芪參湯對肝纖維化大鼠肝組織輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的影響

袁維，王炳予，楊磊，袁星星

芪參湯對肝纖維化大鼠肝組織輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的影響

袁維1，2，王炳予3，楊磊3，袁星星3

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科，湖南 長沙 410208； 3.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150001

觀察芪參湯對肝纖維化大鼠肝組織輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）平衡的影響，探討其抗肝纖維化作用機(jī)制。40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、芪參湯組及秋水仙堿組，每組10只。采用四氯化碳腹腔注射法制備肝纖維化大鼠模型。造模期間芪參湯組及秋水仙堿組分別給予芪參湯（2 g/mL）及秋水仙堿混懸液（20 mg/L）灌胃，空白組、模型組予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)8周。全自動生化分析儀檢測血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及總膽紅素（TBil）水平；ELISA檢測肝組織白細(xì)胞介素（IL）-17A和IL-10含量；免疫組化檢測肝組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測肝組織Th17和Treg比例；Western blot和RT-PCR分別檢測肝組織維甲酸相關(guān)孤兒受體γt（ROR-γt）、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3（Foxp3）蛋白和mRNA表達(dá)。與空白組比較，模型組大鼠肝纖維化評分、膠原染色面積明顯增加（＜0.05），血清AST、ALT、TBil水平明顯升高（＜0.05），IL-17A含量明顯增加、IL-10含量明顯減少（＜0.05），肝組織TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.05），Th17比例增加、Treg比例減少，Th17/Treg比值明顯增加（＜0.05），肝組織ROR-γt蛋白和mRNA表達(dá)明顯升高，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，芪參湯組和秋水仙堿組肝纖維化評分、膠原染色面積明顯減少（＜0.05），血清AST、ALT、TBil水平明顯降低（＜0.05），IL-17A含量明顯減少，IL-10含量明顯增加（＜0.05），肝組織TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05），Th17比例減少，Treg比例增加，Th17/Treg比值明顯降低（＜0.05），肝組織ROR-γt蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.05）。芪參湯可抑制大鼠肝纖維化，其作用機(jī)制可能與減少膠原纖維增生、改善大鼠肝功能、降低炎癥因子水平、恢復(fù)Th17/Treg平衡有關(guān)。

芪參湯；肝纖維化；輔助性T細(xì)胞17；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；大鼠

肝纖維化是各種慢性肝病如非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎和血吸蟲病等向終末期肝病發(fā)展的必經(jīng)階段，其共同病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞外基質(zhì)（即糖蛋白、膠原及蛋白多糖等）的異常分布與彌漫性過度沉積[1]。盡管不同致病因素下肝纖維化的發(fā)展和病理機(jī)制不同，且病理改變存在一定差異，但肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化及其向成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化則是所有肝纖維化發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。

HSC位于竇周間隙內(nèi)，其活化受多種細(xì)胞因子和途徑的調(diào)控。研究表明，Kupffer細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等經(jīng)典免疫細(xì)胞，以及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞等非經(jīng)典免疫細(xì)胞能通過分泌不同細(xì)胞因子調(diào)控HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的生成與降解[2]。輔助性T細(xì)胞17（Th17）與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）均來自同一前體細(xì)胞，且兩者的平衡在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[3-4]。有研究顯示，肝纖維化小鼠中存在Th17/Treg失衡，且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Treg能抑制Th17誘導(dǎo)的HSC活化[5-6]。因此，調(diào)控Th17/Treg平衡成為抑制HSC激活的重要途徑。課題組前期研究表明，芪參湯能抑制HSC激活和調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的降解[7-9]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測肝纖維化大鼠肝組織中Th17、Treg的比例及轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體γt（ROR-γt）、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3（Foxp3）蛋白和mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步探討芪參湯抑制肝纖維化的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量240～260 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0011，動物使用許可證號SYXK（黑）2016-008。飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，溫度22～24 ℃，相對濕度45%～50%，光/暗周期12 h，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動物管理與使用指南》有關(guān)規(guī)定[10]。

1.2 藥物及制備

芪參湯（黃芪15 g，西洋參10 g，丹參10 g，山楂10 g，荷葉10 g，澤瀉10 g，女貞子8 g，三七5 g，墨旱蓮8 g，絞股藍(lán)5 g，甘草3 g），黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室制備，飲片經(jīng)煎煮、過濾，濃縮至含原藥材2 g/mL，置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。秋水仙堿，西雙版納藥業(yè)有限公司，批號191121。

