補(bǔ)腎活血方干預(yù)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎自噬和凋亡作用的研究

鄧斌，張玉笙，林美專，康書(shū)鵬，許鎮(zhèn)文

（廣東省普寧市中醫(yī)醫(yī)院骨科，廣東 普寧 515300）

1 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及相關(guān)材料

20只普通級(jí)3月齡雄性新西蘭兔（湖南太平生物科技有限公司，證號(hào)：SYXK（湘）2020-0005；），RIPA細(xì)胞裂解液（北京普利萊，C1053）；BCA蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）等試劑。

實(shí)驗(yàn)用中藥配方（廠家：廣東一方制藥有限公司，廣東省普寧市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供）：丹參顆粒劑20g、制附子顆粒劑10g、 熟地顆粒劑20g、 巴戟天顆粒劑15g 及仙茅顆粒劑10g等提取生藥 。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 兔子膝關(guān)節(jié)炎造模

常規(guī)石膏繃帶固定造模方法，伸直位6w固定兔左后膝關(guān)節(jié)，定期檢查石膏，防止松動(dòng)、脫落，要求DR片證實(shí)造模成功。

2.2 動(dòng)物給藥處理及取樣方法

正常對(duì)照組和模型對(duì)照組的兔子用等量的生理鹽水灌胃，模型+補(bǔ)腎活血方組的兔子用等量的中藥（7.56mL/kg/d）灌胃，灌胃給藥6w，在灌胃時(shí)，管子先插10cm左右，再用管子的另一端伸入準(zhǔn)備好的水中，看兔子在呼吸時(shí)管子中的水柱是否會(huì)跟著呼吸迅速上升或下降，如果不行，拔出重置。也可以在伸入5cm左右先用水驗(yàn)證，驗(yàn)證方法同上，再通過(guò)回抽驗(yàn)證，驗(yàn)證方法為如果注射器中回抽的氣體比較多，且負(fù)壓不大，則拔出管子重復(fù)之前操作，如果回抽的氣體比較少，且負(fù)壓比較大，則可以注入中藥。

取各組兔子左腿膝關(guān)節(jié)軟骨，股骨髁部軟骨用于做HE檢測(cè)，脛骨上端軟骨各取半分別做WB檢測(cè)和PCR檢測(cè)。

2.3 HE染色

HE染色常規(guī)步驟逐步處理組織，最后鏡檢。

2.4 qPCR檢測(cè)

收集各組兔子膝關(guān)節(jié)軟骨組織，用Trizon裂解法提取RNA，經(jīng)濃度測(cè)定后，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再用基因相應(yīng)引物和熒光定量試劑盒上樣進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量測(cè)定。檢測(cè)所用引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息總表

2.5 Western Blot檢測(cè)

收集三組中兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織，1）裂解、離心并吸取上清，獲得總蛋白。2）測(cè)定蛋白濃度后蛋白變性，上樣。3）凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。4）一抗、二抗溶液孵育。5）在成像系統(tǒng)中曝光，用“ImageJ”軟件分析各抗體條帶灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均用Graphpad Prism7統(tǒng)計(jì)分析，表示為平均值±SD。組間的顯著性差異經(jīng)One-way和Two-way ANOVA分析，以P<0.05作為顯著性差異。

qPCR的數(shù)據(jù)按照2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，在P<0.05的情況下，如果2-△△Ct小于1，說(shuō)明目的基因在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)下調(diào)；大于1說(shuō)明表達(dá)上調(diào)；P>0.05則表達(dá)無(wú)差異。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色結(jié)果

正常對(duì)照組中，鏡下可見(jiàn)光滑的軟骨表面，清晰規(guī)則的四層結(jié)構(gòu)，正常的軟骨細(xì)胞數(shù)量，清晰完整的潮線。模型組中鏡下可見(jiàn)不光滑的軟骨表面，而且糜爛和缺損、深達(dá)輻射層，簇狀增生明顯的周圍軟骨，軟骨變薄、厚薄不均，細(xì)胞數(shù)顯著減少。加入補(bǔ)腎活血方提取的生藥處理后，軟骨表面變光滑，簇狀增生變少。

圖1 膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色結(jié)果圖

4.2 qPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)按照2-△△Ct

法計(jì)算所得相對(duì)表達(dá)量，見(jiàn)表2。

表2 qPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)按照2-△△Ct 法計(jì)算所得相對(duì)表達(dá)量

