紅蜻稚蟲對浙江省不同類型水體污染的抗逆性適應(yīng)表現(xiàn)

俞玲園，季政權(quán)，胡耀文，徐風(fēng)嬌，王琪瑋，魏 瑩，唐 斌，王世貴

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州市動物適應(yīng)與進化重點實驗室，杭州 310036)

水體污染一直是人們關(guān)注的焦點問題，其中尤以重金屬污染為重。重金屬污染不僅加速了生態(tài)環(huán)境的破壞，同時給生物多樣性造成了巨大的不利影響(何佳等, 2019)，水體重金屬污染監(jiān)測與治理值得深入研究。水生昆蟲包括雙翅目、蜉蝣目、襀翅目、毛翅目、蜻蜓目等種類，它們對水體污染響應(yīng)比較敏感，被廣泛用來監(jiān)測和評價水質(zhì)，是水質(zhì)生物監(jiān)測的主要指示生物(Briers and Biggs, 2003；Yoshimura and Maeto, 2004；李金國等, 2007；Jeremiasonetal., 2016)。我國在上世紀 70-80年代開始探索利用包括搖蚊等水生昆蟲在內(nèi)的底棲無脊椎動物多樣性指數(shù)等來評價河湖水質(zhì)狀況(劉保元等, 1981；杞桑, 1986)，其后利用水生昆蟲對多條河流的水質(zhì)污染進行了評估(楊蓮芳等, 1992；童曉立和胡慧建, 1995；何佳等, 2019)。

除了利用水生昆蟲群落結(jié)構(gòu)及多樣性進行水質(zhì)評價外，水生昆蟲的生理響應(yīng)指標也可以反映水體污染的程度，如抗氧化酶、P450解毒酶和熱激蛋白等?？寡趸赴ǔ趸锲缁?SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等(Lushchak, 2011)，在活性氧的清除及機體的保護性防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。重金屬離子、化學(xué)農(nóng)藥、石油等物質(zhì)會影響或阻斷呼吸鏈、電子傳遞鏈、酶促反應(yīng)等體內(nèi)正常細胞的代謝，誘發(fā)活性氧自由基的產(chǎn)生(Reactive oxygen species, ROS)，活性氧自由基包括羥自由基(HO·)、羥過氧自由基(HO2·)、超氧陰離子(O2·-)、一氧化氮自由基(NO·)、過氧化氫(H2O2)和次氯酸(HClO)等(Jacob, 1995)，為了減少活性氧自由基對機體造成的損害，機體通過增加抗氧化酶的活性以維持活性氧自由基在體內(nèi)的平衡，從而減少氧化損傷(Slaninovaetal., 2009；Lushchak, 2011)。

熱激蛋白70(Heat Shock Protein 70，HSP70)和熱激蛋白90(Heat Shock Protein 90，HSP90)是熱激蛋白家族中最保守、最重要的兩種(馬晨曦等, 2013)。HSP70和HSP90在昆蟲抗逆境中的作用受到廣泛關(guān)注，不僅在熱應(yīng)激的條件下對細胞有保護作用，在很多外源刺激(環(huán)境污染、農(nóng)藥、重金屬等)下，都可以誘導(dǎo)生物體內(nèi)HSP70和HSP90的大量合成與積累，在細胞應(yīng)激后反應(yīng)最明顯，在維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和提高細胞對應(yīng)激原的耐受性中發(fā)揮重要作用(Limetal., 2005；楊靜等, 2017)。HSP70和HSP90能被重金屬離子誘導(dǎo)合成，而且這種誘導(dǎo)與重金屬的濃度具有相關(guān)性，其表達量可以反映環(huán)境中的重金屬含量水平(李鑄衡, 2014)。多項研究表明HSP70和HSP90表達上調(diào)可作為某些重金屬污染的生物標志(喻瀟, 2013)，可作為水體污染的檢測指標(張令要, 2008)。