1.3 主要試劑與儀器

四氯化碳（CCl4），美國Sigma-Aldrich公司，貨號488488；蘇木素-伊紅（HE）染液，南京建成生物工程研究所，貨號D006-1-1；天狼猩紅染色液，北京索萊寶科技有限公司，貨號S8060；大鼠白細(xì)胞介素（IL）-17A、IL-10 ELISA試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，貨號分別為MM-70049R2、MM-0195R2；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、ROR-γt、Foxp3、β-actin抗體，英國Abcam公司，貨號分別為ab215715、ab7817、ab58670、ab215206、ab8227；IL-17A、CD4、CD25抗體，美國CST公司，貨號分別為13838、96127、48127；Percoll淋巴細(xì)胞分離液，美國GE公司，貨號17-0891-01；RNA提取試劑盒，美國Thermo Fisher公司，貨號15596026；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒，日本Takara公司，貨號分別為639503、RR420。CX33光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀、Attune NxT流式細(xì)胞儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國Thermo Fisher公司；電泳儀、電泳槽，美國Bio-Rad公司；Cobas8000全自動生化儀，德國Roche公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥

40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、芪參湯組及秋水仙堿組，每組10只。除空白組外，其余3組大鼠參照文獻(xiàn)[11]方法腹腔注射20%CCl4（5 μL/g），每周2次，連續(xù)8周，空白組予等體積橄欖油溶液腹腔注射。造模期間，給藥組參照人與動物等效劑量給予相應(yīng)藥物治療，芪參湯組給予芪參湯藥液（2 g/mL）灌胃，秋水仙堿組給予秋水仙堿混懸液（20 mg/L）灌胃，空白組和模型組給予等體積生理鹽水。給藥體積1 mL，1次/d，連續(xù)8周。末次給藥后72 h，使用CO2窒息處死所有大鼠，腹主動脈取血后分離肝組織用于指標(biāo)檢測。

2.2 病理觀察

取肝組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（5 μm），分別采用HE染色及天狼猩紅染色檢測大鼠肝組織病理形態(tài)并進(jìn)行肝纖維化評分，計(jì)算膠原染色面積。肝纖維化評分參照文獻(xiàn)[12]標(biāo)準(zhǔn)：0分，無明顯纖維化；1分，門脈區(qū)和中央靜脈區(qū)可見少量纖維增生，無間隔形成；2分，門脈區(qū)和中央靜脈區(qū)可見少量纖維增生及少量間隔形成；3分，大量膠原纖維增生及纖維間隔形成，可見少量假小葉形成；4分，大量膠原纖維增生并可見大量假小葉形成。

2.3 血清肝功能指標(biāo)檢測

將收集的外周血13 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及總膽紅素（TBil）水平。

2.4 炎癥因子檢測

肝組織以預(yù)冷的PBS沖洗后剪碎，用玻璃勻漿器于冰浴中充分勻漿，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，收集上清液。參照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠肝組織IL-17A和IL-10含量。

2.5 免疫組化檢測

取石蠟切片，脫蠟至水，檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)；3%過氧化氫室溫孵育15 min，PBS沖洗3次；甩干后加入稀釋的α-SMA、TGF-β1一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000），室溫繼續(xù)孵育40 min；PBS沖洗3次；甩干后加入新鮮配制的DAB染色液，室溫孵育10 min；蘇木素復(fù)染，梯度乙醇及二甲苯脫色、透明處理后，中性樹膠封片，鏡下觀察，采用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算陽性表達(dá)的積分光密度（IOD）。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測

取適量肝組織剪碎，研磨后以200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾；用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗；4 ℃、500 r/min離心3 min，取上清液1 500 r/min離心10 min，棄上清；沉淀，于4 ℃用Percoll淋巴細(xì)胞分離液重懸，分離肝組織中淋巴細(xì)胞；PBS洗滌、重懸后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL；各組取0.5 mL細(xì)胞懸液至24孔板，加入稀釋后的豆蔻酰佛波醇乙酯、離子霉素、布雷非德菌素A混合液進(jìn)行誘導(dǎo)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h；2 000 r/min離心5 min，棄上清。Th17染色：加入FITC標(biāo)記的CD4抗體，4 ℃、避光孵育30 min，PBS洗滌，加入Cytofix/ Cytoperm固定、破膜，洗滌，加入PE標(biāo)記的IL-17A抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，避光孵育30 min。Treg染色：加入FITC標(biāo)記的CD4抗體和PE-Cy7標(biāo)記的CD25抗體，4 ℃、避光孵育30 min，PBS洗滌后，加入Cytofix/Cytoperm固定、破膜，洗滌，加入PE標(biāo)記的Foxp3抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，避光孵育30 min。細(xì)胞洗滌后重懸，上機(jī)檢測，并采用CXP分析軟件計(jì)算Th17、Treg比例。

