低乙醛啤酒酵母風(fēng)味優(yōu)勢(shì)菌株的選育

官 鈺，劉春鳳，李 崎，賀秀麗，謝 鑫，郭立蕓，王金晶*

低乙醛啤酒酵母風(fēng)味優(yōu)勢(shì)菌株的選育

官 鈺1, 2，劉春鳳1, 2，李 崎1, 2，賀秀麗3，謝 鑫3，郭立蕓3，王金晶1, 2*

(1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，釀酒科學(xué)與工程研究室，無(wú)錫 214122；3. 北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心，啤酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 101300)

啤酒發(fā)酵過(guò)程中的乙醛主要由啤酒酵母代謝產(chǎn)生，其含量極大地影響啤酒的風(fēng)味和品質(zhì)。目前已有大量研究通過(guò)選育啤酒酵母來(lái)降低啤酒中乙醛含量，但由于大部分采用了分子手段或不符合食品安全條件的方式，尚未真正投入到啤酒的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中去。本研究中，以啤酒企業(yè)提供的啤酒酵母YJ為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)常壓室溫等離子體誘變（Atmospheric and room temperature plasma, ARTP）處理，雙硫侖平板初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，獲得了遺傳穩(wěn)定性和發(fā)酵穩(wěn)定性良好的低產(chǎn)乙醛誘變菌株S48，進(jìn)而在啤酒工廠進(jìn)行100 L小試的發(fā)酵驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與出發(fā)菌株相比，誘變菌發(fā)酵的啤酒樣品中乙醛含量降低了23.69%，其酒精度有所提高，苦味質(zhì)、總酸和雙乙酰含量更低，主要風(fēng)味物質(zhì)無(wú)較大差異，醇酯比及感官分析結(jié)果更加協(xié)調(diào)。

酵母；乙醛；ARTP；雙硫侖；啤酒

乙醛是影響啤酒風(fēng)味組成和風(fēng)味穩(wěn)定性最重要的醛類(lèi)化合物，同時(shí)也是酒精飲料中引起人類(lèi)致癌的物質(zhì)之一[1-2]。啤酒中乙醛含量過(guò)高時(shí)會(huì)帶來(lái)不愉快的青蘋(píng)果味、青草味和氧化味等，造成消費(fèi)者口感的不協(xié)調(diào)，進(jìn)一步引起“上頭”等不適生理反應(yīng)[3-4]。另外，乙醛也是啤酒中許多低閾值成分的前體，如雙乙酰和乙偶姻[5]。一般優(yōu)質(zhì)成熟的工業(yè)啤酒中乙醛含量在2～10 mg·L-1[6]。

在啤酒的發(fā)酵和成熟過(guò)程中，啤酒酵母是乙醛的主要來(lái)源[7]。葡萄糖代謝所產(chǎn)生的丙酮酸，一部分轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)，另一部分經(jīng)丙酮酸脫羧酶催化生成乙醛[8]。乙醛可以在乙醇脫氫酶的作用下生成乙醇，或在乙醛脫氫酶的作用下生成乙酸，從而進(jìn)一步被代謝消耗[9]。抑制劑在菌種篩選的過(guò)程中有著廣泛的應(yīng)用，雙硫侖能有效抑制乙醛脫氫酶的活性，利用雙硫侖-乙醇平板能夠有效篩選到具有高乙醛脫氫酶活性的酵母菌[10]。

常壓室溫等離子體誘變(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)是近年來(lái)利用在大氣壓下產(chǎn)生的，溫度在25～40 ℃之間，具有高活性粒子濃度的等離子體射流的新型誘變技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、條件溫和、安全性高及誘變快速等優(yōu)良特性[11-12]。對(duì)啤酒酵母等真菌的誘變會(huì)比常規(guī)的紫外誘變效果更加明顯，且誘變菌能夠被用于食品行業(yè)的生產(chǎn)[13]。本研究以雙硫侖作為抑制劑結(jié)合ARTP誘變技術(shù)，對(duì)燕京啤酒提供的出發(fā)菌株進(jìn)行誘變和篩選，以期獲得發(fā)酵性能優(yōu)良的低產(chǎn)乙醛的啤酒酵母菌株，并能成功投入工業(yè)啤酒生產(chǎn)的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 啤酒酵母（）YJ，啤酒企業(yè)提供；啤酒酵母（）S48 ARTP誘變獲得。