細胞色素P450(Cytochrome P450，P450)是一個古老的基因超家族(Nelsonetal., 1993)，參與內(nèi)源性物質(zhì)和包括藥物、毒素、環(huán)境污染在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝，它的一個重要特征是它的可誘導(dǎo)性(Nelsonetal., 1993；Werck-Reichhart and Feyereisen, 2000)。細胞色素P450酶活性是一種便捷的污染物毒性評價機制和早期監(jiān)測模型，通過研究污染物對生物體的毒性傷害和生物體早期所表現(xiàn)出的藥物對細胞水平生物標記物的誘導(dǎo)狀況之間的關(guān)系，并以毒性傷害為污染物的毒性評判標準，確定污染物與酶活力之間的量效關(guān)系，從而判斷污染物在環(huán)境中的毒性及其殘留量(Forkertetal., 1988；Okey, 1990)。

蜻蜓目昆蟲分布十分廣泛，其生活史特征獨特，稚蟲常棲息于水中砂粒、泥水或水草間，取食水中的小動物，是典型的水生昆蟲，被視為非常適合作為研究水生昆蟲與水體質(zhì)量關(guān)系的模式昆蟲(Jeremiasonetal., 2016)，如長葉異痣蟌Ischnuraelegans對水體重金屬Hg、Cd和Pb有明顯的富集作用(席玉英和韓鳳英, 2000；韓鳳英和席玉英, 2001；韓鳳英等, 2002)。因此，研究蜻蜓幼蟲對水體污染的生物指示作用有著重要意義。本文以浙江地區(qū)普遍存在的紅蜻Crocothemisservilia作為試驗對象，分別對浙江杭州、紹興等地不同污染類型水域中的紅蜻稚蟲進行調(diào)查取樣，對紅蜻稚蟲的SOD、CAT酶活力以及HSP70、HSP90和P450家族CYP303a1的表達水平進行比較分析，結(jié)合水體質(zhì)量各項理化指標的測定，分析水體理化指標及重金屬含量對蜻蜓稚蟲的影響，明確其響應(yīng)重金屬污染脅迫的抗逆性適應(yīng)表現(xiàn)及潛在機制，為利用蜻蜓稚蟲作為水質(zhì)監(jiān)測的生物指示物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點布設(shè)與樣品采集

采樣點的布設(shè)主要考慮了浙江省內(nèi)不同地區(qū)的污染狀況，如杭州、紹興和寧波工業(yè)廢水排放嚴重，是浙江省工業(yè)廢水排放的主要區(qū)域(蔡臨明, 1999)。皮革加工業(yè)、紡織業(yè)和塑料制品業(yè)等第二產(chǎn)業(yè)是溫州市的支柱，企業(yè)生產(chǎn)工藝落后是水體污染主要污染來源(徐越等, 2014)。高耗能、高排放的粗放型生產(chǎn)企業(yè)使寧波市的河流及其他水均受到不同程度的污染，其工業(yè)區(qū)更是使水體污染嚴重(王桂林等, 2008；周正勇, 2016)。紹興市水污染主要為有機污染, 以印染為主(祁華寶和魯玉龍, 1995；陳昕和章科鋒, 2009)。臺州地區(qū)是國內(nèi)電子產(chǎn)品拆解中心的典型，其造成的重金屬污染已處于較高水平(潘海燕等, 2015)?；诖耍敬握{(diào)查分別在浙江省內(nèi)的杭州市下沙高教園區(qū)杭州師范大學(xué)下沙校區(qū)鴿子湖(N30°19′11″, E120°23′17″)、溫州市平陽縣水頭鎮(zhèn)下林村河道(N27°38′44″, E120°20′22″)、臺州市臨海區(qū)下沙周村河道(N28°53′32.1″, E121°13′21.1″)、紹興柯橋安昌街道九鼎村河道(N30°10′3″, E120°28′19″)和寧波市鎮(zhèn)海區(qū)駱駝街道英雄河(N29°58′59.1″, E121°33′33.8″)等5個地區(qū)選取一處較大的水體作為采樣地點。