2.7 Western blot檢測

取適量肝組織剪碎，加裂解液冰上裂解，離心；取上清液，以BCA法測定總蛋白濃度；加入15 μL蛋白樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h；分別加入稀釋后的ROR-γt、Foxp3和β-actin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗膜5次，加入HRP標(biāo)記二抗，室溫繼續(xù)孵育1 h；TBST洗膜5次；滴加ECL顯影液，凝膠成像系統(tǒng)分析，計(jì)算目的蛋白條帶的相對表達(dá)量。

2.8 RT-PCR檢測

取適量肝組織剪碎，冰上裂解，Trizol法提取肝組織總RNA，參照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；將cDNA稀釋后作為模板，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書將各試劑混勻后上機(jī)檢測。PCR引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火60 s，循環(huán)40次，終末60 ℃補(bǔ)延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

表1 各基因PCR引物序列

基因名稱基因序列（5’～3’）產(chǎn)物長度/bp ROR-γt上游：CTGGGCATGTCCCGAGATG119 下游：GGTCACCAGTTCTGGGGAG Foxp3上游：CACCTATGCCACCCTTATCCG124 下游：AGATGGTAACCAAATGAGCGTAC GAPDH上游：TGACCTCAACTACATGGTCTACA 85 下游：GTTCCGGCTCTTACCCTTC

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 芪參湯對肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)過程中模型組大鼠死亡3只，秋水仙堿組及芪參湯組各死亡1只。空白組大鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，匯管區(qū)的動脈、靜脈、中央靜脈和膽管結(jié)構(gòu)正常，有極少量膠原，肝竇和匯管區(qū)可見少量間質(zhì)細(xì)胞。與空白組比較，模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，可見大量炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死并有假小葉形成，匯管區(qū)與中央靜脈區(qū)可見大量膠原沉積，肝纖維化評分明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。與模型組比較，芪參湯組和秋水仙堿組大鼠肝組織未見假小葉形成，肝細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和纖維化程度明顯減輕，膠原染色面積、肝纖維化評分減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)（×400）

表2 各組大鼠肝纖維化評分及膠原染色面積比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

4.2 芪參湯對肝纖維化大鼠血清肝功能指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清AST、ALT和TBil水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，芪參湯組及秋水仙堿組大鼠血清AST、ALT及TBil水平顯著降低（＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清AST、ALT、TBil水平比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

4.3 芪參湯對肝纖維化大鼠肝組織白細(xì)胞介素-17A、白細(xì)胞介素-10含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織IL-17A含量顯著增加，IL-10含量顯著減少（＜0.05）；與模型組比較，芪參湯組和秋水仙堿組大鼠肝組織IL-17A含量顯著減少，IL-10含量顯著增加（＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠肝組織IL-17A、IL-10含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

4.4 芪參湯對肝纖維化大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1、α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)的影響

TGF-β1和α-SMA陽性結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞漿的棕黃色細(xì)顆粒狀染色。與空白組比較，模型組大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，芪參湯組和秋水仙堿組大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05）。見表5、圖2。

4.5 芪參湯對肝纖維化大鼠肝組織輔助性T細(xì)胞17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織Th17比例和Th17/Treg比值顯著增加，Treg比例顯著減少（＜0.05）；與模型組比較，芪參湯組和秋水仙堿組大鼠肝組織Th17比例和Th17/Treg比值顯著降低，Treg比例顯著增加（＜0.05）。見圖3、表6。

4.6 芪參湯對肝纖維化大鼠肝組織維甲酸相關(guān)孤兒受體γt、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織ROR-γt蛋白表達(dá)顯著升高，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，芪參湯組和秋水仙堿組大鼠肝組織ROR-γt蛋白表達(dá)顯著降低，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05）。見圖4、表7。

表5 各組大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)比較（±s，IOD）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

圖2 各組大鼠肝組織TGF-β1、α-SMA陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖3 各組大鼠肝組織Th17、Treg檢測流式細(xì)胞圖

表6 各組大鼠肝組織Th17、Treg比例及Th17/Treg比值比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

