現代分析技術在儲糧微生物鑒定中的研究進展*

王 錦 陳晉瑩 陳 帥 李 理

(中儲糧成都儲藏研究院有限公司 610091)

糧食是國家的戰(zhàn)略物資，是人民的生活必需品，是保障社會經濟穩(wěn)定和發(fā)展的基礎。我國不僅是世界糧食生產、消費大國，也是糧食儲運量最多的國家之一，糧食的安全生產和儲藏，關系國計民生，是糧食工作的重中之重。糧食因其含有豐富的碳水化合物、蛋白質、脂肪及無機鹽等營養(yǎng)物質，常成為微生物生長的天然培養(yǎng)基。世界上各地所產的糧食、糧食加工產品以及飼料上都有大量的微生物存在，包括病毒、細菌、放線菌、真菌等[1]。在合適的溫度和濕度條件下，這些微生物的生命活動將對儲藏糧食的品質產生影響，出現變色、發(fā)霉、發(fā)熱等癥狀。特別是微生物中的霉菌，具有生長繁殖能力強的特點，可直接或間接的利用糧食中各種營養(yǎng)物質，分泌產生多種生物酶，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，將糧食中的營養(yǎng)成分轉化為自身生長繁殖所需的小分子營養(yǎng)成分，進行代謝活動，使糧食品質發(fā)生劣變，嚴重影響糧食的價值[2]。有些霉菌，如黃曲霉菌(Aspergillisflavus)、青霉菌(Penicillium)、鐮刀菌(Fusarium)等還能在糧食中產生多種真菌毒素。被真菌毒素污染的糧食及其制品通過食物鏈對人類和動物的健康產生危害，給食品工業(yè)、飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產造成了巨大的危害[3，4]。因此儲糧微生物的快速鑒定是進行儲糧微生物綜合防治的前提和基礎。

微生物具有個體微小、結構簡單、用肉眼難以分辨的特點。傳統(tǒng)的微生物分類和鑒定方法主要是以微生物的形態(tài)學和生理生化等特征為依據。雖然這類方法仍被廣泛使用，并能為儲糧的安全性提供一定的指示，但是其只適用于可以體外培養(yǎng)的生物體，且存在檢測操作技術專業(yè)性強，要求高，操作程序繁瑣、時間長，檢測精度低等問題，難以滿足對儲糧微生物快速、準確鑒定的需求。隨著分子生物學技術、質譜技術等相關技術的飛速發(fā)展，許多不依賴于活的培養(yǎng)物的現代方法逐漸被應用到微生物的分析與鑒定中，滿足了不同儲糧微生物和檢測條件的需求[5]。本文中，主要針對儲糧微生物檢測和鑒定的現代分析技術研究進展進行了闡述。

1 生化分析方法用于微生物鑒定

在微生物學中，傳統(tǒng)的生化鑒定方法主要依靠微生物培養(yǎng)過程中利用物質的能力，代謝產物的特殊性，與溫度和氧氣的關系等特征進行鑒定。這類方法費時費力(培養(yǎng)基制備、稀釋、平板培養(yǎng)、計數、分離和表征)，結果至少3 d后(霉菌7 d)才能觀察到，特別是在鑒定表型相似的微生物物種時，經常會獲得假陽性結果[6，7]。同時，這類方法還無法識別不可培養(yǎng)的細胞。隨著生物化學知識的不斷發(fā)展以及功能強大的儀器出現，傳統(tǒng)生化方法的使用開始減少，并且開發(fā)出了更多的現代生物化學方法，與傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法相比，具有許多優(yōu)勢，如分析時間縮短并能夠測定多種微生物，同時還能很好地保證結果的準確性[7-9]。

1.1 基于質譜的方法

質譜法(Mass Spectrometry，MS)是通過分析電離分子質荷比(m/z)，從而對樣品分子組成進行定性定量分析的一種方法，實驗過程中根據離子產生的質量圖譜對樣品分子組成進行確定。1975年，Anhalt等首次將質譜技術應用于細菌鑒定領域[11]，1996年Claydon等成功鑒定了革蘭氏陰性菌和陽性菌[12]。隨著質譜技術的不斷發(fā)展，以及新的數據分析、處理和可視化工具的發(fā)展，質譜技術在微生物檢測和鑒定中的應用越來越廣泛[10，12-16]。

1.1.1 液相色譜-質譜(LC-MS) 液相色譜(Liquid Chromatography，LC)與質譜的結合，徹底改變了代謝物組的分析測定方法，從而實現了通過分析一些不揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的高分子化合物進行微生物的鑒定[17，18]。LC-MS主要用于臨床應用中的微生物鑒定[19]，它也可用于檢測飼料中枯草芽孢桿菌和大腸桿菌，并確定釀酒酵母的完整代謝物組覆蓋率[20]。在LC-MS中，使用進樣器將樣品注入溶劑流，并在固定相化學鍵合的色譜柱內進行分離，柱中的洗脫液穿過光譜儀中的流通池，以無損識別具有光譜結構的化合物(發(fā)色團或熒光團)。