1.1.2培養(yǎng)基 麥汁培養(yǎng)基：14 oP麥汁（糖化料水比為1∶4，糖化過(guò)程為：48 ℃, 30 min → 63 ℃, 60 min → 72 ℃, 30 min → 78 ℃, 10 min。

雙硫侖-乙醇培養(yǎng)基（g·L-1）：乙醇，20；雙硫侖，0.000 4；(NH4)2SO4，5；KH2PO4，1；NaCl， 0.1；MgSO4·7H2O，0.1；CaCl2，0.1；酵母膏，0.1；121 ℃滅菌 20 min。

酵母培養(yǎng)基（g·L-1）：酵母浸出粉，10；蛋白胨，20；葡萄糖，20；115 ℃滅菌15 min。

乙醛培養(yǎng)基（g·L-1）：(NH4)2SO4， 5；KH2PO4， 1；NaCl，0.1；MgSO4·7H2O，0.1；CaCl2，0.1；酵母膏，0.1；121 ℃滅菌 20 min，加乙醛0.1（膜過(guò)濾除菌后，加入滅菌后的培養(yǎng)基中）。

1.1.3試劑 麥芽，中糧集團(tuán)有限公司；酵母浸出粉、蛋白胨和瓊脂粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；無(wú)水葡萄糖、無(wú)水乙醇、(NH4)2SO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O和CaCl2國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醛(色譜純)，阿拉丁試劑(上海) 有限公司；3-庚酮(色譜純)，Sigma-Aldrich公司；雙硫侖，Alorich化學(xué)試劑公司；Alcohol Dehydrogenase Assay Kit，Bio Vision公司；乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測(cè)試劑盒，上海索萊寶生物科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)溶液包括乙醛和3-庚酮等。

1.1.4 儀器與設(shè)備 超凈臺(tái)(SW-CJ-2FD)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；高壓滅菌鍋(HVE-50)，日本Hirayama公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2000)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；顯微鏡(CX21FS1) ，日本Olympus公司；阿貝折光儀，上海豫光儀器有限公司；頂空氣相色譜儀(GC-2010)，日本島津(Shimadzu)公司；ARTP—II型常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)，無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(5804 R)，德國(guó)Eppendoff公司；磁力攪拌器(81-2) ，上海司樂(lè)儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱(SPX-250)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；電熱恒溫水浴鍋(HHS) ，生化培養(yǎng)箱(BSP-250)上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 啤酒發(fā)酵 用接種環(huán)挑取啤酒酵母菌株于10 mL 14 oP麥汁試管中，28 ℃培養(yǎng)36 h后轉(zhuǎn)接1 mL菌液于100 mL 14 oP麥汁三角瓶中（隨發(fā)酵體系的增大，種子液的培養(yǎng)量適當(dāng)增加），28 ℃培養(yǎng)36 h后放置22 ℃恒溫沉降6 h，再轉(zhuǎn)入15 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置6 h，取適量酵母泥接種至準(zhǔn)備好的麥汁三角瓶中，接種量約為1×107CFU·mL-1。搖勻后塞上發(fā)酵栓，用無(wú)菌水液封發(fā)酵栓后11 ℃發(fā)酵7 d。

1.2.2 ARTP誘變選育 從斜面上取啤酒酵母于10 mL酵母培養(yǎng)基(YPD)試管中活化，36 h后轉(zhuǎn)接1 mL菌液于100 mL YPD三角瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。取適量菌液于EP管中12 000 r·min-1離心1 min，棄上清后用生理鹽水洗滌，12 000 r·min-1離心1 min后重復(fù)洗滌離心1次，用生理鹽水稀釋至OD600為1，再將其進(jìn)一步稀釋10倍。

將10 μL稀釋好的菌液均勻涂布在ARTP載片上，以高純的氦氣作為ARTP的工作氣源，設(shè)置電源功率100 W，氣體流量10 SLM固定不變，調(diào)整好每個(gè)載片的誘變時(shí)間，等離子照射處理后將載片投入含有生理鹽水的EP管中，加入適量YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃震蕩培養(yǎng)1 h后涂布于相應(yīng)的平板上。

