡建平，甘 亞，林慶宇，段憶翔*

1. 成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610106 2. 成都大學四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610106 3.四川大學機械工程學院分析儀器研究中心，四川 成都 610064

引 言

水作為人類健康和經(jīng)濟發(fā)展的必要條件，不僅能維持動植物生命活動，同時也為許多微生物的生長和繁殖提供天然場所，因此水也成了眾多病原微生物的傳播媒介之一。隨著社會經(jīng)濟不斷發(fā)展，水資源污染日益嚴重，飲用水污染已成為全球關(guān)注的熱點話題，由水源性病原菌引起的疾病已經(jīng)成為最常見的健康風險之一。除了飲用水，食品安全也是關(guān)乎人民健康與國計生民的重大課題，由于細菌廣泛存在于水、 空氣、 土壤等環(huán)境中，其隱蔽性使之容易成為食品加工、 流通、 及供應(yīng)等環(huán)節(jié)潛在的生物安全隱患，一旦食品發(fā)生病原菌污染則可能引發(fā)難以預判的公共衛(wèi)生事件。此外，隨著經(jīng)濟全球化進程的加快，病原菌跨國傳播的風險也與日俱增。因此加強病原菌快速檢測，保障飲用水和食品安全，應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件，已成為各國政府及相關(guān)組織所面臨的迫切任務(wù)。

經(jīng)過多年的實踐和探索，我國已建立了病原菌檢測基本體系，現(xiàn)行病原菌檢測標準大多是基于形態(tài)、 生理、 生化水平的經(jīng)典方法，以及逐步成熟的分子生物學方法。其中，經(jīng)典方法雖具權(quán)威，但操作繁瑣，檢測周期長(通常需要3～5 d)，面對高時效性和高精密度的市場需求鞭長莫及。分子生物學方法將鑒定水平提升至核酸分子，雖具快速、 特異、 高靈敏的優(yōu)點，但是檢測條件較為苛刻，需要消耗昂貴的生化試劑進行DNA提取、 PCR擴增等復雜前處理，同時容易因核酸污染和死菌造成假陽性結(jié)果[1]。因此開發(fā)操作簡單、 低成本的病原菌快檢技術(shù)對于保障飲用水和食品安全意義非凡。

激光光譜技術(shù)具有非接觸式測量、 高靈活性和高測量速度等優(yōu)點，在過去幾十年中得到了快速發(fā)展，誕生了包括激光誘導熒光(laser-induced fluorescence, LIF)、 可調(diào)諧激光吸收光譜(tunable diode laser absorption spectroscopy, TDLAS)、 激光拉曼光譜(laser Raman spectroscopy, LRS)、 激光誘導擊穿光譜(laser-induced breakdown spectroscopy, LIBS)等多種光譜分析技術(shù)，并成功地應(yīng)用于生物醫(yī)學、 環(huán)境保護、 食品安全、 能源化工等領(lǐng)域[2-6]。近年來，隨著固體激光器、 電光探測器和信號處理等領(lǐng)域的不斷發(fā)展，能夠快速獲取目標物分子和原子指紋信息的LRS和LIBS技術(shù)在病原菌快檢領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注，為了進一步探索這些指紋光譜技術(shù)在病原菌檢測中的應(yīng)用潛力，對LRS和LIBS在病原菌檢測中的優(yōu)勢和局限性進行了綜述，并對其在病原菌快速檢測領(lǐng)域的發(fā)展趨勢進行了展望。

