接種叢枝菌根真菌對木香無機元素吸收的影響

魏祖晨，趙順鑫，李卓蔚，周 濃，黃小蘭，郭冬琴，趙晶晶

(重慶三峽學院 生物與食品工程學院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120)

木香(AucklandialappaDecne)是菊科植物云木香和川木香的通稱，又名蜜香、廣木香、青木香。常以其根入藥，具有健胃消脹以及行氣止痛之功效，可治療胸腹脹痛、停食積聚、嘔吐瀉痢等病癥[1]。木香有效成分集中表現(xiàn)在其揮發(fā)油上，以最為豐富的木香烴內酯和去氫木香內酯作為主要活性成分，具有良好的消炎和抗腫瘤功效[2]。據(jù)考證，歷史上木香來源復雜，其產(chǎn)地幾經(jīng)變遷，現(xiàn)主要集中于云貴川地區(qū)[3-4]。我國野生木香資源曾經(jīng)十分豐富，但近些年由于木香激增的市場價值與市場需求，人們開始對木香進行瘋狂的采挖砍伐，導致其野生資源幾近枯竭。因此，尋找合適的木香人工育苗方法顯得尤為重要，利用現(xiàn)代技術提高木香產(chǎn)量與品質亦成為了當前研究的重點[5-6]。

叢枝菌根(AM)真菌能與80%以上的高等植物根系形成良好的共生，改善宿主植物的礦質營養(yǎng)[7]，提高其適應性和抗逆能力[8]。有研究表明，接種AM真菌能增加西瓜土壤的肥力[9]。尤其在非生物脅迫作用情況下，AM真菌能使共生植株的生長發(fā)育得到明顯改善[10]。另有學者研究發(fā)現(xiàn)，木香接種AM真菌能夠促進其生長發(fā)育和生物活性成分的累積[11]?？梢?，AM真菌在維護植物健康，增強其抗病能力方面具有重要作用[12-13]。因此，AM真菌在中藥材栽培方面具有廣泛的應用前景。

近年來，不斷有學者將AM真菌運用于經(jīng)濟植物的共生栽培中，如AM真菌能有效降低人工栽培滇重樓中重金屬元素的含量[14]，并且能有效修復Cd和Pb復合污染的土壤，提高植物對重金屬的耐受能力[15]。因此將AM真菌接種于木香，培育后測定其無機元素含量，探究AM真菌是否能在木香中發(fā)揮同樣的作用，對木香今后的栽培地選擇及品質優(yōu)化提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

ME204E型萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；Speedwave Xpert型微波消解系統(tǒng)(北京利曼科技有限公司)；AFS-9750原子熒光光度計(北京海光儀器有限公司)；TAS-990AFG型原子吸收分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 試劑

單元素標準溶液(1 000 μg/mL)：Cu(批號GSB 04-1725-2004)、Hg(批號GSB 04-1729-2004)、Mg(批號GSB 04-1735-2004)、Na(批號GSB 04-1738-2004)、Ca(批號GSB 04-1720-2004)、As(批號GSB 04-1714-2004)、Cr(批號GSB 04-1723-2004)、Zn(批號GSB 04-1761-2004)、Cd(批號GSB 04-1721-2004)、Mn(批號GSB 04-1736-2004)、P(批號GSB 04-1741-2004a)、K(批號GSB 04-1733-2004)、Pb(批號GSB 04-1742-2004)、Ni(批號GSB 04-1740-2004)、Cr(批號GSB 04-1723-2004a)均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸、高氯酸、氫氟酸均為優(yōu)級純(國藥集團化學試劑有限公司)；水為去離子水。木香對照藥材(批號為120921-201309)購買于中國食品藥品檢定研究院，編為DZ組，見表1。

1.3 AM真菌

通過美利堅共和國國際叢枝菌根真菌種質資源保藏中心(INVAM)購得相應的AM真菌純凈菌劑，并經(jīng)重慶三峽學院生物與食品工程學院郭冬琴副教授進行鑒定，作為本研究供試菌株，詳細見表1。