采樣時間為2016年7月中旬和2018年8月中旬。采樣時第一時間測取各采樣點水體的物理指標(水溫、壓強、電導(dǎo)率EC、氧化還原電位Eh、pH、溶解氧DO)，并用2.5 L有機玻璃采水器采集表層水樣，每采樣點各取3瓶水樣。采樣后將水樣放置在冷藏箱中，做好水樣的儲存和低溫運輸工作，以防水樣變質(zhì)。蜻蜓稚蟲的采集參考Barbour等(1996)的采樣方法并適當改進，使用D形抄網(wǎng)(MY-031，0.3 m寬，40目尼龍紗網(wǎng))取樣調(diào)查，分別在堤岸、緩水區(qū)、穩(wěn)水區(qū)、大型水草根部和淤泥等蜻蜓稚蟲棲息的不同棲境類型，按照棲境出現(xiàn)的比例分配取樣數(shù)，分別用D型網(wǎng)緊貼水底基質(zhì)清掃0.5 m長區(qū)域，將所有基質(zhì)等抄入網(wǎng)內(nèi)，進一步用40目分樣篩分離出其中的蜻蜓目稚蟲。每采樣點清掃20次，總采樣面積約3.0 m2。將紅蜻稚蟲放入樣品低溫運輸箱中保存，盡快帶回實驗室后-80℃保存，其余蜻蜓稚蟲用50%酒精保存。

1.2 實驗內(nèi)容與方法

1.2.1水體理化性質(zhì)、重金屬含量的測定

測定分為現(xiàn)場和室內(nèi)測定?，F(xiàn)場測定水體的水溫、壓強、電導(dǎo)率(EC)和氧化還原電位(Eh)、pH和溶解氧(DO)，pH值用酸式筆式酸度計(HI 98127)測定，水溫和溶解氧使用哈希HQ40D型溶氧分析儀測定。室內(nèi)測定內(nèi)容有總氮(TN)、總磷(TP)、高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)、葉綠素a(Chl-a)、透明度(SD)和6種重金屬(Cu2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Cr6+和總鐵)含量。TP使用鉬酸銨分光光度法(GB 11893-89)，CODMn使用滴定法(GB 11892-89)，葉綠素a采用浮游植物熒光儀(Phyto-PAM)法，SD采用賽氏盤法(顧曉光等, 2005)。

Cu2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+采用原子吸收分光光度法(GB 7475-87)，Cr6+的測定依據(jù)國家標準二苯碳酰二肼分光光度法(GB 7467-87)，總鐵的測定依據(jù)其他國家標準鄰菲啰啉分光光度法(HJT 345-2007)，水質(zhì)的消解處理依據(jù)其他國家標準微波消解法(HJ 678-2013)進行處理，TN使用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ 636-2012)，采用TLI綜合營養(yǎng)指數(shù)法運用TP、TN和CODMn等對調(diào)查區(qū)域水質(zhì)狀況進行評價(陳麗華等, 2018)。

1.2.2蜻蜓稚蟲鑒定和實驗物種的選擇

對采集的蜻蜓稚蟲進行數(shù)量統(tǒng)計及鑒定，其中紅蜻稚蟲鑒定到種，其余稚蟲均鑒定到科(趙修復(fù), 1995)。紅蜻稚蟲為5個調(diào)查樣點的共有種類，因此選擇紅蜻Crocothemisservilia作為本次調(diào)查的實驗物種，進一步分析其在污染脅迫下的抗逆性生理適應(yīng)表現(xiàn)。

1.2.3超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的酶活性測定

按照重量(g)∶體積(mL)=1∶19的比例加入19倍生理鹽水，首先使用超聲破碎儀冰水浴破碎紅蜻稚蟲，離心取上清，得到5%組織勻漿液。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活性測定采用亞硝酸鹽法，過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性測定采用鉬酸銨法，試劑盒購于南京建成生物工程研究所?？偟鞍缀坎捎肂CA蛋白試劑盒(TaKaRa)進行測定，試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司。酶活性計算方法參照試劑盒配套的使用手冊完成，酶活單位用U/mg蛋白質(zhì)表示。

1.2.4HSP70、HSP90和CYP303a1的基因表達分析

各采樣點選取大小齡期相似的紅蜻稚蟲各 3頭，分別置于1.5 mL EP管中，置于冰上，加100 μL Trizol(Lifetech Scientific Corporation, USA)，電動勻漿器研磨；補足Trizol至1 mL，用力振蕩3 min，室溫靜置5 min；加入200 μL氯仿，混勻后靜置10 min，于4℃ 12 000 g離心15 min；轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 mL EP管，加入500 μL異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10 min；離心，棄上清，并加入1 mL DEPC水配制的75%乙醇，將沉淀吹離管壁，洗滌沉淀，4℃ 7 500 r/min離心5 min；倒去上清，重復(fù)前一步驟；離心后倒掉上清，將離心管倒置在超凈臺上，加入適量的RNA Free H2O水溶解，吹打混勻，于-80℃保存。提取后用1%瓊脂糖檢測總RNA的質(zhì)量，然后用微量測定分光光度計(NanoDropTM2000)測定提取RNA的濃度及純度。使用Prime Script?RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)配置體系，進行cDNA第1鏈的合成，于-20℃保存待用。