1.2.3 乙醛馴化 將誘變菌于10 mL YPD培養(yǎng)基中活化24 h后，取200 μL加入10 mL乙醛培養(yǎng)基中，18 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)72 h后取1 mL菌液至新一批乙醛培養(yǎng)基中繼續(xù)馴化，如此重復(fù)，持續(xù)轉(zhuǎn)接馴化。

1.2.4 乙醛含量的測(cè)定 采用頂空氣相色譜法測(cè)定啤酒發(fā)酵液中乙醛的含量[14]。將發(fā)酵液離心后取上清，在頂空瓶中分別添加4 mL發(fā)酵液，1 mL 30 mg·L-1的3-庚酮內(nèi)標(biāo)和1.8 g NaCl。檢測(cè)條件為：FID檢測(cè)器溫度為250 ℃；色譜柱初始溫度40 ℃，以10 ℃·min-1的速度升至180 ℃。

1.2.5 發(fā)酵液的理化指標(biāo)檢測(cè) 酒精度、原濃、發(fā)酵度、苦味值、雙乙酰、殘?zhí)?、總酸和pH等發(fā)酵液基本理化指標(biāo)的檢測(cè)均參照國(guó)標(biāo)（GB/T4928- 2008）啤酒分析方法進(jìn)行檢測(cè)[15]。

1.2.6 酵母細(xì)胞乙醛脫氫酶以及醇脫氫酶的酶活測(cè)定 發(fā)酵過(guò)程中，酵母細(xì)胞內(nèi)的乙醛脫氫酶酶活以及醇脫氫酶酶活采用相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定方法詳見(jiàn)Alcohol Dehydrogenase Assay Kit、Bio Vision、乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測(cè)試劑盒及索萊寶的使用說(shuō)明。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的啤酒酵母YJ進(jìn)行ARTP誘變選育，結(jié)果（圖1）顯示，隨著離子束照射時(shí)間的增長(zhǎng)，酵母細(xì)胞的存活率迅速下降：當(dāng)照射時(shí)間達(dá)到80 s以上時(shí)，酵母細(xì)胞存活率為零；處理時(shí)間為45 s左右，致死率為88.7%。因此我們選定啤酒酵母YJ進(jìn)行ARTP誘變的照射處理時(shí)間為45 s。

采用點(diǎn)樣法確定雙硫侖對(duì)YJ的致死濃度，結(jié)果（圖2）顯示，在梯度濃度的雙硫侖抑制劑平板上從左至右點(diǎn)樣，菌液濃度分別為107、106、105和104。ARTP誘變過(guò)程中，原始涂布于載片的菌液濃度為106，誘變結(jié)束后10 μL菌液在生理鹽水中稀釋至1 000 μL體系，菌液體系濃度降低為104。圖2(b)中平板上點(diǎn)樣濃度為104時(shí)，區(qū)域幾乎已無(wú)菌種生長(zhǎng)，達(dá)到抑制劑所需的致死率要求。最終選擇雙硫侖濃度0.3 mg·L-1為誘變菌篩選平板的抑制劑濃度。

圖1 ARTP誘變啤酒酵母YJ存活率曲線

Figure 1 Survival curve of beer yeast YJ after ARTP mutagenicity

注：圖（a）、（b）和（c）中的平板雙硫侖濃度分別為0.1、0.3和0.5 mg·L-1。

Figure 2 The growth of disulfiram gradient plates by spotting method

表 1 250 mL 14 oP麥汁三角瓶中菌種的產(chǎn)乙醛情況

將啤酒酵母菌株YJ在ARTP儀上誘變處理45 s后，培養(yǎng)1 h左右，稀釋涂布在抑制劑濃度為0.3 mg·L-1的雙硫侖-乙醇平板上，28 ℃培養(yǎng)5 d后，隨機(jī)選取了57株誘變菌進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。

2.2 三角瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.2.1 250 mL三角瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 將ARTP誘變獲得的57株誘變菌株以及出發(fā)菌株YJ接入250 mL 14 oP麥汁三角瓶中進(jìn)行第1批發(fā)酵篩選實(shí)驗(yàn)，在11 ℃恒溫培養(yǎng)條件下發(fā)酵7 d，結(jié)束后取樣，采用頂空氣相色譜法測(cè)定啤酒發(fā)酵液中乙醛的含量，每組兩個(gè)平行樣品，所得結(jié)果數(shù)據(jù)如表1所示。與出發(fā)菌株YJ發(fā)酵液中乙醛含量檢測(cè)結(jié)果相比，57株誘變菌株中，有44株菌株乙醛產(chǎn)量低于出發(fā)菌株，誘變菌株的正向突變率較高，約為77%。