注：A.空白組；B.模型組；C.芪參湯組；D.秋水仙堿組

表7 各組大鼠肝組織ROR-γt、Foxp3蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

4.7 芪參湯對肝纖維化大鼠肝組織維甲酸相關(guān)孤兒受體γt、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織ROR-γt mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，芪參湯組和秋水仙堿組大鼠肝組織ROR-γt mRNA表達(dá)顯著降低（＜0.05）。各組Foxp3 mRNA表達(dá)無明顯變化（＞0.05）。見表8。

表8 各組大鼠肝組織ROR-γt、Foxp3 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

5 討論

Th17是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型CD4+T細(xì)胞亞群，在多種免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病和腫瘤的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。Th17主要通過分泌特征性炎癥因子如IL-17A、IL-21和IL-22等參與自身免疫性肝病、病毒性肝炎和非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病[13]。黃小麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中，Th17比例和IL-17含量明顯增加，且與α-SMA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。同時，Tan等[15]研究表明，IL-17能提高HSC中TGF-β、IL-6、膠原蛋白和α-SMA的表達(dá)，表明IL-17具有促進(jìn)肝纖維化的作用。作為RORs家族成員之一，ROR-γt特征性表達(dá)于CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞，是Th17分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[16-17]。ROR-γt可激活I(lǐng)L-17基因，促使其他因子結(jié)合至IL-17的啟動子上，進(jìn)而上調(diào)CD4+T淋巴細(xì)胞中IL-17的轉(zhuǎn)錄水平[18]。本研究結(jié)果顯示，芪參湯能顯著改善肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)和肝功能水平。同時，芪參湯能顯著抑制肝組織ROR-γt mRNA和蛋白的表達(dá)，從而抑制Th0向Th17分化。TGF-β1主要來源于HSC和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，是目前已知最強(qiáng)的促肝纖維化細(xì)胞因子，參與肝纖維化的關(guān)鍵關(guān)節(jié)[19]。α-SMA是HSC活化的標(biāo)志，通過參與合成Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[20]。本研究結(jié)果顯示，芪參湯能顯著抑制大鼠肝組織TGF-β1和α-SMA蛋白的表達(dá)。

Treg是一類具有抑制效應(yīng)的T細(xì)胞亞群，主要通過分泌IL-10及IL-35等細(xì)胞因子抑制樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的聯(lián)系、免疫活性和增殖水平，進(jìn)而介導(dǎo)機(jī)體對外源性和內(nèi)源性抗原的免疫耐受和維持自身免疫平衡[21]。研究表明，當(dāng)Treg與脂多糖誘導(dǎo)的HSC共培養(yǎng)時，IL-10的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而IL-10被證實(shí)具有抑制HSC活化和拮抗肝纖維化進(jìn)程的作用[22]。進(jìn)一步提示Treg可能通過上調(diào)肝組織IL-10的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)和HSC活化，從而發(fā)揮抑制肝纖維化的作用。Foxp3是Treg重要的轉(zhuǎn)錄因子，同時也是CD25+Treg的標(biāo)志分子。研究表明，F(xiàn)oxp3功能缺陷可導(dǎo)致Treg功能異常，同時，F(xiàn)oxp3能通過與ROR-γt結(jié)合而減少Th17分化[23]。本研究結(jié)果表明，芪參湯能顯著上調(diào)大鼠肝組織Treg比例和Foxp3蛋白表達(dá)，降低肝組織Th17/Treg比值。由于Foxp3基因在誘導(dǎo)表達(dá)過程中受一系列生理信號和蛋白修飾嚴(yán)格調(diào)控，如miR-17能靶向輔助調(diào)節(jié)因子引起Foxp3穩(wěn)定性減弱，從而降低Treg的免疫抑制功能[24-25]。本研究中肝組織Foxp3 mRNA表達(dá)無顯著差異，因此推測芪參湯可能通過促進(jìn)Foxp3蛋白修飾而增加Foxp3穩(wěn)定性。