利用Prima 5.0設(shè)計Actin、HSP70、HSP90和CYP303a1定量引物如表1。采用實時熒光定量PCR法(Real-time fluorescent quantitative PCR, qRT-PCR)測定各水體中紅蜻稚蟲的HSP70、HSP90和CYP303a1的基因相對表達量。按以下體系進行反應(yīng)：SYBR GREEN 5 μL，primer F(10 pmol/μL)0.4 μL，primer R(10 pmol/μL)0.4 μL，模板cDNA 1 μL，RNase Free ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性5 s，59℃退火延伸25 s，循環(huán)40次；最后繪制熔解曲線。采用2-ΔΔCT法計算qRT-PCR試驗中的基因相對表達量，計算公式為：基因相對表達量=2-ΔΔCT。其中，ΔΔCT計算公式為：ΔΔCT=ΔCT(試驗組)-ΔCT(對照組)；試驗組或?qū)φ战M的ΔCT計算公式為：ΔCT=CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)。

表1 熒光定量PCR特異性引物

1.2.5數(shù)據(jù)分析

對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分析和方差齊性分析。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析通過SPSS 20.0完成，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)對水質(zhì)理化系數(shù)、酶活力和基因表達量進行顯著性差異分析，采用Duncan氏檢驗，其中P<0.05被認為有顯著性差異，P<0.01時，則說明差異極顯著；采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)對紅蜻稚蟲SOD和CAT酶活力，HSP70、HSP90和CYP303a1基因的表達與環(huán)境因子的關(guān)系。用Origin 2017進行柱狀圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子分析

2.1.1水域水體的理化性狀和富營養(yǎng)化水平

對各水域水體的理化性狀進行測定并根據(jù)地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB 3838-2002)進行分類，各地水質(zhì)依DO指標顯示杭州屬于I類水質(zhì)，溫州屬于III類，臺州屬于II類，紹興屬于II類，寧波屬于III類(表2)。

表2 浙江省各采樣點水體的理化性狀

不同水域水體的營養(yǎng)化水平有顯著的差異(圖1-A～E)，其中杭州采樣點的TP和葉綠素a皆為最低，SD最高；溫州采樣點TN和CODMn含量均最高；寧波采樣點TP含量最高，SD最低；臺州采樣點TN和CODMn低于其他3個地區(qū)。根據(jù)地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB 3838-2002)，各地水質(zhì)依TN指標顯示杭州屬于II類水質(zhì)，溫州屬于IV類，臺州屬于II類，紹興屬于II類，寧波屬于III類；依TP指標則杭州屬于I類水質(zhì)，溫州屬于III類，臺州屬于IV類，紹興屬于IV類，寧波屬于V類；依CODMn指標顯示杭州屬于I類水質(zhì)，溫州屬于IV類，臺州屬于I類，紹興屬于III類，寧波屬于III類。從圖1(F)可以看出，溫州、寧波、紹興采樣點的TLI富營養(yǎng)化指數(shù)都高于50。由此得出，溫州和寧波采樣點為重度富營養(yǎng)化，紹興采樣點為中度富營養(yǎng)化，杭州和臺州采樣點為中營養(yǎng)，各采樣點之間水質(zhì)差異較大。

圖1 浙江省各采樣點總氮、總磷、高錳酸鉀指數(shù)、葉綠素a、透明度和TLI富營養(yǎng)化指數(shù)Fig.1 Eutrophication index and TN, TP, CODMn, chlorophyll a, SD and TLI eutrophication indices in Zhejiang Provaince注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤(n=3)，柱上不同字母表示經(jīng)Duncan’s檢驗后差異顯著(P<0.05)。下圖同。Note:Data in the figure are mean±SE(n=3), and different letters above bars indicate significant difference by Duncan’s test(P<0.05)．The same for following Figures.