4.3 qPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)按照2-△△Ct

法計(jì)算所得相對(duì)表達(dá)量對(duì)比，見(jiàn)表3。

4.4 Beclin-1和 Bcl-2表達(dá)情況表

見(jiàn)表4。

表4 Beclin-1和 Bcl-2表達(dá)情況表

圖2 膝關(guān)節(jié)軟骨組織表達(dá)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖

5 討論

文獻(xiàn)記載骨性關(guān)節(jié)炎（OA）發(fā)病機(jī)制在于原發(fā)的肝腎虧虛和繼發(fā)的瘀血阻滯，虛和瘀相互影響共同導(dǎo)致OA。中醫(yī)臨床治療中，多數(shù)醫(yī)學(xué)專家運(yùn)用補(bǔ)腎活血的方藥治療，針對(duì)OA的內(nèi)因和外因，標(biāo)本兼治都取得了良好療效。本研究中所用補(bǔ)腎活血方由丹參顆粒劑20g、制附子顆粒劑10g、 熟地顆粒劑20g、 巴戟天顆粒劑15g 及仙茅顆粒劑10g等提取生藥，其中制附子補(bǔ)腎陽(yáng)、散寒止痛，巴戟天、仙茅補(bǔ)陽(yáng)溫腎、祛風(fēng)除濕，熟地補(bǔ)血養(yǎng)陰，用于肝腎陰虛，丹參活血祛瘀，通經(jīng)止痛，共奏補(bǔ)陽(yáng)溫腎，活血祛瘀止痛之功。實(shí)驗(yàn)課題也證實(shí)：膝關(guān)節(jié)炎模型中加入補(bǔ)腎活血方處理后，軟骨表面變光滑，簇狀增生變少，自噬相關(guān)基因Beclin-1和自噬蛋白Beclin-1表達(dá)降低，抗凋亡基因Bcl-2和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加。認(rèn)為該補(bǔ)腎活血方能改善兔膝骨性關(guān)節(jié)炎，能影響兔子膝關(guān)節(jié)炎自噬相關(guān)基因、蛋白和抗凋亡基因、蛋白的表達(dá)。

從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度看，OA的主要病因是軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解。自噬是溶酶體降解損壞蛋白和細(xì)胞器的代謝過(guò)程，是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的一種重要的存活機(jī)制，自噬可以對(duì)OA軟骨細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[1]。細(xì)胞的凋亡是軟骨退變的主要機(jī)制，防止軟骨細(xì)胞的凋亡有利于損傷軟骨的修復(fù)。細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡的相互作用較復(fù)雜,既相互協(xié)同又相互拮抗,細(xì)胞凋亡通路的激活或抑制也可能受自噬調(diào)控藥物調(diào)控的自噬過(guò)程有關(guān)[2]。Beclin-1被認(rèn)為是Bcl-2蛋白家族的成員之一[4]，Bcl-2蛋白家族調(diào)控自噬的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在于Beclin-l[6],由Beclin-l基因調(diào)控的細(xì)胞自噬可清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和降解的大分子物質(zhì)，減少積累，維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生存。Bcl-2蛋白家族由抗凋亡和促凋亡分子組成，其主要通過(guò)作用于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)調(diào)控凋亡[3,4]，Bcl-2/Bax是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素, 可反映細(xì)胞凋亡情況[5]。Beclin-1可與Bcl-2抗凋亡蛋白結(jié)合直接調(diào)控自噬和凋亡。細(xì)胞選擇自噬還是凋亡,主要取決于自噬蛋白Beclin-1還是凋亡效應(yīng)者Bak/Bax被激活，Beclin-1與Bcl-2/Bcl-XL結(jié)合或Beclin-1脫離Bcl-2/Bcl-XL的結(jié)合,從而誘導(dǎo)凋亡和自噬功能[4]。Beclin -1/Bcl-2介導(dǎo)的自噬/凋亡互反饋?zhàn)饔?，可能是調(diào)控自噬與凋亡交互作用的關(guān)鍵機(jī)制。本研究也表明自噬和凋亡是密切相關(guān)的，兩者有共同的誘因，共享一些重要的調(diào)節(jié)分子。