隨著質譜分析儀和電離技術在LC-MS技術方面取得了進步，新的平臺也逐步發(fā)展起來，包括快速LC-MS、LC-MALDI-MS、LC-ESI-MS-MS、LC-NMR-MS、親水相互作用液相色譜(HILIC)-MS，反相LC-MS和離子遷移譜，變性高效液相色譜法(DHPLC)等[21-26]。其中DHPLC是一種新的有發(fā)展前途的方法，特別是在微生物鑒定和監(jiān)測方面[27，28]。

1.1.2 氣相色譜-質譜(GC-MS) 氣相色譜與質譜的聯用已廣泛應用于鑒定復雜的生物混合物[29-31]。GC系統(tǒng)包括一個氣源、一個進樣器和一個位于柱箱內的柱，具有良好的分離效率，可與質譜儀相連。MS可以提供區(qū)分化學中不同代謝物的質譜圖，兩者的聯合使用可以使檢測結果更準確。此外，GC-MS還具有高靈敏性、易用性、低成本、豐富的線性范圍以及商業(yè)和公共數據庫的可訪問性[32-34]。該方法通常用于非極性分子分析(例如，脂質成分)[35]，并通過評估其脂質元素對微生物進行分類。

GC-MS的主要缺點在于——該過程要求分析物為揮發(fā)性形式，由于某些代謝物是非揮發(fā)性的，因此需要耗時的衍生步驟[36-38]。為了優(yōu)化該技術的性能，可以將某些技術與GC-MS結合使用，例如GC-GC飛行時間(TOF)-MS[39，40]。在這種情況下，將兩個不同的GC柱結合在一起，從而增加了代謝物的檢測范圍，并提高了掃描速度(TOF-MS)的靈敏度，從而提高了檢測效率。然而，這種方法成本較高，因此尚未被常規(guī)使用?；鹧骐婋x檢測器(FID)-GC-FID的連接還可以用于常規(guī)樣品分析，該方法快速，非常靈敏，并且成本較低[41]。

1.1.3 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF MS) MALDI-TOF MS是用于微生物快速鑒定和分類的最新一代工具。該方法的原理是基于短脈沖激光對微生物細胞的電離，然后利用電場在真空系統(tǒng)中加速顆粒[16，42]。電離后，獲得光譜圖形式的分子指紋，該指紋對于每種微生物都是特異的，將該頻譜與現有數據庫進行比較，通過自動化程序對其進行識別。MALDI-TOF的主要優(yōu)點是節(jié)約時間，鑒定過程不再需要24 h～48 h，只需不到1 h即可完成。

MALDI-TOF MS是目前在儲糧和環(huán)境中致病微生物檢測和鑒定中最常用的技術之一[43，44]，具有快速、準確、靈敏的特點，可分為全細胞分析和細胞裂解物分析。在實際過程中，通過對糧食中微生物的特征性生物標志物進行檢測，將含有標志物分子量和結構信息的質譜圖，與基因組和蛋白質數據庫中的質譜圖進行比較，完成對儲糧微生物的快速鑒定，并進行產毒機理的探究以指導糧食儲藏微生物防治工作的開展[45-48]。

MALDI-TOF的替代方法是電噴霧電離(ESI)-MS，該方法可以分析液態(tài)樣品并在大氣壓下進行的電離，而無需重復使用與MALDI-TOF-MS中相同的激光。因此，ESI-MS在微生物鑒定方面具有更廣泛的應用范圍[21，49-51]。

1.2 光譜法

光譜法是一種強大的多元且可重現的方法，在現今的研究中顯示出巨大的潛力。光纖光譜學處理分子官能團的振動和旋轉，這是輻射與樣品相互作用時能量轉移的結果，并引起電子激發(fā)、振動變化和旋轉變化。光譜隨樣品分子組成的不同而變化，因此，它們與樣品的化學成分(蛋白質、脂質、碳水化合物、膜、藥物、人體組織等)有關。從理論上講，任何樣品都可以通過光譜學進行虛擬分析，并與分子生物學互補。因為它們通常不需要破壞微生物，因此這些方法具有更高的使用價值。同時該方法也存在一些局限性，建議在使用每種方法前可以使用多種光譜分析技術對其進行仔細的驗證。