1 拉曼光譜

拉曼光譜是基于入射光子與目標分子間發(fā)生非彈性碰撞后，光子得到或失去部分能量而散射出不同波長的光，通過光譜儀記錄不同波長的散射光，再與標準物質(zhì)或數(shù)據(jù)庫的光譜信息進行對比，可以得到分子化學鍵指紋信息(如圖1所示)。通過構(gòu)建目標分子的指紋圖庫，可實現(xiàn)相應(yīng)物質(zhì)的快速識別與定性檢測。盡管早在1928年印度物理學家Raman就已經(jīng)確認了拉曼散射過程的現(xiàn)象和原理[7]，但由于拉曼散射效應(yīng)太弱(散射光強度約為入射光強的10-8)，早期以汞燈為光源的拉曼光譜采集往往需要長達數(shù)小時甚至數(shù)十小時的積分時間，因此在相當長的一段時期內(nèi)拉曼光譜并沒有得到廣泛應(yīng)用。直到1960年紅寶石激光器出現(xiàn)后，使用激光作為光源的LRS才使拉曼光譜進入了一個全新的時期，由于激光的單色性好，方向性強，功率密度高，用它作為激發(fā)光源大大提高了激發(fā)效率，從而成為拉曼光譜的理想光源。隨著探測技術(shù)的不斷改進和對被測樣品要求的降低，目前LRS在物理、 化學、 生物、 醫(yī)藥、 環(huán)境、 材料工業(yè)等各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，越來越受研究者的重視。

圖1 拉曼光譜獲取目標物分子指紋光譜信息Fig.1 Fingerprint spectral information of target molecularobtained by Raman spectroscopy

由于LRS可以提供豐富的指紋光譜，具有非侵入式、 無損分析、 制樣簡單、 樣品消耗少、 重現(xiàn)性高以及水相容性等優(yōu)點，而成為病原菌檢測的潛在工具[8]。然而光譜信號弱靈敏度低的固有缺陷使得常規(guī)拉曼在生物檢測中的應(yīng)用困難重重，同時拉曼光譜對生物體中復雜的生物分子沒有選擇性，往往產(chǎn)生大量重疊光譜信號導致不同細菌細胞中特殊成分的光譜信號并不突出，此外LRS往往伴隨高強度的熒光背景[9]，因此對于細菌檢測來說并不是一種靈敏的檢測技術(shù)。為了降低生物體熒光背景提高拉曼信號的信噪比，20世紀七八十年代研究人員嘗試采用紫外共振拉曼光譜(ultraviolet resonance Raman spectroscopy, UVRRS)進行生物分析[10-11]，即利用波長接近或等于生物體待測分子中電子的吸收波長的激光作為激發(fā)源，比如利用波長在218～242 nm處的激發(fā)光與核酸堿基發(fā)生共振，波長在244～257 nm處的激光與含苯環(huán)的氨基酸發(fā)生共振[12]，增加待測物電子躍遷幾率的同時增加待測分子的散射截面，從而達到降低熒光背景增強待測物拉曼信號的目的。然而大多數(shù)細菌都含有相同的核酸堿基以及含苯環(huán)的氨基酸，因此共振Raman光譜具有較高相似性。盡管Nelson等[13]的研究表明由于不同種類的細菌細胞中生物分子的豐度存在差異，可以通過UVRSR的絕對強度和峰值強度比值的差異進行鑒別，但由于UVRRS對細菌其余化學物質(zhì)的響應(yīng)微弱導致選擇性不高，同時UVRRS使用的紫外波段激光對細菌細胞和生物分子具有嚴重的光化學損傷作用，因此其實用性大打折扣。

盡管UVRRS在細菌檢測中的應(yīng)用未能得到較明顯的發(fā)展，但幸運的是1974年Fleischmann等發(fā)現(xiàn)粗糙電極能使吡啶拉曼信號增強的現(xiàn)象[14]，揭開了表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)研究的序幕。表面增強拉曼光譜(SERS)是在常規(guī)Raman光譜中引入貴金屬(如Au，Ag，Cu 等)納米粒子作為活性基底，利用其局域表面等離激元共振(LSPR)效應(yīng)，將入射光場能量局域到納米粒子表面，增強周圍局部電場形成“熱點”，當待測物靠近“熱點”后通過電磁和化學增強機制實現(xiàn)Raman信號大幅提升，從而能夠快速獲取目標物的指紋光譜信息[15]。SERS除具有常規(guī)Raman光譜的特點外，還表現(xiàn)出熒光淬滅的優(yōu)點，這些優(yōu)勢使得SERS在生命分析、 環(huán)境檢測、 食品安全等眾多領(lǐng)域廣受關(guān)注。

