5種有機(jī)溶劑對(duì)紅火蟻的毒力

龐杏燕，陶秋紅，李綺婷，張富春，陸永躍，王 磊

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)紅火蟻研究中心，廣州 510642)

紅火蟻SolenopsisinvictaBuren是一種對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)、公共安全、生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成嚴(yán)重為害的重大入侵害蟲(chóng)，目前已經(jīng)入侵了美國(guó)、澳大利亞、中國(guó)等國(guó)家和地區(qū)(Global Invasive Species Information System, 2019)。2003年在臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)紅火蟻為害后，該害蟲(chóng)在我國(guó)迅速蔓延，目前已經(jīng)入侵了臺(tái)灣、海南、香港、澳門(mén)、廣東、廣西、福建、云南、貴州、四川、重慶、江西、湖南、福建、浙江、湖北等16個(gè)省(直轄市、自治區(qū)、特別行政區(qū))的390余個(gè)縣區(qū)(Wangetal., 2020)。

化學(xué)防治是紅火蟻防治的主要手段，篩選對(duì)紅火蟻高效且對(duì)環(huán)境更友好的藥劑是國(guó)內(nèi)外科研工作者的研究重點(diǎn)。例如，科研工作者開(kāi)展了包括蟻酸、微紅新月蕨甲醇提取物、圓柚油、青蒿油等生物源物質(zhì)和氟啶蟲(chóng)胺腈、增味劑等新型低毒化學(xué)藥劑對(duì)紅火蟻的毒力篩選工作(Chenetal., 2012; Zhangetal., 2014; Huangetal., 2016; Addessoetal., 2017; Panetal., 2017; Huangetal., 2018; Zhuetal., 2018; Chenetal., 2019)。紅火蟻的防治藥劑根據(jù)作用方式可分為觸殺型和胃毒型，其中胃毒性毒餌具有應(yīng)用范圍廣、使用方便、能殺死蟻群的大部分個(gè)體等優(yōu)點(diǎn)，是紅火蟻藥劑開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)方向(劉杰等, 2006)。

化學(xué)藥劑的原藥大都不溶于水或者微溶于水，一般需要借助于助溶劑才能開(kāi)展相關(guān)藥劑的胃毒毒力測(cè)試。有報(bào)道顯示，丙酮、吐溫20、二甲基亞砜、Triton X100等實(shí)驗(yàn)室常用的助溶劑對(duì)部分微生物和節(jié)肢動(dòng)物有一定的毒性(Bowmanetal., 1981; Leblanc & Surprenant, 1983; Stratton, 1985; Ravindranetal., 2011)。因此在測(cè)試藥劑對(duì)紅火蟻胃毒作用前，首先要篩選出對(duì)紅火蟻沒(méi)有或者微毒的助溶劑，以保證助溶劑的存在不會(huì)影響到藥劑胃毒的測(cè)試結(jié)果。本文測(cè)試了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常用的助溶劑丙酮、吐溫20、吐溫80、二甲基亞砜和Triton X100在不同劑量下對(duì)紅火蟻的毒力，隨后評(píng)估了不同劑量下助溶劑對(duì)紅火蟻存活、取食和活動(dòng)能力的影響，明確常用的助溶劑對(duì)紅火蟻毒力和行為的影響，以期篩選出適合的助溶劑用于藥劑對(duì)紅火蟻胃毒毒力的篩選工作。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)和化學(xué)藥劑

紅火蟻采集于廣州市從化區(qū)。蟻巢從野外采回后，使用水滴法分離并獲得紅火蟻蟻群(Chen, 2007)。蟻群飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)紅火蟻研究中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，實(shí)驗(yàn)室條件為26±2℃和相對(duì)濕度60%±5%。使用冰凍蝗蟲(chóng)、純水和10%糖水飼喂蟻群。

助溶劑丙酮(>99.5%，天津市百世化工有限公司，天津)、二甲基亞砜(>99%，天津市大茂化學(xué)試劑廠，天津)、吐溫80(>99.5%，天津市百世化工有限公司，天津)、吐溫20(>99.5%，天津市大茂化學(xué)試劑廠，天津)、Triton X100(上海佰曄生物科技中心，上海)購(gòu)自廣州天河精科化玻儀器批發(fā)部。