1.2.1 紅外光譜(FTIR) 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)具有通用性、快速性、非侵入性的特點，并且與其他方法相比[52-55]更易于執(zhí)行，在微生物學的多個領域都有應用。這種分析技術是一種無化學和無標簽的方法，可以清晰地闡明整個樣品的化學成分和物理狀態(tài)，可以分析多種生物分子。僅使用極少量的樣品，就可以通過一次測量獲得有關主要生物分子(如脂質，蛋白質，碳水化合物和核酸)的詳細信息[56]。

使用這種技術評估微生物的整個生物系統(tǒng)會導致光譜非常復雜，出現主要化合物的吸收譜帶重疊的現象。因此，為了從光譜中只提取正在研究的生理過程的相關信息，適當的多元統(tǒng)計分析至關重要[57]。

1.2.2 拉曼光譜-振動光譜 另一種廣泛使用的光譜方法是拉曼光譜法，它可對微生物進行非侵入性，快速表征和鑒定，因而得到了廣泛認可。它以低成本、快速和多樣的報告結果(微生物中的化學組成，結構以及生物分子的相互作用)與其他系統(tǒng)區(qū)分開[58，59]。與其他光譜表征一樣，當光入射到物質上時，拉曼光譜結果取決于其與原子和分子的相互作用。當原子振動時，它將改變具有非極性基團(例如C-C和S-S強拉曼帶)的官能團的極化率。近年來，拉曼光譜已廣泛應用于微生物鑒定[60-64]。

紅外光譜和拉曼光譜都是振動光譜的形式，可以提供“整個生物指紋”，如Lu，X.等所述[63]，振動光譜法是根據生化成分來區(qū)分微生物，因此對于區(qū)分同一物種之間的微小差異非常有用。此外，Lu等[65]還將拉曼光譜技術與微流體芯片結合對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進行了快速鑒定。Zhang等[66]也利用便攜式拉曼光譜儀通過金納米顆粒與樣品混合對致病性腸菌進行了快速鑒定，實驗結果表明拉曼光譜技術可以在2 h內不需要培養(yǎng)基的情況下對致病性微生物進行快速、準確的鑒定，因此可在糧食收購環(huán)節(jié)及儲藏期內對微生物污染情況進行快速準確的判定，并即時采取相應的措施，減少糧食損耗。

1.2.3 核磁共振波譜學(NMR) NMR光譜學是一種用于鑒定微生物的替代性有效技術。向原子核施加強磁場和射頻脈沖，磁場會引起核自旋，吸收射頻能量(從低能到高能自旋態(tài))，并檢測到輻射的發(fā)射[67]。與其他方法相比，NMR可以以無創(chuàng)的方式進行。此外，它的靈敏度降低，檢測限較低(1 μM～5 μM，并且需要相對較大的樣品量約500 μL)，盡管這些問題因它是一種定量方法而得到平衡[68]。

1.3 電動分離方法

電動學一詞在科學上是指帶電粒子通過基質時的相對運動。這種方法利用微生物組成的差異來獲得不同的遷移模式，這樣，在不重復樣品標記的情況下，就可以分離得到不同的微生物。

毛細管電泳(CE)-MS由Joseph Loo于1989年開發(fā)并首次發(fā)表。它結合了電泳分離過程和質譜檢測[69]。與GC和LC方法相比，它具有更好的分離效率，樣品用量更少，速度更快，試劑成本更低以及單次運行即可分離得到陽離子、陰離子和不帶電荷分子的可能性。CE由于使用樣品體積小導致檢測靈敏度不足，尤其是當與MS連接時，可訪問的商業(yè)庫數量有限，并且保留時間的再現性降低。Armstrong等[70]將CE與毛細管等電聚焦(CIEF)結合使用，可以分離和識別具有各種尺寸和形狀的7種微生物。這項研究的獨特之處在于，它證明了可以通過利用通常局限于大分子的技術來有效分離完整的生物細胞。目前另一種可能的方法是將CE與熒光相結合，用于觀察分離過程，并通過這種方法從細胞聚集和聚焦效應方面監(jiān)測操作條件和微生物動力學[71-73]。

電場流分級分離(EIFFF)是另一種利用微生物在電場中遷移能力的分離技術。2000年證實了其可用于微生物鑒定[74]。它基于在不同電場的影響下，由于各組組件的不同層(分級)而導致的通道中樣本組件的分離。EIFFF裝置利用通道的兩個主壁在電極之間產生電勢差，從而導致電荷之間的分離[75]。

1.4 微流控芯片技術

微流控技術是一門以微機械加工、生物技術和微納米化學分析等為基礎發(fā)展起來的交叉學科。自上世紀90年代初期由Andreas等人提出并實現以來，微流體研究領域已經取得了迅速發(fā)展[76]。近年來，關于微流體芯片在微生物檢測中應用的報道有很多[77-80]。

