基于微滴數(shù)字PCR技術(shù)建立HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的檢測(cè)方法

田 原, 徐 玲, 范子豪, 曹亞玲, 張向穎, 陳 煜, 段鐘平, 任 鋒

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院， 北京市肝病研究所， 北京 100069； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院肝病中心四科， 肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100069

HBV感染是影響全世界人民健康的主要公共衛(wèi)生問題，有超過2.5億的HBV感染者，每年因HBV感染所導(dǎo)致的死亡人數(shù)大約有88.7萬[1-3]。目前，主要的抗病毒藥物如核苷(酸)類似物和干擾素α等都不能完全治愈HBV，根本原因在于不能徹底清除共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)[4]。HBV cccDNA是病毒RNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄的模板，它能以微染色體的形式長(zhǎng)期穩(wěn)定的存在于肝細(xì)胞核內(nèi)[5]。因此，建立一種有效的檢測(cè)HBV cccDNA方法，對(duì)于臨床抗病毒治療效果的評(píng)價(jià)和治療策略的調(diào)整都具有重要意義[6]。本研究建立了檢測(cè)HBV cccDNA的微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)方法。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2017年6月—2020年10月在本院就診的20例臨床診斷為HBV感染者的肝組織樣本。質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pUC-HBV質(zhì)粒。

1.2 試劑與儀器 QIAamp DNA Mini Kit(50)購自德國QIA-GEN公司；Plasmid-safe ATP-dependent DNase購自美國Lucigen公司；TaqMan Fast Advanced Master Mix購自美國Applied Biosystems公司。新羿TD-1微滴式數(shù)字PCR儀購自新羿生物公司。ViiATM7 Real-Time PCR System熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 因?yàn)镠BV cccDNA是完整的閉合環(huán)狀DNA，而HBV松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)存在缺口，所以通過跨越HBV DNA負(fù)鏈缺口設(shè)計(jì)HBV cccDNA的上下游引物及探針(圖1)。引物及探針序列，HBV cccDNA-F：5′-GGGGCGCACCTCTCTTTA-3′；HBV cccDNA-R：5′-AGGCACAGCTTGGAGGC-3′；HBV cccDNA-P：5′-FAM-TCACCTCTGCCTAATCATCTC-TAMRA-3′。

圖1 HBV cccDNA與rcDNA結(jié)構(gòu)示意圖

根據(jù)Gene Bank中提供的β-actin基因序列設(shè)計(jì)上下游引物和探針，并在PubMed上進(jìn)行引物序列的比對(duì)。引物及探針序列：β-actin-F：5′-ACTGTGCCCATCTACGAGG-3′；β-actin-R：5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3′； β-actin-P：5′-FAM-CGGGAAATCGTGCGTGAC-TAMRA-3′。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 HBV cccDNA陽性對(duì)照質(zhì)粒的建立 利用設(shè)計(jì)好的HBV cccDNA引物對(duì)HBV質(zhì)粒擴(kuò)增，然后純化回收目的片段，用目的片段與T載體連接，轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌中，再把大腸桿菌放入LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增，最后提取質(zhì)粒。由此得到了HBV cccDNA陽性對(duì)照質(zhì)粒。

1.5 肝組織HBV cccDNA模板的制備 先用QIAamp DNA Mini Kit提取患者肝組織DNA，然后用質(zhì)粒安全性ATP依賴的DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase，PSAD)進(jìn)行酶切，去除rcDNA等其他形式的DNA。PSAD酶切體系：肝組織DNA產(chǎn)物 8.5 μl、PSAD(10 U/L)0.4 μl、25 mmol/L ATP 0.8 μl、10×Buffer 2 μl，總體積為11.7 μl。反應(yīng)條件：先在37 ℃水浴中放置12 h，然后在70 ℃水浴中放置30 min。終產(chǎn)物作為肝組織cccDNA的檢測(cè)模板。

1.6 ddPCR反應(yīng)體系和條件 按照新羿生物公司提供的Probe dPCR SuperMix (with UNG)說明書配制反應(yīng)體系為30 μl：2×SuperMix 15 μl、上游引物(10 μmol/L)0.6 μl、下游引物(10 μmol/L)0.6 μl、探針(10 μmol/L)0.6 μl、模板3 μl、ddH2O 10.2 μl。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；12 ℃ 5 min。

1.7 熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件 利用設(shè)計(jì)的引物和探針建立熒光定量PCR檢測(cè)方法，配制反應(yīng)體系為20 μl：TaqMan Fast Advanced Master Mix 10 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、探針0.5 μl、模板2 μl、ddH2O 6.5 μl。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限分析 利用構(gòu)建好的陽性對(duì)照質(zhì)粒換算出拷貝數(shù)后進(jìn)行梯度稀釋，稀釋的濃度分別為：1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷貝/μl。以稀釋后的產(chǎn)物為模板對(duì)該方法的準(zhǔn)確度和靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)陽性對(duì)照質(zhì)粒的拷貝數(shù)和檢測(cè)結(jié)果的拷貝數(shù)計(jì)算出線性相關(guān)系數(shù)r2值。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 分別選取1×103、1×102、1×101拷貝/μl的陽性對(duì)照質(zhì)粒為模板，進(jìn)行3次ddPCR重復(fù)檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)重復(fù)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算出變異系數(shù)。

1.10 兩種檢測(cè)方法對(duì)比試驗(yàn) 提取20例患者肝組織DNA樣本，并利用PSAD酶切得到HBV cccDNA模板。對(duì)模板同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)和ddPCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榭截悢?shù)進(jìn)行對(duì)比。