1.2 五種助溶劑對(duì)紅火蟻毒力及其對(duì)工蟻取食量的影響

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇測(cè)試的濃度為2%和10%的丙酮糖水溶液、濃度為1%和5%的二甲基亞砜糖水溶液、濃度為2%和10%的吐溫80糖水溶液、濃度為1%和5%的吐溫20糖水溶液和濃度為2%和10%的Triton X100糖水溶液。溶液配制方法為將助溶劑混入到10%糖水溶液配置成相應(yīng)體積比的糖水溶液，使用配制好的溶液飼喂紅火蟻。使用10%糖水作為對(duì)照。試驗(yàn)前將紅火蟻蟻群饑餓處理24 h，然后每個(gè)濃度處理飼喂2 g工蟻蟻群(約2 000頭工蟻)，記錄每天糖水的消耗量，連續(xù)觀察記錄3 d，每天更換當(dāng)天配制的藥劑，同時(shí)稱量蟻群的重量。在相同條件下沒(méi)有紅火蟻的盒子放置對(duì)應(yīng)濃度的糖水，計(jì)算溶液的蒸發(fā)消耗量。糖水消耗量減去糖水蒸發(fā)量計(jì)算蟻群每天的實(shí)際糖水消耗量。糖水消耗量記錄處理后3 d的，蟻群存活情況記錄處理后前兩天的。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2個(gè)蟻巢。

1.3 丙酮和二甲基亞砜對(duì)紅火蟻存活及行動(dòng)能力的影響

根據(jù)試驗(yàn)1.2中的結(jié)果，選擇處理3 d后不會(huì)引起紅火蟻工蟻明顯死亡和明顯拒食的助溶劑，進(jìn)一步測(cè)試其處理10 d對(duì)蟻群存活及紅火蟻攀附能力和爬行速度的影響。試驗(yàn)前將紅火蟻蟻群饑餓處理24 h。選擇測(cè)試的藥劑及其濃度分別為：2%丙酮糖水溶液、10%丙酮糖水溶液和1%二甲基亞砜糖水溶液。使用10%糖水作為對(duì)照。因?yàn)榕矢侥芰团佬兴俣葴y(cè)試將用去一部分工蟻，因此此試驗(yàn)分成兩部分開(kāi)展。第一部分蟻群重量變化試驗(yàn)，選取從蟻巢內(nèi)稱取5 g工蟻蟻群(約5 000頭工蟻)，使用2%丙酮飼喂，每天更換當(dāng)天配制的藥劑，重復(fù)3次。從相同蟻巢取出5 g工蟻使用10%糖水飼喂作為對(duì)照。10%丙酮溶液和1%二甲基亞砜溶液的測(cè)試方法與之相同。整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2個(gè)蟻巢。第二部分攀附能力和爬行速度測(cè)試試驗(yàn)，2%丙酮糖水溶液、10%丙酮糖水溶液、1%二甲基亞砜糖水溶液、10%糖水每個(gè)濃度處理飼喂3 g工蟻蟻群(約3 000頭工蟻)，每天更換當(dāng)天配制的藥劑。分別在飼喂4 d、7 d、10 d后測(cè)定工蟻的攀附能力和爬行速度。紅火蟻工蟻在正常情況下可以攀附于物體上，即使在倒置情況下也很少掉落，因此可使用攀附能力測(cè)定藥劑對(duì)紅火蟻的毒力。攀附能力和爬行速度觀察計(jì)算方法參考肖春霞等(2018)。將30頭工蟻均勻分布于塑料杯底(杯底7.0 cm，杯口9.0 cm，高度5.3 cm)，靜置10 s后，將塑料杯輕輕倒扣于桌面，計(jì)算3 s內(nèi)掉落的工蟻數(shù)，計(jì)算工蟻的攀附率，每個(gè)處理3次重復(fù)。攀附率計(jì)算公式為工蟻攀附率(%)=[(測(cè)試工蟻數(shù)-掉落工蟻數(shù))/測(cè)試工蟻數(shù)]×100。從蟻巢內(nèi)隨機(jī)選取工蟻，然后將其放置于坐標(biāo)紙中間，拍攝紅火蟻爬行視頻，工蟻連續(xù)爬行3 s以上的確定其具有爬行能力，測(cè)量具有爬行能力的工蟻3 s所走過(guò)的路程，測(cè)算爬行速度，每個(gè)重復(fù)30頭工蟻。爬行速度=爬行路程/爬行時(shí)間。每個(gè)濃度重復(fù)3次，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2個(gè)蟻巢。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用One-Sample Kolmogorov-Smirnov test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的使用Levene’s test進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。對(duì)于方差齊性的，使用單因素方差分析，并使用LSD test進(jìn)行多重比較。對(duì)于不符合正態(tài)分布和方差不齊的，先使用Kruskal-Wallis test進(jìn)行檢驗(yàn)，如果總體P值小于0.05，使用Mann-Whitney U test進(jìn)行兩兩比較。10 d內(nèi)的蟻群死亡率比較使用了獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)分析程序運(yùn)行于SPSS 18.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種助溶劑對(duì)紅火蟻蟻群毒力測(cè)定