2.2.2 500 mL三角瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 選取表1中發(fā)酵液乙醛含量較低的的10株誘變菌株（S6、S11、S14、S24、S45、S46、S47、S48、S52和S55）以及出發(fā)菌株YJ接入含有14 oP麥汁的500 mL三角瓶進(jìn)行第2批發(fā)酵篩選，相同條件發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測(cè)發(fā)酵液乙醛含量，結(jié)果如圖3(a)所示。第2批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的10株誘變菌株中，有8株誘變菌株的乙醛產(chǎn)量低于出發(fā)菌株，其中誘變菌株S47和S48的乙醛產(chǎn)量最低。

圖3 500 mL（a）以及3 L（b）三角瓶發(fā)酵產(chǎn)乙醛情況

Figure 3 Acetaldehyde production of 500 mL 14 oP wort (a) and 3 L 14 oP wort (b) fermentation

表2 3次三角瓶發(fā)酵篩選實(shí)驗(yàn)中YJ與S48的產(chǎn)乙醛情況對(duì)比

表3 成品酒理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（貯酒9 d）

2.2.3 3 L三角瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 研究進(jìn)一步選取S47以及S48進(jìn)行第3批3 L 14 oP麥汁三角瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3(b)所示，誘變菌株S47和S48的發(fā)酵液中乙醛含量較出發(fā)菌株分別降低了18.50%和24.37%。因此，最終選擇誘變菌株S48進(jìn)行工廠小試。

表4 成品酒主要風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果（貯酒9 d）

啤酒發(fā)酵過(guò)程中，乙醛在主發(fā)酵3 d左右大量產(chǎn)生，由于酵母數(shù)量的急劇增加，代謝旺盛，乙醛大量積累而達(dá)到峰值，但隨著發(fā)酵的繼續(xù)，罐內(nèi)壓力升高，乙醛含量急劇下降。發(fā)酵結(jié)束后的乙醛的含量受麥汁質(zhì)量、溶氧量、酵母細(xì)胞數(shù)及后發(fā)酵過(guò)程代謝等眾多因素的影響，因此無(wú)法根據(jù)絕對(duì)值判斷誘變菌株的降乙醛能力，需要通過(guò)與出發(fā)菌株比較的相對(duì)值來(lái)判斷[16-17]。如表2所示，在3次發(fā)酵篩選實(shí)驗(yàn)中，不同批次的發(fā)酵液乙醛絕對(duì)值均出現(xiàn)波動(dòng)情況，隨著發(fā)酵體系的放大，誘變菌株S48降低乙醛的能力也有所減弱，這是由于放大過(guò)程十分復(fù)雜，比上游篩選工作所涵蓋的內(nèi)容體量更大，需要綜合更多的因素加以考慮。

2.3 生產(chǎn)小試

2.3.1 成品酒理化指標(biāo)檢測(cè) 工廠小試發(fā)酵結(jié)束后貯酒9 d的成品酒理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示，在誘變菌株S48在原麥汁濃度略低于出發(fā)菌株的情況下，酒精度稍有增加，發(fā)酵性能有所提升。與此同時(shí)，誘變菌株的苦味值、總酸及殘?zhí)橇慷悸杂邢陆?，下降比例分別為7.9%、12.3%和54.6%，酒體的口感更加協(xié)調(diào)。雙乙酰的含量較出發(fā)菌株降低了25%。由于雙乙酰含量與乙醛代謝有著密切的關(guān)聯(lián)，一定條件下可以直接由活性乙醛在乙酰輔酶的作用下縮合而成，其含量的減少也一定程度反映出了誘變菌株乙醛還原能力的提升[18]。

圖4 感官分析雷達(dá)圖（貯酒11 d)

Figure 4 Radar chart of sensory analysis (storage for 11 days)