2004年Jarvis等將SERS技術(shù)用于細菌鑒別[16]，與普通Raman光譜實驗相比，SERS提供的高靈敏度可以使采集時間從幾分鐘縮短至幾秒鐘，因此成為細菌檢測的理想方法。由于SERS信號受“熱點”效應(yīng)影響顯著，通常只有當貴金屬納米粒子間隙小于10 nm 時才會產(chǎn)生顯著的“熱點”[17]，因此在采用SERS進行細菌檢測時，貴金屬納米粒子(通常為銀納米粒子(AgNPs)或金納米粒子(AuNPs))與細菌細胞間的靠近程度十分關(guān)鍵。為了使納米粒子與細菌細胞緊密接觸，研究者通常將細菌與銀或金溶膠混合后再通過無機鹽誘導聚集使納米粒子與細菌細胞緊密結(jié)合[18]，然而這種方法無法保證納米粒子在細菌細胞上均勻分布，因此SERS光譜的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較差。研究顯示在細菌細胞原位合成Ag NPs，能夠在一定程度上確保納米粒子與細菌細胞接觸更加均勻與緊密，從而提高Raman光譜的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性[19]，然而原位合成需要將細菌浸入高濃度的硝酸銀或還原劑溶液中，容易造成細菌細胞破損而影響檢測結(jié)果的準確性[20]。隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員通過制備有序納米陣列，或是具有特征拉曼信號的SERS 標簽，開發(fā)了一系列基于標記和無標記SERS方法進行病原菌檢測[21-23]，然而這些陣列基底或SERS標簽制備過程太過復雜，成本較高且難以大規(guī)模制備。因此到目前為止，受金屬納米粒子的材質(zhì)、 形貌、 大小等自身屬性，以及與待測物距離等多種因素的影響，重現(xiàn)性仍然是SERS 實際應(yīng)用的一大瓶頸[24]。

近年來，研究人員不斷探索創(chuàng)新共克難關(guān)，多種改進型SERS 技術(shù)為解決重現(xiàn)性問題帶來了新的曙光，如殼層隔絕納米粒子增強拉曼光譜(shell-isolated-nanoparticle enhanced Raman spectroscopy, SHINERS)[25-26]，動態(tài)表面增強拉曼光譜(dynamic-SERS, D-SERS)[27-28]，以及液相界面拉曼分析技術(shù)等[29-30]，進一步推動了SERS在食品安全、 環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的應(yīng)用。其中，D-SERS在樣品從濕態(tài)到干態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中進行光譜采集[31]，利用濕態(tài)樣品液體揮發(fā)時的毛細力、 靜電力或化學螯合作用等，驅(qū)動納米結(jié)構(gòu)相互靠近并聚集，使樣品經(jīng)歷一個“無熱點—最佳熱點—熱點消失”的動態(tài)過程(如圖2所示)。相對于干態(tài)或濕態(tài)SERS而言，D-SERS由于能夠形成高效均勻的“熱點”，因此具有更高的靈敏度和重現(xiàn)性。在細菌SERS檢測中，濕態(tài)樣品雖然可以在一定程度保護細菌細胞免受激光損傷，但是卻難以保證細菌與納米結(jié)構(gòu)有效接觸，因此已報道的細菌SERS檢測以干態(tài)居多，而干態(tài)下細菌受納米結(jié)構(gòu)與激光雙重作用，難以避免光熱降解等損傷，同時干態(tài)SERS“熱點”難以控制，因此干態(tài)SERS檢測可靠性無法保證。D-SERS對于細菌檢測來說正好結(jié)合了濕態(tài)和干態(tài)SERS的優(yōu)點，在樣品干濕轉(zhuǎn)換過程中完成檢測，既可以避免細菌受到激光損傷，又能夠保證納米粒子與細菌細胞結(jié)合緊密形成高效“熱點”，為提供可靠的SERS分析奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖2 D-SERS熱點形成過程示意圖Fig.2 A schematic diagram of D-SERShot-spot formation process