表1 不同處理組及其接種AM真菌Table 1 Different treatment groups and inoculated AM fungi

1.4 木香種子

2012年10月，課題組在位于重慶市開縣河堰鎮(zhèn)的木香種植基地，選取株高、株型一致的健壯植株，采其成熟、新鮮的種子，并經(jīng)重慶三峽學院周濃教授鑒定為菊科植物木香A.lappa。

1.5 接種處理及栽培管理

栽培容器為15 cm×18 cm的棕色塑料花盆(用酒精擦拭3遍后用)，栽培介質為園土和河沙按3∶1體積比混合制成，并過10目(2 mm)篩，在121℃滅菌2 h，每盆裝土量為16.0 kg。試驗地點為重慶市萬州區(qū)鐵峰山國家森林公園室內，試驗時間為2013年2月～2014年12月。

試驗共設置25個處理組，設24組AM真菌處理組(育苗時單一接種AM真菌)和CK(對照)組(幼苗生長過程中不接種AM真菌)，每處理組10個重復，每盆播種木香種子20粒，出苗后間苗5株。AM真菌菌土均勻施于木香種子(10%次氯酸鈉溶液消毒15 min，清水沖洗干凈)的表土下，接種劑量為每盆300個孢子(接菌體帶有孢子、菌絲及侵染后根系的栽培基質)，同時播種紫云英(10%次氯酸鈉溶液消毒15 min，清水沖洗干凈)混合培養(yǎng)，待木香幼苗出土后除去紫云英植株。CK組不接種AM真菌，其他處理與處理組一致。將盆栽放置于室溫(自然光照)下，定期觀察與分析，按照木香的常規(guī)養(yǎng)護方法管理，每周澆1次Hoagland營養(yǎng)液。

1.6 樣品采集與指標測定

1.6.1 樣品

于2014年7月選擇完整無損、長勢優(yōu)良并健康的木香根部洗凈、烘干，按分析要求分別粉碎過篩(40目)，備用。

1.6.2 元素測定

木香樣品中的N含量采用凱氏蒸餾法進行測定[16]，P含量采用釩鉬黃比色法進行測定[17]。K、Ca、Mg、Na、Mn、Zn、Cu、Ni、Cd、Cr和Pb含量采用原子吸收分光光度法進行測定[18]，即稱取木香0.200 0 g于消解管中，加入8 mL硝酸，在微波消解儀上進行消解(190℃，10 min)，消解完全后，冷卻轉移至25 mL容量瓶中，用1%硝酸溶液定容至刻度，空白樣品同處理。Hg和As含量采用原子熒光分光光度計進行測定[19]，即稱取木香樣品0.200 0 g于消解管中，在微波消解儀上進行消解，消解完全后，Hg測定時，無需揮發(fā)掉酸，直接轉移定容至25 mL測定；As測定時，加入5%硫脲、5%抗壞血酸和50%鹽酸各2.5 mL，定容至25 mL后反應30 min?？瞻讟悠吠幚?。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013進行數(shù)據(jù)的錄入、整理，用 SPSS 19.0做方差分析，用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同AM真菌處理對木香大量元素含量的影響