芪參湯是黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院脾胃病科張雅麗教授治療肝纖維化的經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、祛痰通絡(luò)功效。方中黃芪為補(bǔ)氣之要藥，具有溫補(bǔ)脾虛、利尿祛濕作用；西洋參味苦、微甘，性涼，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津功效。兩者共為君藥。研究表明，黃芪中微量元素硒可提高谷胱甘肽過氧化物酶活性，降低轉(zhuǎn)氨酶并保護(hù)肝細(xì)胞膜[26]。丹參味苦，性微溫，具有活血化瘀功效；山楂酸、甘，性微溫，具有行氣散瘀、消食健胃功效；荷葉味苦，性平，具有升陽健脾、消食化濕功效；澤瀉味甘，性寒，能利水滲濕、降脂化濁。以上四味共為臣藥。研究表明，荷葉中主要活性成分荷葉堿能抑制SREBP信號通路激活，進(jìn)而發(fā)揮對非酒精性脂肪性肝病小鼠肝組織損傷的保護(hù)作用[27]。佐以墨旱蓮、女貞子補(bǔ)腎養(yǎng)肝，絞股藍(lán)、三七祛濕化痰、化瘀通絡(luò)。動物實(shí)驗(yàn)表明，絞股藍(lán)總皂苷可抑制線粒體通路介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗大鼠肝纖維化的作用[28-29]。再以甘草補(bǔ)氣健脾，調(diào)和諸藥。本方既可治脾氣虛弱、肝腎陰虛之本，又除瘀、濕、痰、食之標(biāo)，以扶正為本，標(biāo)本兼治。

綜上所述，芪參湯可減少大鼠肝組織膠原纖維增生，改善大鼠肝功能，降低炎癥水平，恢復(fù)肝組織Th17/Treg平衡，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

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Effects ofDecoction on Th17/Treg Cell Balance in Rats with Liver Fibrosis

YUAN Wei1,2, WANG Bingyu3, YANG Lei3, YUAN Xingxing3

To investigate the effects ofDecoction on Th17/Treg balance in liver tissue of rats with liver fibrosis; To explore its anti-liver fibrosis mechanism.Totally 40 SD rats were randomly divided into control group, model group,Decoction group and colchicine group, with 10 rats in each group. Liver fibrosis model was established by carbon tetrachloride intraperitoneal injection. During the modeling period,Decoction group (2 g/mL) and colchicine group (20 mg/L) were given corresponding drug intragastric treatment, while the control group and model group were given equal volume of normal saline, once a day for 8 weeks. The serum AST, ALT, and TBil levels were detecteed by autormatic biochemical analyzer. The contents of IL-17A and IL-10 in liver tissue were detected by ELISA. The protein and mRNA expressions of TGF-β1and α-SMA protein in liver tissue were detected by immunohistochemistry. The proportions of Th17 and Treg cells of liver were detected by flow cytometry. The protein and mRNA expressions of ROR-γt and Foxp3 in liver tissue were detected by Western blot and RT-PCR.Compared with the control group, rat liver fibrosis score and collagen staining area significantly increased (<0.05); serum AST, ALT, TBil levels significantly increased (<0.05), IL-17A content significantly increased, and IL-10 content was significantly reduced (<0.05); TGF-β1and α-SMA protein expression in liver tissue significantly increased (<0.05); Th17 ratio increased, Treg ratio decreased, Th17/Treg ratio increased significantly (<0.05); ROR-γt protein and mRNA expression in liver tissue significantly increased, and the Foxp3 protein expression significantly decreased (<0.05). Compared with the model group, the liver fibrosis score and collagen staining area ofDecoction group and colchicine group were significantly reduced (<0.05); the serum AST, ALT, and TBil levels were significantly reduced (<0.05); the IL-17A content significant decreased, and IL-10 content significantly increased (<0.05); expressions of TGF-β1and α-SMA protein in liver tissue were significantly reduced (<0.05); Th17 ratio decreased, Treg ratio increased, and Th17/Treg ratio decreased significantly (<0.05); the expression of ROR-γt protein and mRNA in liver tissue was significantly reduced, and the expression of Foxp3 protein significantly increased (<0.05).Decoction can inhibit liver fibrosis in rats, and its mechanism of action may be related to reducing collagen fiber proliferation, improving rat liver function, reducing inflammatory factor levels, and restoring Th17/Treg balance.

Decoction; liver fibrosis; Th17; Treg; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)08-0066-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202012333

國家自然科學(xué)基金青年基金（81904182）；湖南省自然科學(xué)基金（2020JJ5441）；湖南省衛(wèi)生計(jì)生委科研計(jì)劃（20200752）；黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（ZHY18-029、ZHY19-061、ZHY19-062、ZHY2020-041）；黑龍江省自然科學(xué)基金聯(lián)合引導(dǎo)項(xiàng)目（LH2019H095）

袁星星，E-mail：jackieaqi@163.com

（收稿日期：2020-12-19）

（修回日期：2021-01-10；編輯：華強(qiáng)）