目前，D-SERS在細菌檢測領(lǐng)域的研究報道尚處于初始探索階段，檢測對象主要集中在基質(zhì)較為簡單的水樣或?qū)嶒炇夷M樣品。例如Zhou等[32]針對飲用水中病原菌的快速檢測，在含細菌的水中原位合成Ag NPs，利用D-SERS結(jié)合層次聚類分析鑒別了飲用水中大腸桿菌和表皮葡萄球菌； 第二軍醫(yī)大學李皓博士[33]針對臨床真菌感染的診斷治療難題，利用D-SERS對耐藥白色念珠菌進行了快速診斷和藥物篩選研究。這些研究進一步證明D-SERS相對傳統(tǒng)SERS具有更高靈敏度和重現(xiàn)性。但是在面臨實際樣品檢測時還需考慮諸多因素，實際樣品基質(zhì)成分比較復雜，而且細菌種類多濃度低，因此利用D-SERS進行檢測時需要對目標菌進行高效分離富集，以降低基質(zhì)和共存菌干擾，同時D-SERS是一個動態(tài)變化過程，如何保持細菌在整個檢測過程中的穩(wěn)定性也是關(guān)鍵，由此可見開發(fā)基于D-SERS的病原菌快速檢測新方法還需進行系統(tǒng)而深入的研究。

2 激光誘導擊穿光譜

1963年Ramsden等直接采用激光器為激發(fā)源進行原子光譜分析[34-35]，標志著激光誘導擊穿光譜(laser-induced breakdown spectroscopy, LIBS)技術(shù)的正式誕生。LIBS技術(shù)是利用脈沖激光聚焦后作用在待測樣品表面，通過熱效應(yīng)激發(fā)微量待測物產(chǎn)生等離子體，最后利用光譜儀對等離子體的發(fā)射譜線進行收集，再與標準數(shù)據(jù)庫中元素的特征譜線進行對比分析，實現(xiàn)對待測物元素檢測的一種原子發(fā)射光譜技術(shù)(如圖3所示)。隨著近十多年高分辨寬光譜范圍的中階梯光柵光譜儀，高靈敏電荷耦合器件(CCD和ICCD)的快速發(fā)展，以及輕型、 廉價、 高功率激光器的出現(xiàn)，LIBS技術(shù)成為分析化學領(lǐng)域一顆冉冉升起的明星[36]。由于LIBS采用脈沖激光作用激發(fā)源，通過合理的光路設(shè)計或者使用光纖可以實現(xiàn)遠距離聚焦，因此LIBS具有遠程和非接觸檢測的能力，從而在生化危險品檢測領(lǐng)域受到了眾多研究者的關(guān)注[37-41]?？偹苤す庹T導產(chǎn)生的等離子體特征強烈依賴于激光參數(shù)，如脈沖寬度，脈沖能量，脈沖重復頻率，激光輻照度等，其中脈沖寬度和脈沖能量是等離子體形成的主要影響因素，根據(jù)LIBS裝置所用的激光脈沖寬度，可將LIBS分為納秒LIBS(nanosecond-LIBS，ns-LIBS)、 皮秒LIBS(picosecond-LIBS, ps-LIBS)和飛秒LIBS(femtosecond-LIBS，fs-LIBS)，其中ns-LIBS和fs-LIBS在細菌檢測中的研究報道相對較多。