24種AM真菌處理對木香大量元素的影響結果如表2所示，不同AM真菌處理對木香大量元素(N、P、K、Ca、Mg)含量的影響存在顯著差異(P<0.05)。其中，24種真菌處理后的木香與CK組相比，60%以上的AM真菌處理組中N元素含量呈現(xiàn)升高趨勢，其中Svi處理組含量最高為55.312 mg/g，是CK組的2倍以上，表明外源接種Svi處理組的AM真菌有利于木香根部對N元素的吸收；同時Gr、Sc、Ds、Sp、Afo、Asc、Rc、Rf、Ri這9個處理組N含量有所下降，最低的Rc處理組含量為13.271 mg/g，僅為CK組的50%左右，下降幅度較大。相反，60%的處理組中P元素含量出現(xiàn)下降現(xiàn)象，Po處理組含量為0.624 mg/g，與CK組相比，下降了80%左右；而Svi處理組對P元素的影響同N，提高到7.235 mg/g。同時，僅有25%的AM真菌處理組中K元素含量有所下降，其余處理組均呈上升趨勢。Ds處理組含量最高，是CK組的3倍以上，達到27.009 mg/g，表明Ds處理組的AM真菌有利于木香根部對K元素的吸收。相反，80%的AM真菌處理組中，Ca元素含量都普遍呈下降趨勢。其中最低的Ga處理組含量為0.070 mg/g，不足CK組的百分之一。同樣，24個木香處理組中，80%以上的處理組中Mg元素含量呈現(xiàn)下降，最高Al處理組與最低Fm處理組含量相差達10 mg/g以上，這說明僅有少數(shù)AM真菌可以促進木香根部對Mg元素的吸收。從大量元素含量增長率來看，外源接種Gg、Rc和Al三個AM真菌可以顯著促進木香根系對大量元素的吸收，而Svi、Asp和Pb處理的調控效果次之，其余處理對大量元素吸收的促進效果較差。

表2 不同AM真菌處理后木香根部大量元素含量Table 2 Contents of macronutrients in roots of A. lappa treated with different AM fungi (mg/g)

2.2 不同AM真菌處理對木香微量元素含量的影響

24種AM真菌處理對木香微量元素的影響結果如表3所示，不同AM真菌處理對木香微量元素(Mn、Zn、Cr、Na、Ni)含量的影響存在顯著差異(P<0.05)。其中，24種AM真菌處理后的木香與CK組相比，75%的AM真菌處理組中Mn含量呈現(xiàn)下降趨勢，含量最高的Po處理組與最低的Fm處理組相差達50倍以上，這說明AM真菌處理后木香對Mn元素的吸收存在極顯著差異。同時60%以上的AM真菌處理組中Zn元素含量也出現(xiàn)了下降趨勢，但含量最高的Po處理組為0.527 mg/g，僅為CK的2倍，可見AM真菌處理前后，木香對Zn的吸收差異不大。相反，50%以上的AM真菌處理組中Cr元素含量都呈上升趨勢，其中Gd處理組含量最高為0.110 mg/kg，表明Gd處理組AM真菌處理有利于Cr的吸收。然而，超過75%的處理組中Na元素含量出現(xiàn)了下降趨勢，但Svi處理組含量最高為10.983 mg/g，是最低組的10倍，CK組的2倍，這說明AM真菌處理對木香吸收Na能力影響顯著。同時75%的處理組中Ni元素含量出現(xiàn)下降趨勢，但最高的Sp處理組含量達到54.492 mg/kg，遠大于最低的Fm組和CK組，這說明AM真菌處理對木香吸收Ni元素能力影響極顯著。從微量元素含量增長率來看，外源接種Gd、Ec、Po和Al四個AM真菌可以顯著促進木香根系對微量元素的吸收，而Ga、Afo和Rc處理的調控效果次之，其余處理對微量元素吸收的促進效果較差。

表3 不同AM真菌處理后木香根部微量元素含量Table 3 Contents of trace elements in roots of A. lappa treated by different AM fungi (mg/kg)

2.3 不同AM真菌處理對木香有害元素含量的影響

24種AM真菌處理對木香有害元素的影響結果如表4所示，共檢測了Cd、Cu、Hg、Pb、As五種有害元素。經(jīng)處理分析，不同AM真菌處理對木香有害元素含量的影響存在顯著差異(P<0.05)。其中，Hg、Cd檢出率較低。參照WM/T2-2004《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》，即Pb≤ 5.0 mg/kg，Cd≤ 0.3 mg/kg，As≤ 2.0 mg/kg，Hg≤ 0.2 mg/kg，Cu≤ 20 mg/kg。檢出的五種有害元素中，Ga、Svi、Po、DZ處理組中As出現(xiàn)超標，其余四種元素大大低于此標準。與CK處理組相比，大部分處理組有害元素含量呈現(xiàn)下降趨勢，AM真菌處理能有效降低木香根部對有害元素的吸收。其中，Gm、Sc和Sp處理組的調控效果最佳，Ga、Gg、Sdi、Sd、Fm、Asc和Pb處理組的效果次之。