1.11 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：京佑科倫字(2020)132號(hào)。患者均簽署知情同意書。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限分析 用梯度稀釋的陽性對(duì)照質(zhì)粒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，用ddPCR檢出陽性對(duì)照質(zhì)粒濃度的對(duì)數(shù)與其梯度稀釋濃度的對(duì)數(shù)作圖，線性方程為y=0.971 3x+0.318 5，r2值為0.989 6，具有較好的線性關(guān)系。表明ddPCR檢測(cè)HBV cccDNA的檢出限為1拷貝/μl，線性范圍為1×100～1×104拷貝/μl，見表1和圖3。

圖2 ddPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 梯度稀釋陽性質(zhì)粒ddPCR微滴熒光分布

表1 梯度稀釋陽性質(zhì)粒ddPCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過對(duì)1×100拷貝/μl和陰性樣本多次重復(fù)檢測(cè)后，利用公式：LoB=μB+1.645σB (LoB為空白限，μB和σB為空白樣本檢測(cè)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差)[7]，得到本研究方法的空白限為0.35 拷貝/μl。

2.2 重復(fù)性分析 選取濃度為1×103、1×102、1×101拷貝/μl的陽性對(duì)照質(zhì)粒進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果見表2。變異系數(shù)分別為4.41%、3.98%、5.09%，說明建立ddPCR檢測(cè)方法重復(fù)性較好，檢測(cè)結(jié)果可靠。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3 熒光定量PCR和ddPCR檢測(cè)方法對(duì)比 提取20例臨床HBV感染者的肝組織DNA樣本，進(jìn)行PSAD酶切后得到HBV cccDNA模板。ddPCR方法能檢測(cè)出17例陽性樣本，陽性率為85%，而熒光定量PCR方法只能檢出11例，陽性率為55%，兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.286，P=0.038)(表3)。

表3 熒光定量PCR和ddPCR檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

HBV cccDNA作為病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板，能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定的存在于細(xì)胞核中。目前，用于治療HBV的藥物長(zhǎng)期使用可有效降低肝內(nèi)cccDNA的水平，但是不能完全清除[8-9]。因此研發(fā)靶向清除HBV cccDNA的藥物是治愈HBV的關(guān)鍵，同時(shí)也需要能夠精準(zhǔn)檢測(cè)HBV cccDNA的方法，對(duì)治療效果做出及時(shí)的評(píng)價(jià)。由于HBV cccDNA在肝細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)較低，每個(gè)細(xì)胞僅有5～50拷貝，所以就需要更加靈敏的檢測(cè)方法[10]。

現(xiàn)有的HBV cccDNA檢測(cè)方法主要是滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification, RCA)、熒光定量PCR和巢式PCR等?？蒲腥藛T利用RCA和熒光定量PCR結(jié)合的方法，檢測(cè)了石蠟包埋的肝組織切片中的HBV cccDNA，通過RCA有效提高了檢測(cè)的靈敏度，但是該方法步驟繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)[11]。Xu等[12]利用巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)外周血單核細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞中的HBV cccDNA進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度達(dá)到了3.0×102拷貝/μl，并能準(zhǔn)確檢測(cè)出臨床的陽性和陰性樣本。Guo等[13]開發(fā)了一種磁珠捕獲雜交的方法檢測(cè)血清中的HBV cccDNA，通過制備捕獲cccDNA的特異性納米粒子，從而有效區(qū)分rcDNA和cccDNA，提高了檢測(cè)的特異性，但是此方法需要特殊的材料，價(jià)格昂貴。

ddPCR是新一代的PCR技術(shù)，能對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行絕對(duì)的定量分析而不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。ddPCR采用微滴式方法，將核酸溶液分散到微滴中，每個(gè)微滴不含或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)核酸模板數(shù)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，有核酸分子模板的微滴會(huì)出現(xiàn)熒光信號(hào)，沒有核酸分子模板的則無熒光信號(hào)。再根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例計(jì)算出目標(biāo)核酸的原始拷貝數(shù)[14-16]。ddPCR相比于熒光定量PCR具有更高的靈敏度和特異度，已經(jīng)被廣泛用于病原微生物檢測(cè)、基因多重定量檢測(cè)和罕見的生物變異檢測(cè)等許多領(lǐng)域[17-20]。

本研究建立了一種ddPCR檢測(cè)HBV cccDNA的方法，提高了檢出率，并具有較好的重復(fù)性。使用PSAD對(duì)樣本DNA進(jìn)行處理，最大限度的降低單鏈DNA和線性雙鏈DNA對(duì)檢測(cè)的影響[21]。又通過對(duì)跨越HBV基因組負(fù)鏈的缺口區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，提高了HBV cccDNA擴(kuò)增的特異性。對(duì)梯度稀釋后的HBV cccDNA陽性對(duì)照質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ddPCR方法檢測(cè)陽性對(duì)照質(zhì)粒的檢出限為1 拷貝/μl。把20例臨床肝組織DNA樣本經(jīng)PSAD消化后的產(chǎn)物作為擴(kuò)增的模板，用ddPCR方法和熒光定量PCR方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，ddPCR方法能準(zhǔn)確檢出17例，陽性率為85%，而熒光定量PCR方法只能檢出11例，陽性率為55%，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明ddPCR檢測(cè)方法優(yōu)于于熒光定量PCR方法。

總之，本研究所建立的ddPCR檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確、靈敏的對(duì)肝組織中的HBV cccDNA進(jìn)行定量分析和檢測(cè)，提高了HBV cccDNA檢出率，對(duì)更好的評(píng)價(jià)HBV治療效果有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突說明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：田原、徐玲負(fù)責(zé)資料分析，論文撰寫；范子豪、曹亞玲、張向穎負(fù)責(zé)收集和分析數(shù)據(jù)；陳煜、段鐘平、任鋒負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫并最后定稿。