圖3 LIBS裝置示意圖Fig.3 Schematic diagram of LIBS set-up

自2001年“911”恐怖襲擊事件以及緊接著的“炭疽郵件事件”發(fā)生后，世界各國都開始投入巨大物力財力研究生化危險品現(xiàn)場快速檢測裝備以應(yīng)對隨時可能發(fā)生的生化恐怖襲擊，LIBS技術(shù)由于其獨特的優(yōu)勢成為生化危險品檢測領(lǐng)域潛在工具[42-43]。納秒激光器具有技術(shù)成熟、 性能穩(wěn)定、 操作簡單、 使用成本低等優(yōu)勢，國外研究人員率先開始基于納秒激光器的ns-LIBS技術(shù)在細菌檢測中的應(yīng)用探索。2003年Morel等[44]將六種細菌樣品和兩種花粉樣品干燥后壓片，通過ns-LIBS獲取了高信噪比的光譜信號，然后根據(jù)細菌細胞的礦物元素(如鈣、 鎂、 鉀、 鈉、 等)和有機元素(碳、 氫、 氧、 氮、 磷等)的發(fā)射光譜提出以累計強度比作為依據(jù)，通過時間分辨ns-LIBS進行生物危險品的鑒別。同年，Samuels等[45]利用ns-LIBS檢測了細菌孢子、 霉菌、 花粉和蛋白質(zhì)，他們采用孔徑為0.45 μm的銀膜過濾器對所有生物樣品進行沉積后采集了LIBS光譜，通過主成分分析法對單個激光脈沖的LIBS光譜進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些光譜數(shù)據(jù)包含足夠的信息來區(qū)分不同的生物材料。2004年Kim等采用ns-LIBS檢測了五種非致病微生物，光譜信號清楚地識別出了細菌細胞中的主要無機成分(包括鈣、 鎂、 鉀、 鈉、 鐵、 磷)，最后通過兩條鈣譜線強度比和兩條磷譜線強度比建立細菌的指紋光譜完成鑒別[46]。這些早期研究結(jié)果表明，根據(jù)ns-LIBS獲取細菌細胞無機元素或金屬元素構(gòu)建獨特的元素指紋光譜庫識別細菌確實是可行的。

飛秒激光器由于脈寬極短，小于物質(zhì)的熱耦合時間(皮秒)，因此與物質(zhì)作用時主要產(chǎn)生多光子電離而非熱分解，同時極短的脈沖寬度不會進一步加熱等離子體，從而避免等離子體溫度過高而帶來的嚴重連續(xù)輻射背景，因此相對ns-LIBS而言，fs-LIBS具有更高的信噪比和信背比[47]。此外，fs-LIBS由于激光誘導的等離子體的溫度較低，幾乎可以忽略其對環(huán)境空氣中氮氧的激發(fā)，而ns-LIBS由于脈沖寬度較大，通常會持續(xù)加熱誘導產(chǎn)生等離子得到高溫等離子體，高溫等離子體進一步激發(fā)剝蝕點附近的空氣而發(fā)射強烈的氮和氧原子光譜，從而干擾有機或生物材料氮氧元素的發(fā)射譜線[48-49]。因此，采用fs-LIBS檢測細菌時不僅可以得到無機元素的光譜信息，還可以有效地獲得CN和C2等重組雙原子分子的光譜信號，從而獲得更全面的元素信息[50]。Baudelet等[50]采用fs-LIBS分析了五種不同細菌，得到六種微量礦物元素Na，Mg，P，K，Ca和Fe發(fā)射譜線，這些發(fā)射譜線的強度與其在細菌細胞內(nèi)的濃度正相關(guān)，因此作者直接根據(jù)這些元素的光譜強度實現(xiàn)了五種細菌的區(qū)分。

早期探索性研究表明ns-LIBS和fs-LIBS均可有效獲取細菌元素指紋信息，直接通過化學譜線強度信息或者結(jié)合化學計量學算法可以實現(xiàn)細菌分類，然而開發(fā)基于LIBS的病原菌快檢技術(shù)仍面臨諸多問題。首先，由于細菌的特殊性(體積小、 質(zhì)量小)，利用LIBS采集光譜信號時，脈沖激光會不可避免地燒蝕細菌負載基底，當基底含有與細菌相同的元素時則會干擾檢測結(jié)果[51]。雖然通過培養(yǎng)大量細菌，凍干壓片后進行LIBS測定可以避免基底信號的干擾，但是培養(yǎng)并凍干大量致病菌不僅耗時而且存在一定安全隱患。固體培養(yǎng)基也常作為細菌負載基底用于LIBS檢測[52-53]，然而培養(yǎng)基往往含有大量與細菌相同的元素，且不同廠家生產(chǎn)的培養(yǎng)基在化學成分上也存在差異，因此使用培養(yǎng)基作為細菌負載基底進行LIBS分析反而降低了檢測結(jié)果的準確度。其次，采用LIBS進行細菌檢測需要采集大量數(shù)據(jù)獲得具有統(tǒng)計學意義的分類結(jié)果，同時要求待測細菌濃度較高，而實際檢測中細菌濃度通常較低難以滿足該技術(shù)的測試要求。