2.1.2各水域水體中重金屬含量水平

各水域水體中總鐵、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+和Cr6+含量存在地區(qū)間差異(圖2)。比較而言溫州采樣點的Cd2+、Cr6+和總鐵含量較高，臺州采樣點的Cd2+和Cu2+的含量偏高，紹興采樣點含量偏高的金屬離子有Cr6+、Pb2+和Zn2+，寧波采樣點Zn2+含量最高，杭州采樣點的Cd2+、Cr6+和Pb2+顯著低于其他4個采樣點。根據(jù)地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB 3838-2002)對各采樣點水體的重金屬含量進行分析，溫州和臺州采樣點Cr6+較其他采樣點高，約為0.003 mg/L，但仍屬于I類水質(zhì)；溫州和紹興采樣點Cr6+較其他采樣點高，約為0.03 mg/L，但仍屬于II類水質(zhì)；Cu2+含量最高的臺州采樣點也屬于II類水質(zhì)；Pb2+含量較高的紹興和寧波也仍屬于III類水質(zhì)；連Zn2+含量最高的寧波采樣點也屬于II類水質(zhì)。綜合分析可得：杭州采樣點屬于I類水質(zhì)，溫州采樣點屬于III類水質(zhì)，臺州采樣點屬于III類水質(zhì)，紹興采樣點屬于I或II類水質(zhì)，寧波采樣點屬于II類水質(zhì)。

圖2 浙江省各采樣點重金屬離子濃度Fig.2 Heavy metal ion in Zhejiang Province注：圖中“▼”表示水樣中重金屬未檢出。Note:“▼” means that heavy metal has not been detected in the samples.

2.2 各水域水體中采集的蜻蜓稚蟲分科鑒定

本次調(diào)查共采集到蜻蜓稚蟲169頭，經(jīng)分類鑒定分屬7科(蜻科Libellulidae、春蜓科Gomphidae、大蜓科Cordulegastridae、蜓科Aeshnidae Rambur、色蟌科Calopterygidae、扇蟌科Platycnemididae和絲蟌科Lestoidea)。其中杭州采樣點采集到4科31頭，隸屬于蜻科、春蜓科、大蜓科和色蟌科；溫州采樣點采集到2科40頭，隸屬于蜻科和春蜓科，其中采集紅蜻23頭，為所有采樣點中最多；臺州采樣點采集到的蜻蜓數(shù)目最多，共5科65頭，隸屬于蜻科、春蜓科、蜓科、扇蟌科和絲蟌科；紹興和寧波都只采集到蜻科、春蜓科和扇蟌科3類蜻蜓。其中紅蜻是5個采樣點的共有種類。

2.3 不同水域水體中紅蜻稚蟲超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活力

不同水域水體中紅蜻稚蟲SOD和CAT的活力有顯著差異(圖3)。臺州采樣點紅蜻稚蟲的SOD和CAT酶的活力最高，溫州采樣點的紅蜻稚蟲略低于臺州采樣點，杭州采樣點紅蜻稚蟲的酶活力最低。結(jié)果表明，在各采樣點采集的紅蜻稚蟲的SOD和CAT活性差異顯著，且SOD和CAT酶活力在各采樣點所表現(xiàn)的趨勢相同。

圖3 浙江省各采樣點紅蜻稚蟲SOD、CAT活性Fig.3 Enzymatic activity of Crocothemis servilia nympho SOD and CAT in Zhejiang Province

2.4 不同水域水體中紅蜻稚蟲HSP70、HSP90和CYP303a1的基因表達分析

以杭州地區(qū)采集的紅蜻稚蟲作為參照，通過計算得出各采樣點紅蜻稚蟲HSP70、HSP90和CYP303a13個基因的相對表達量(圖4)。紹興采樣點CYP303a1和HSP90基因的相對表達量明顯高于其它3個采樣點，而HSP70基因的相對表達量在溫州采樣點紅蜻稚蟲體內(nèi)表達量最高。水質(zhì)最好的杭州地區(qū)采樣點紅蜻稚蟲HSP70、HSP90和CYP303a13個基因的表達量都是各組間最低值。通過統(tǒng)計分析得出，各地區(qū)采集的紅蜻稚蟲體內(nèi)HSP70、HSP90和CYP303a13個基因的表達量存在地區(qū)間顯著性差異。

圖4 浙江省各采樣點紅蜻稚蟲HSP70 、HSP90和CYP303a1相對表達量Fig.4 Relative expression leval of Crocothemis servilia nympho HSP70、HSP90 and CYP303a1 in Zhejiang Province