表4 不同AM真菌處理后木香根部有害元素含量Table 4 Contents of harmful elements in roots of A. lappa treated with different AM fungi (mg/kg)

2.4 不同AM真菌處理木香元素間相關性分析

木香常以其根入藥，本文測定樣品為不同AM真菌處理組的木香根。利用SPSS對24組不同AM真菌處理木香根中的15種元素進行相關性分析，結果如表5所示，不同AM真菌處理后的木香部分元素間存在一定相關性。其中，有17對元素呈極顯著正相關(P<0.01)，包括N-P、P-Hg、K-Mg，Ca與Mn、Pb、Cu、Zn，Na與Cr、As，Mn與Pb、Cu、Zn，Cr與As等，這說明木香部分元素間存在相互促進累積的作用。

表5 不同AM真菌處理后木香根部元素相關性分析Table 5 Correlation analysis of elements in roots of A. lappa treated with different AM fungi

3 討 論

木香作為一種中藥材，因其具有健胃消脹以及行氣止痛之功效而受到了廣泛的關注。AM真菌作為陸地生態(tài)系統(tǒng)廣譜有益的微生物，可與80%以上的高等植物根系形成互惠的共生體[20]，因其能促進宿主的生長發(fā)育、增強其抗逆性，在中藥材的培育中前景廣闊。近年來，科研工作者對木香與AM真菌接種的研究也逐步深入，陽文武等[6]通過測定云木香幼苗的根系菌根侵染率、根生物量、生理生化特性及萜類成分積累等指標，發(fā)現(xiàn)美麗盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora，Sca)、易誤巨孢囊霉(Gigasporadecipiens，Gd)、沙荒球囊霉(Septoglomusdeserticola，Sde)、瑚狀盾巨囊霉(Racocetracoralloidea，Rco)、巴西類球囊霉(Paraglomusbrasilianum，Pb)和哥倫比亞內養(yǎng)囊霉(Entrophosporacolombiana，Ec)可以作為人工云木香栽培條件下的潛在優(yōu)良菌株進行施用。微量元素與中藥藥效及藥性的關系長期以來都受到人們的關注。中藥中的微量元素進入人體后，有可能促進中藥中某些藥用成分發(fā)揮作用，并且某些微量元素本身就有療效作用，如Na、K和Ca可以維持體內細胞的內外滲透平衡，維持神經(jīng)細胞膜的生物興奮性；Zn可以增強人體的免疫功能；Mn可以減少血管內血栓的形成，降低動脈硬化的危險；Mg是多種酶的輔基和激活劑[21]。本文將24種AM真菌接種于木香植株，探究其根部內各元素含量的變化情況，發(fā)現(xiàn)大部分處理組的木香根部內大量元素和微量元素含量遠超過CK組，而有害元素含量則顯著低于CK組，這證明外源接種AM真菌對木香根部無機元素的吸收起到了促進作用。根據(jù)木香根部對無機元素的吸收情況來看，Al、Rc、Ga、Gg和Pb處理組對木香根部無機元素吸收的調控效果最佳，在木香生產(chǎn)栽培上可以進行施用。

將這些無機元素用SPSS進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，部分元素含量之間存在極顯著或顯著相關關系。AM真菌與植物根部形成的共生系統(tǒng)，增強了植物的富集能力，但不同真菌或不同植物之間的相互作用，最適條件仍值得繼續(xù)探究?？傮w來看，接種AM真菌對木香無機元素吸收是存在影響的。這些影響既有拮抗作用又有協(xié)同作用。本研究為木香今后研究奠定了基礎，為木香未來發(fā)展拓展了空間，也填補了AM真菌在中藥材應用中的空白。