鑒于此，Rehse課題組設(shè)計了一種離心過濾器[54-55]，通過離心可以對低濃度細菌進行高效濃縮，使LIBS分析檢測限(LOD)接近103CFU。當前LIBS在細菌快速檢測方面主要用于細菌的分類和鑒定，在細菌定量分析研究方面缺乏足夠投入和關(guān)注。最近，我們課題組利用元素標記LIBS(elemental-tags LIBS，ETLIBS)開發(fā)了一種針對鼠傷寒沙門氏桿菌的定量檢測方法，通過制備適配體修飾的銅納米粒子作為元素標簽，結(jié)合LIBS快速掃描檢測限可低至61 CFU·mL-1[56]，為LIBS快速高靈敏定量檢測細菌提供新策略。為了將LIBS技術(shù)轉(zhuǎn)化為一種實用、 可部署的檢測或診斷工具，在過去十多年里研究人員進行了大量的研究，探索了LIBS硬件設(shè)備、 細菌培養(yǎng)條件、 以及數(shù)據(jù)處理方法等對檢測結(jié)果的影響[50, 57-59]，不斷發(fā)掘LIBS在病原菌檢測中的應(yīng)用潛力，并逐步實現(xiàn)了從細菌元素指紋光譜的獲取到死菌與活菌的區(qū)分，從純菌株鑒別到有干擾物共存條件下的準確鑒別，從細菌的分類到定量檢測等突破[41]。

3 總結(jié)與展望

激光器的誕生為光譜分析領(lǐng)域帶來革命性變化，一方面高亮度的激光輻射提高了檢測靈敏度使痕量測定成為可能，另一方面激光波長的可調(diào)諧性對原子或分子躍遷具有更高的選擇性，只要選擇適宜的波段范圍和方法，就能夠獲得很高的靈敏度和選擇性。隨著現(xiàn)代科技的高速發(fā)展，相信小型化、 集成化以及低能耗的LIBS和Raman光譜分析設(shè)備，將在病原菌現(xiàn)場快速檢測以及原位在線檢測領(lǐng)域扮演重要角色。與此同時，多種檢測技術(shù)相互結(jié)合取長補短，有望進一步提高檢測結(jié)果的準確性和靈敏度，如Prochazka等[60]利用LIBS和Raman光譜分別獲取細菌的分子和元素指紋光譜，并對所得數(shù)據(jù)進行融合后利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行分類，結(jié)果表明數(shù)據(jù)融合后分類準確率由融合前的45%～50%提高到100%。基于LIBS和Raman光譜在儀器結(jié)構(gòu)和光路設(shè)計方面的相似性，我們課題組利用波長為1 064 nm的脈沖激光器和波長為532 nm的連續(xù)激光器，搭建了一套可以檢測樣品同一位點元素和分子光譜信息的LIBS-Raman聯(lián)用裝置，并以單晶硅片和銀包金納米粒子(Au@Ag NPs)修飾的硅納米線陣列作為細菌樣品負載基底，利用該裝置開發(fā)了基于LIBS和SERS相結(jié)合的細菌快速定量和定性分析新策略[61-62]。Dong課題組[63]將LIBS與膠體金免疫層析技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)目標菌在免疫金試紙條檢測線(T線)上富集顯色進行定性分析，然后通過LIBS獲取T線上富集的金屬納米粒子的發(fā)射光譜信號，間接實現(xiàn)目標菌的定量檢測。這些聯(lián)用技術(shù)或方法展現(xiàn)了LIBS和Raman光譜在病原菌檢測領(lǐng)域的靈活性和多樣性，進一步拓展了基于激光指紋光譜技術(shù)的應(yīng)用前景，可以預見隨著分析儀器的快速發(fā)展，能夠提供待測樣品多維互補信息的聯(lián)用技術(shù)或裝備將成為我們快速探索物質(zhì)本質(zhì)的重要工具和手段。