3 結(jié)論與討論

3.1 不同水域水體污染狀況及其與蜻蜓稚蟲之間的關(guān)系

根據(jù)浙江省環(huán)境廳于2019年11月公開的浙江省地表水環(huán)境質(zhì)量月報所示：全省地表水總體水質(zhì)為良。221個省控斷面中，Ⅰ類占12.2%，Ⅱ類占38.9%，Ⅲ類占33.0%，Ⅳ類占12.2%，Ⅴ類占3.2%，劣Ⅴ類占0.5%；滿足水環(huán)境功能區(qū)目標水質(zhì)要求斷面占86.9%。水體的主要污染指標為總磷、氨氮、五日生化需氧量和化學(xué)需氧量，而造成浙江省農(nóng)村河道工業(yè)污染源的類型因各地的經(jīng)濟支柱產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)不同而有差異，主要污染源來自采礦業(yè)、紡織業(yè)和皮革毛皮及制品業(yè)、食品飲料制造加工業(yè)等；農(nóng)業(yè)污染源則以農(nóng)業(yè)種植為主，其它有農(nóng)村生活污水及固體廢棄物、分散式畜禽養(yǎng)殖等(盧衛(wèi)和應(yīng)聰慧, 2009)。

就本研究采樣點實地考察發(fā)現(xiàn)：寧波鎮(zhèn)海采樣點則位于鎮(zhèn)海石油煉化企業(yè)污染輻射區(qū)內(nèi)，而溫州市平陽水頭鎮(zhèn)以皮革產(chǎn)業(yè)出名，推測溫州和寧波采樣點的富營養(yǎng)化主要與當?shù)氐墓I(yè)污水、農(nóng)業(yè)污水和生活污水有關(guān)(張松達等, 2010；金矛, 2015)。紹興柯橋采樣點附近有紹興第一印染廠、紹興蕭紹印染廠、大和集團印染三廠等多家紡織印染企業(yè)，水體中度富營養(yǎng)化程度與紡織業(yè)的有機污染有關(guān)(祁華寶和魯玉龍, 1995；陳昕和章科鋒, 2009；吳績新等, 2018)

本次實驗對各地區(qū)采樣點的6種重金屬含量進行了測定。紹興采樣點含量偏高的重金屬離子有Cr6+、Pb2+和Zn2+，應(yīng)該與當?shù)匕l(fā)達的紡織印染產(chǎn)業(yè)有關(guān)(李萍等, 2012)；溫州平陽水頭鎮(zhèn)采樣點的Cr6+濃度比其他地區(qū)較高，應(yīng)該與當?shù)匕l(fā)達附近的皮革制造業(yè)有關(guān)(楊斌等, 2016)，同時Cr6+在臺州和寧波兩個地區(qū)都較高，這與Cr6+被廣泛應(yīng)用于電鍍工業(yè)、化工業(yè)、電子業(yè)、冶煉和印染等行業(yè)有關(guān)。臺州采樣點Cu2+和Cd2+含量要高于其它幾個地區(qū)，這可能和該地區(qū)的電子回收產(chǎn)業(yè)有關(guān)(潘海燕等, 2015)。寧波鎮(zhèn)海地區(qū)水體中Zn2+含量最高，當?shù)匕l(fā)展電鍍企業(yè)，而鋅是主要的原材料之一(王宗雄, 2012；楊斌等, 2016)。

水質(zhì)的差異直接或間接影響水生昆蟲的群落結(jié)構(gòu)，比如氮濃度、磷濃度、生化需氧量與水生昆蟲密度呈極顯著正相關(guān)，與水生昆蟲的種數(shù)呈極顯著負相關(guān)(羅清榮, 2012)，TN和Cd2+等環(huán)境因子也會影響物種的分布(劉祥等, 2016)，而底層氧含量往往直接決定了水生昆蟲的分布和密度(陳含墨等, 2019)。本次調(diào)查在水質(zhì)較好的杭州和臺州采集到的蜻蜓種類最多，而溫州、寧波和紹興等地采集到的蜻蜓種類較單一，也支持這一觀點。張瀲波等( 2013)在研究浙江省錢塘江中游流域水生昆蟲功能多樣性對土地利用變化的響應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)人類對土地的利用會導(dǎo)致溪流生態(tài)質(zhì)量退化，水體中營養(yǎng)鹽濃度和電導(dǎo)率明顯上升，溶氧含量明顯下降，一些生物學(xué)性狀的改變，進而影響到水生昆蟲群落及其功能多樣性，這些研究都說明人類活動所產(chǎn)生的水體污染已經(jīng)嚴重影響了水生昆蟲的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