不同濃度的丙酮、二甲基亞砜、吐溫20、吐溫80和Triton X100處理對(duì)紅火蟻的存活情況的影響如圖1所示。研究顯示在處理1d后，5%二甲基亞砜處理的蟻群的存活率顯著低于對(duì)照(圖1-A，Mann-Whitney test，U=2，P=0.01)，處理2 d后，5%二甲基亞砜處理的蟻群的存活率顯著低于對(duì)照(圖1-A，Mann-Whitney test，U=0，P=0.004)，而10%丙酮處理的存活率顯著高于對(duì)照(圖1-A，Mann-Whitney test，U=0，P=0.004)。

處理1 d后，1%吐溫20的存活率顯著高于對(duì)照(圖1-B，Mann-Whitney test，U=2，P=0.01)，處理2 d后，1%吐溫20、5%吐溫20、2%吐溫80、10%吐溫80的存活率與對(duì)照差異不顯著(圖1-B，Kruskal-Wallis test，χ2=9.819，df=4，P=0.044)。

處理1 d后和2 d后，2% Triton X100和10% Triton X100的存活率均顯著低于對(duì)照(圖1-C，第1天，Kruskal-Wallis test，χ2=11.656，df=2，P=0.003；第2天，LSD test，F(xiàn)=21.404，df=2，P<0.0001)。

圖1 5種助溶劑不同濃度下紅火蟻的存活率Fig.1 Survival rate of Solenopsis invicta fed with different concentrations of 5 diluents注：“*”表示處理與對(duì)照差異顯著，P<0.05。下圖同。Note:“*” indicated significant differences between the treatment and the control, P<0.05.The same below.

2.2 5種助溶劑對(duì)紅火蟻取食行為的影響

不同濃度的丙酮、二甲基亞砜、吐溫20、吐溫80和Triton X100處理對(duì)紅火蟻的取食情況的影響如圖2所示。處理1 d后，5%二甲基亞砜處理的蟻群的取食量顯著低于對(duì)照，2%和10%丙酮處理的蟻群取食量顯著高于對(duì)照(圖2-A，LSD test，F(xiàn)=15.722，df=4，P<0.0001)；處理2 d后，2%丙酮、10%丙酮、1%二甲基亞砜和5%二甲基亞砜處理的蟻群取食量與對(duì)照差異不顯著(圖2-A，LSD test，F(xiàn)=1.098，df=4，P=0.379)。

圖2 5種助溶劑不同濃度下紅火蟻的取食量Fig.2 Sugar water consumption of Solenopsis invicta fed with different concentrations of 5 diluents

處理1 d后，10%吐溫80處理的蟻群的取食量顯著低于對(duì)照(圖2-B，Mann-Whitney test，U=3，P=0.016)；處理2 d后，1%吐溫20、5%吐溫20、2%吐溫80和10%吐溫80處理的蟻群取食量均與對(duì)照差異顯著(圖2-B，Mann-Whitney test，1%吐溫20：U=0.5，P=0.005；5%吐溫20：U=0，P=0.004；2%吐溫80：U=4，P=0.025；10%吐溫80：U=5，P=0.037)。處理3 d后，5%吐溫20和2%吐溫80處理的蟻群的取食量顯著低于對(duì)照(圖2-B，Mann-Whitney test，5%吐溫20：U=1，P=0.006；2%吐溫80：U=1，P=0.006)。

處理1 d后和3 d后，2% Triton X100和10% Triton X100處理的蟻群取食量均顯著低于對(duì)照(圖2-C，第1天，Kruskal-Wallis test，χ2=12.012，df=2，P=0.002；第3天，LSD test，F(xiàn)=7.844，df=4，P=0.005)。

2.3 不同濃度丙酮和二甲基亞砜處理對(duì)紅火蟻存活的影響

2%丙酮、10%丙酮和1%二甲基亞砜處理10 d內(nèi)對(duì)紅火蟻的死亡率影響情況如圖3所示。研究顯示,2%丙酮處理的工蟻死亡率與對(duì)照差異不顯著(圖3-A，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，第4天，t=2.119，df=10，P=0.063；第7天，t=1.623，df=10，P=0.136；第10天，t=1.933，df=10，P=0.08)。10%丙酮處理的工蟻死亡率與對(duì)照也差異不顯著(圖3-B，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，第4天，t=-0.262，df=10，P=0.799；第7天，t=0.045，df=10，P=0.965；第10天，t=0.165，df=10，P=0.872)。1%二甲基亞砜處理的工蟻死亡率顯著高于對(duì)照處理(圖3-C，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，第4天，t=10.477，df=10，P<0.001；第7天，t=6.5，df=10，P<0.001；第10天，t=5.444，df=5，P=0.003)。