表5 回收酵母泥的主要性能對(duì)比

2.3.2 成品酒主要風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè) 進(jìn)一步對(duì)成品酒中醛類(lèi)、酯類(lèi)和醇類(lèi)主要風(fēng)味物質(zhì)組分進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果（表4）顯示：與出發(fā)菌株YJ相比，誘變菌株S48的成品酒（貯酒9 d）樣品中，乙醛含量降低約23.69%，這表明誘變菌株的乙醛還原能力的確獲得了良好的提升，在100 L的發(fā)酵體系中依舊能保持穩(wěn)定的低產(chǎn)乙醛性能。此外，高級(jí)醇和揮發(fā)酯兩大類(lèi)物質(zhì)是啤酒的重要風(fēng)味成分，高級(jí)醇含量應(yīng)控制在100 mg·L-1以下，含量過(guò)高容易引起“上頭”等不良生理反應(yīng)[19]。與出發(fā)菌株相比，誘變菌株發(fā)酵液中，總醇含量降低了15.04%，乙醇含量略有增加，正丙醇、異丁醇和異戊醇等含量均有所降低，說(shuō)明在未減少乙醇產(chǎn)量的同時(shí)，普遍降低了發(fā)酵液中的高級(jí)醇含量；另一方面，總酯的含量無(wú)較大差異，因此誘變菌株S48發(fā)酵的成品啤酒中的醇酯比出發(fā)菌株降低了15%。

辛酸乙酯具有白蘭地酒香味特征，S48的成品酒發(fā)酵液中辛酸乙酯含量升高了40.74%，在增加啤酒的特征香氣方面有一定的幫助[20]。

2.3.3 成品酒感官分析 感官分析雷達(dá)圖將科學(xué)模型與感官特性相結(jié)合，使用心理物理模型以綜合評(píng)價(jià)酒體的感官體驗(yàn)[21]。圖4為7位專(zhuān)業(yè)國(guó)家級(jí)品評(píng)人員對(duì)貯酒11 d的出發(fā)菌株YJ以及誘變菌S48兩款成品酒的感官評(píng)分雷達(dá)圖。由圖4可以看出：S48的麥芽香、酒花香和甜味得分略高于YJ，高級(jí)醇味略明顯，殺口感弱于出發(fā)菌株YJ；異味方面，兩組均存在硫味，但S48的硫味不及YJ明顯。因此，S48的成品酒感官評(píng)定綜合結(jié)果更加良好。

2.3.4 回收酵母泥的主要性能對(duì)比 從理論上講，發(fā)酵性能良好的酵母泥，可一直使用多代。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，由于酵母菌種本身的變化及外界微生物的污染，隨著酵母使用代數(shù)的增加，其發(fā)酵性能和活力等會(huì)有所降低，而死亡率、衰老比例等會(huì)有所上升[22]。一般啤酒廠的優(yōu)良菌種回收的酵母泥需控制在能連續(xù)使用5～7代[23]。

表5展示了YJ以及S48兩組酵母泥的主要性能對(duì)比數(shù)據(jù)。由表5可以看出，兩者的電導(dǎo)率和活力無(wú)顯著性差異，誘變菌株S48酵母泥的死亡率和衰老比例顯著低于出發(fā)菌株YJ，分別降低了53.3%及46.6%。另外，S48的自溶系數(shù)較大，表明其自溶程度較低。在凝聚性方面，S48僅為1.35%，顯著低于YJ（64.88%）。啤酒酵母產(chǎn)生乙醛的能力與凝聚性的關(guān)系尚未有研究說(shuō)明，后續(xù)將進(jìn)一步探究。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中代謝關(guān)鍵酶的酶活檢測(cè)

在啤酒的發(fā)酵過(guò)程中，啤酒酵母消耗葡萄糖、麥芽糖等碳源產(chǎn)生的丙酮酸，一部分轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)，另一部分經(jīng)丙酮酸脫羧酶催化生成乙醛。乙醛脫氫酶以及乙醇脫氫酶是乙醛代謝的關(guān)鍵酶，能分別將乙醛還原為乙酸和乙醇。雙硫侖能夠有效抑制乙醛脫氫酶的活性，篩選所得誘變菌理論上應(yīng)具有較高的乙醛脫氫酶酶活，因此我們跟蹤檢測(cè)了發(fā)酵過(guò)程中的乙醛脫氫酶以及醇脫氫酶的活性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）可知，出發(fā)菌以及誘變菌的醇脫氫酶活性水平基本一致，在發(fā)酵后期S48略高于YJ，而S48的乙醛脫氫酶活性始終高于YJ，且在發(fā)酵第3至第4天的活性較高，符合發(fā)酵過(guò)程中乙醛含量先增加后減少的趨勢(shì)，體現(xiàn)出了雙硫侖作為低產(chǎn)乙醛啤酒酵母篩選抑制劑的有效性。