本次調(diào)查在5個地區(qū)采樣點都采集到了紅蜻稚蟲，其中溫州樣點采集的紅蜻稚蟲最多，而水質(zhì)分析顯示該采樣點水體中Cd2+、Cr6+、TN和CODMn都較高，且水體富營養(yǎng)程度為重度富營養(yǎng)，推測紅蜻稚蟲對不同水體均有較強的抗逆性適應(yīng)能力，即使在富營養(yǎng)化程度較高的水體中也能較好的生存。

3.2 紅蜻稚蟲SOD、CAT酶活力與環(huán)境因子的關(guān)系

當生物體受到污染物刺激時，會產(chǎn)生大量的活性氧，如果不及時去除，會對生物體造成損傷。當昆蟲暴露在污染物下時，機體內(nèi)的SOD和CAT會同時發(fā)揮作用來消除過多的自由基從而達到讓自己能夠生存下去的目的(Subalaetal., 2017；Zhangetal., 2007；Zhangetal., 2017)。如果長期在含較低濃度污染物的環(huán)境下暴露，生物體內(nèi)的SOD和CAT酶活力將會被誘導(dǎo)(宋志慧和王慶偉, 2011)。吳國星等(2008)研究了棕尾別麻蠅Boettcheriscaperegrina幼蟲的脂質(zhì)過氧化作用與重金屬鎘和銅存在著濃度依賴，其體內(nèi)的SOD和CAT酶活力隨重金屬濃度升高而明顯被抑制。王慧等(2006)研究幾種蠅類在鎘和銅脅迫下的抗氧化酶活性變化發(fā)現(xiàn)：鎘和銅明顯抑制蠅類幼蟲的SOD和CAT酶活性，且隨著重金屬的濃度升高其抑制作用增強。在對各個采樣點紅蜻稚蟲體內(nèi)SOD和CAT進行測定時，發(fā)現(xiàn)不同采樣點的紅蜻稚蟲其體內(nèi)抗氧化酶活力存在顯著差異，可能與紅蜻稚蟲對各自水體環(huán)境的脅迫響應(yīng)有關(guān)。當外界Cr6+濃度較高時，紅蜻稚蟲體內(nèi)的SOD和CAT酶活力上升(P<0.05)，SOD和CAT酶活力和Cr6+呈正相關(guān)(r>0)；當Cu2+含量較高時，CAT酶活力上升(P<0.05)，CAT酶活力和Cu2+呈正相關(guān)(r>0)。本研究還發(fā)現(xiàn)盡管不同水體內(nèi)紅蜻稚蟲體內(nèi)SOD和CAT的酶活力不同，但是它們在各地有相似的表現(xiàn)，都呈現(xiàn)出臺州>溫州>寧波>紹興>杭州的趨勢，進一步證明紅蜻稚蟲體內(nèi)的SOD和CAT酶活力與其生活的水體環(huán)境具有一定的聯(lián)系。結(jié)合各地環(huán)境因子污染情況，本研究發(fā)現(xiàn)SOD與CAT酶活力最高的兩個地區(qū)所對應(yīng)的最突出的環(huán)境污染因子是Cr6+，而對其它重金屬的反應(yīng)并不強烈，由此可以推測紅蜻體內(nèi)的SOD和CAT酶活力在一定程度上能反應(yīng)出某一水體的Cr6+污染情況。