圖3 丙酮和二甲基亞砜處理對(duì)紅火蟻蟻群死亡率的影響Fig.3 Mortality rate of Solenopsis invicta fed with acetone and DMSO

2.4 不同濃度丙酮和二甲基亞砜對(duì)紅火蟻行動(dòng)能力的影響

丙酮和二甲基亞砜處理對(duì)紅火蟻攀附能力和爬行速度影響的結(jié)果如圖4所示。2%丙酮和10%丙酮處理的紅火蟻工蟻攀附率在第4天、第7天和第10天與對(duì)照差異不顯著(圖4-A，第4天，Kruskal-Wallis test，χ2=5.713，df=3，P=0.126；第7天，LSD test，F(xiàn)3,1=3.194，P=0.046；第10天，LSD test，F(xiàn)2,1=1.306，P=0.300)。1%二甲基亞砜處理的紅火蟻工蟻攀附率在第4天和第7天與對(duì)照差異不顯著(圖4-A，第4天，Kruskal-Wallis test，χ2=5.713，df=3，P=0.126；第7天，LSD test，F(xiàn)3,1=3.194，P=0.046)。處理后第10天，二甲基亞砜處理的工蟻死亡較多，無(wú)足夠多的工蟻供測(cè)試。

圖4 丙酮和二甲基亞砜處理對(duì)紅火蟻的攀附率和爬行速度的影響Fig.4 Arrest rate and walking speed of Solenopsis invicta fed with acetone and DMSO

2%丙酮和10%丙酮處理的紅火蟻工蟻爬行速度在第4天、第7天和第10天與對(duì)照差異不顯著。在處理后第4天，1%二甲基亞砜處理的紅火蟻工蟻爬行速度顯著高于對(duì)照(圖4-B，Mann-Whitney test，U=1371，P=0.024)。處理后第10天，二甲基亞砜處理的工蟻死亡較多，無(wú)足夠多的工蟻供測(cè)試。

3 結(jié)論與討論

本研究測(cè)試了丙酮、吐溫20、吐溫80、二甲基亞砜和Triton X100等室內(nèi)常用的助溶劑在不同劑量下對(duì)紅火蟻存活、取食和運(yùn)動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)2%丙酮和10%丙酮不會(huì)顯著影響紅火蟻的存活、取食和運(yùn)動(dòng)，可以作為紅火蟻胃毒藥劑篩選試驗(yàn)的助溶劑。

丙酮、吐溫20、二甲基亞砜、Triton X100等實(shí)驗(yàn)室常用的助溶劑對(duì)部分微生物和節(jié)肢動(dòng)物有一定的毒性(Bowmanetal., 1981; Leblanc & Surprenant, 1983; Stratton, 1985; Ravindranetal., 2011)。本研究發(fā)現(xiàn)，吐溫20、吐溫80、二甲基亞砜、Triton X100在較低濃度下(1%或2%)對(duì)紅火蟻也具有一定的胃毒毒性或抑制取食能力，這與前人對(duì)其他節(jié)肢動(dòng)物的報(bào)道一致。Leblanc & Surprenant(1983)發(fā)現(xiàn)丙酮對(duì)大型蚤48 h的LC50是3.9%，本研究發(fā)現(xiàn)10%丙酮對(duì)紅火蟻的死亡率沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明不同的節(jié)肢動(dòng)物對(duì)丙酮的耐受能力是不同的。吐溫20和Triton X100對(duì)蜱蟲(chóng)Rhipicephalus(Boophilus)annulatus的成蟲(chóng)影響較小，但是對(duì)卵的孵化有較強(qiáng)的抑制作用(Ravindranetal.,2011)。吐溫20、吐溫80、二甲基亞砜、Triton X100對(duì)紅火蟻的觸殺情況如何還需要進(jìn)一步研究。

2%丙酮、10%丙酮和1%二甲基亞砜處理10 d后，無(wú)論是對(duì)照還是3種不同濃度溶劑處理，蟻群的死亡率均超過(guò)了80%。其可能原因是因?yàn)槲浵仜](méi)有獲得充足的營(yíng)養(yǎng)造成的。糖分、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是紅火蟻的必須營(yíng)養(yǎng)成分(Porteretal., 2015)。本試驗(yàn)為測(cè)試溶劑的作用，僅提供了含有助溶劑的糖水，導(dǎo)致蟻群的無(wú)法獲取足夠的營(yíng)養(yǎng)成分，而紅火蟻的平均壽命約為62 d(Wangetal., 2016)。因此，在處理10 d后，即使是對(duì)照也出現(xiàn)較高死亡率。