2.5 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

傳統(tǒng)誘變方法選育獲得的菌株易為發(fā)生優(yōu)勢(shì)性狀的回復(fù)突變，其穩(wěn)定性需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的針對(duì)性馴化實(shí)驗(yàn)和適宜的保藏方法來(lái)維持。研究對(duì)S48進(jìn)行了3個(gè)月的乙醛馴化實(shí)驗(yàn)，連續(xù)傳代30次后，分別取第0、第5、第10、第15、第20、第25和第30代進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。其乙醛檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，經(jīng)過(guò)多次傳代后，菌株S48和YJ的乙醛產(chǎn)量分別穩(wěn)定在9.84和14.92 mg·L-1，相對(duì)出發(fā)菌株YJ, S48乙醛產(chǎn)量能維持在降低34%左右，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中醇脫氫酶(a)以及乙醛脫氫酶酶活情況(b)

Figure 5 Enzyme activities of alcohol dehydrogenase (a) and acetaldehyde dehydrogenase (b) during fermentation

圖6 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)產(chǎn)乙醛情況

Figure 6 Acetaldehyde production in genetic stability experiments

3 討論與結(jié)論

如何降低發(fā)酵液中的乙醛含量一直是困擾啤酒行業(yè)的重要問(wèn)題，而啤酒酵母對(duì)乙醛代謝起著至關(guān)重要的作用[24]。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展及啤酒酵母基因組的不斷闡明，目前已經(jīng)有大量的研究采用各類(lèi)分子手段、逆向代謝工程等方法揭示了啤酒酵母低產(chǎn)乙醛的機(jī)理，但在啤酒行業(yè)的實(shí)際應(yīng)用方面還存在許多問(wèn)題[25]。本文采用ARTP的方法，以雙硫侖作為篩選抑制劑，對(duì)一株工業(yè)化大生產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變處理后，通過(guò)多次搖瓶發(fā)酵篩選得到的誘變菌株S48，在提高酵母細(xì)胞內(nèi)乙醛脫氫酶的活性，降低發(fā)酵液乙醛含量的同時(shí)改善了其他風(fēng)味物質(zhì)的代謝及啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的乙醛馴化后，其優(yōu)勢(shì)性狀基本達(dá)到穩(wěn)定遺傳狀態(tài)，在啤酒的工業(yè)化生產(chǎn)上有著廣闊的應(yīng)用前景。

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Screening of low-acetaldehyde beer yeast with flavor advantages

GUAN Yu1, 2, LIU Chunfeng1, 2, LI Qi1, 2, HE Xiuli3, XIE Xin3, GUO Liyun3, WANG Jinjing1, 2

(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122; 2. Lab of Brewing Science and Technology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122; 3. Key Laboratory of Brewing Technology in Beijing, Technology Center, Beijing Yanjing Beer Co., Ltd., Beijing 101300)

Acetaldehyde is mainly produced by yeast during beer fermentation, and its modi?cation greatly a?ects beer ?avor and quality. There are a lot of researches about the relationship between low-level acetaldehyde beer and yeast, however, due to the food safety, none of them have been applied to industrial beer production yet. In this study, we mutated the parent strainYJ provided by beer company via ARTP (Atmospheric and room temperature plasma) and used a resistant plate combining disulfiram and ethanol to do the first round screening. Later, we selected the mutant strain S48 by several times of different flask fermentation. Compare with the parent strain, mutant strain (S48) lowered the amount of acetaldehyde by 23.69%, while alcohol was stronger, amaroid, total acid and diacetyl were lower in the factory fermentation tests. The flavor of fermentation liquor was better, and the alcohol with ester was more regulated.

yeast; acetaldehyde; ARTP; disulfiram; beer

TQ926.1; TS261.11

A

1672-352X (2021)03-0511-07

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.005

2021-7-7 10:45:03

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1641.010.html

2020-09-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31601558,315571942）資助。

官 鈺，碩士研究生。E-mail：1020616115@vip.jiangnan.edu.cn

王金晶，副教授。E-mail：jjwang@jiangnan.edu.cn