3.3 紅蜻稚蟲HSP70、HSP90、CYP303a1基因的表達與環(huán)境因子的關(guān)系

HSP家族是生物體中重要的伴侶蛋白，炎癥、熱應(yīng)激、缺血、重金屬脅迫等一系列的因素都會導(dǎo)致其mRNA的表達(計紅等, 2005)，HSP70在被誘導(dǎo)后表達水平甚至可增加10～100倍(陳蘭英等, 2004；彭喬烽等, 2019)。有研究表明在pH和重金屬的暴露下，凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei的HSP60、HSP70、HSP90基因會進行不同程度的特異性表達(Qianetal., 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，紅蜻稚蟲在富營養(yǎng)化水體中，通過不同片段長度的HSPs的表達對環(huán)境變化作出相應(yīng)反應(yīng)，當污染物主要為氮素時，紅蜻稚蟲的HSP70表達能力上升；當污染物主要為磷元素時，紅蜻稚蟲的HSP70表達能力下降，HSP90表達能力上升；當污染物為還原性物質(zhì)時，紅蜻稚蟲的HSP90表達能力下降。通過測定不同片段長度的HSPs的表達量，可以了解到當前水體的主要污染物質(zhì)。Mahmoud等研究發(fā)現(xiàn)，在無機磷暴露下，雞體內(nèi)的HSP90基因有明顯的升高，這與本實驗的結(jié)果相一致(Mahmoudetal., 2004)。通過相關(guān)性分析得出，HSP90表達量隨TP和CODMn濃度呈正相關(guān)關(guān)系(r>0)，隨著水體中TP、CODMn濃度的上升，HSP90基因的表達量隨之上調(diào)(P<0.05)；HSP70的表達量隨Pb2+濃度上升而上調(diào)(P<0.05)，且與Pb2+濃度間呈正相關(guān)(r>0)，這與鄧茗芩關(guān)于秀麗影桿線蟲Caenorhabditiselegans的研究結(jié)果也是一致的(鄧茗芩, 2014)。

細胞色素P450酶系(CYP450)是一類重要的多功能氧化酶(Guengerichetal., 2016)，參與生物體內(nèi)各種內(nèi)源和外源性物質(zhì)的氧化代謝，大部分藥物和外源污染物的代謝都與P450酶系有關(guān)(Vaccaroetal., 2002；Lavilleetal., 2004)。通過分析，紅蜻稚蟲CYP303a1基因的表達水平與水體中Cr6+含量呈負相關(guān)關(guān)系(r<0)，在長期Cr6+脅迫的作用下，會抑制紅蜻稚蟲CYP303a1基因的表達(P<0.05)；CYP303a1的表達量與TP和Cd2+呈正相關(guān)(r>0)，隨著這兩種環(huán)境因子的濃度上升，會促進紅蜻稚蟲體內(nèi)CYP303a1基因表達上調(diào)(P<0.05)。

3.4 不同類型水體污染下蜻蜓稚蟲的抗逆性表現(xiàn)

通過對水體理化指標的測定，以及紅蜻稚蟲酶活性和基因表達的測定等，在皮革廢水污染下，紅蜻稚蟲體內(nèi)的SOD、CAT和P450能幫助紅蜻稚蟲適應(yīng)Cr6+濃度較高的水體中。Loumbourdis等(2006)認為Cr6+進入機體后可被體內(nèi)的抗氧化劑(如谷胱甘肽、甘酸等)迅速還原為低毒的Cr3+，而微量Cr3+對于機體的代謝活動是必不可少的，因此推測低濃度Cr6+不會對蜻蜓稚蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。在高濃度時，進入體內(nèi)的Cr6+含量長期偏高，會抑制SOD、CAT活性和CYP303a1的基因表達能力。在富營養(yǎng)化水體中，紅蜻稚蟲通過表達不同片段長度的HSPs，來應(yīng)對不同類型的富營養(yǎng)化因素，從而更好地適應(yīng)生活環(huán)境的變化。

本研究在通過對紅蜻幼蟲生存的水體環(huán)境和體內(nèi)的抗氧化酶SOD和CAT以及HSP70、HSP90和CYP303a1分析可得以下結(jié)論：

1)紅蜻稚蟲體內(nèi)的SOD和CAT酶活力與水體中的重金屬Cr6+離子濃度密切相關(guān)，可在一定程度上反映出水體的Cr6+污染狀況；

2)紅蜻稚蟲HSP70 的表達量與水體TN、TP和Pb2+濃度間呈正相關(guān)，同時HSP90的表達與水體TP和CODMn濃度正相關(guān)，可反映水體富營養(yǎng)化的主要污染物類型；紅蜻稚蟲CYP303a1的表達水平與水體中Cr6+含量呈負相關(guān)，而與TP和Cd2+呈正相關(guān)。推測HSPs和CYP可能與稚蟲抵抗不同類型的重金屬或富營養(yǎng)化污染有關(guān)系。