微流控芯片技術在微生物檢測中的應用具有很多優(yōu)勢，如樣本消耗少、檢測通量高、靈敏度高且可以進行在線實時監(jiān)測，在食品安全控制、環(huán)境監(jiān)測和臨床診斷中具有巨大的適用性。目前利用微流體芯片進行微生物檢測和鑒定的方法主要集中在將該技術與一些分析用的標準技術進行組合，無需標記程序。主要是與PCR技術[81，82]、質譜技術[81，83，84]、光譜法[85]和電化學[86，87]等技術的組合使用。

2 分子生物學技術用于微生物鑒定

分子生物學時代的到來為各種臨床和研究目的細菌檢測、鑒定、表征和分型帶來了快速、準確的工具和技術[88]?；蛐头椒ㄒ涯荑b定以前未知的種類繁多的分類群，鑒定無法培養(yǎng)的細菌，并促進了對各種細菌群落的宏基因組學研究[89]。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，細菌鑒定的分子方法也從基于DNA擴增的方法(PCR、實時PCR、PARD-PCR)到基于限制性片段分析，靶向基因和全基因組測序以及質譜的更復雜的方法。

2.1 16S rRNA測序

從相對較低的起始材料中快速擴增核酸靶標，使PCR(聚合酶鏈式反應)成為可用于檢測細菌靶標的最靈敏技術之一。16S rRNA基因對每種細菌都具有高度特異性，因此成為微生物鑒定的理想靶標。標準方法包括對16S rRNA基因進行PCR擴增，然后測序并與已知數據庫進行比較以進行鑒定。但在兩個緊密相關的物種中16S rRNA基因相同的情況下，其他保守基因，如rpoB，tuf，gyrA，gyrB和熱激蛋白常被用作靶標基因[90-92]?；赑CR的方法不僅比傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法快，而且有助于鑒定在實驗室條件下難以生長的細菌。目前，基于PCR的鑒定方法已成功并廣泛用于微生物檢測和鑒定[93-95]。

2.2 熒光定量PCR

與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR又稱實時定量PCR(Real Time-PCR)具有許多優(yōu)勢，如更高的靈敏度和準確性，以及能夠通過熒光強度實時監(jiān)控DNA擴增的能力，從而無需進行任何PCR后檢測。RT-PCR也可以是定量的或半定量的，使用Cq值(熒光強度超過可檢測水平的循環(huán)數)來定量DNA的數量。與常規(guī)PCR一樣，RT-PCR在實驗室研究以及臨床中也有廣泛的應用。它也適用于多種樣本，如從牛奶中原本無法培養(yǎng)的細菌的鑒定[96]到土壤生態(tài)系統(tǒng)中細菌的鑒定[97]。使用針對16S rRNA基因保守區(qū)域的通用引物，已開發(fā)出一種可檢測鮑曼不動桿菌、大腸桿菌、克雷伯氏肺炎菌和綠膿桿菌的測定方法[98]。

2.3 隨機擴增多態(tài)性DNA技術(RAPD-PCR)

與以前描述的基于PCR的方法不同，多態(tài)性DNA(RAPD)-PCR的隨機擴增采用短引物(8至12個核苷酸)，其任意序列與模板細菌DNA非特異性結合。這導致模板DNA隨機重復區(qū)域的擴增，從而為細菌鑒定提供了獨特的方法[99]。RAPD-PCR反應可以從分離的DNA或粗細菌裂解液開始，然后在存在RAPD引物(或一組引物)和低水平的鎂離子(以增強非特異性退火)的條件下進行擴增[100]。然后將擴增的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，以產生獨特的RAPD指紋。由于RAPD-PCR的引物通常是隨機結合模板的DNA片段，因此不需要提前知道目標基因組的序列。這意味著它可以用于識別和分類各種細菌種類，這些細菌種類尚未被識別，或者無法提前獲得序列數據。此外，它可以直接從整個細菌中進行，而無需分離DNA，并且可以應用于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的鑒定[100]。

2.4 限制性片段長度多態(tài)性

限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是一種使用獨特指紋來鑒定細菌菌株的方法，該指紋依賴于同源DNA序列中變異的存在(多態(tài)性)。這種基于PCR的方法使用了限制性內切酶，該酶可以識別擴增的DNA(PCR產物)并將其切割成不同長度的DNA片段。如在RAPD中一樣，這些不同的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，從而為每個細菌菌株生成獨特的條帶模式。如果兩個菌株緊密相關，則它們的帶狀譜將相同或非常相似。另一方面，條帶模式的差異表明細菌菌株的多樣性。這項技術在調查傳染病暴發(fā)的分子流行病學方面具有高度相關性，在此過程中，確定多個病例或患者是否屬于同一暴發(fā)，追蹤暴發(fā)源并確定單個或多個細菌菌株非常重要[101]。

2.5 擴增片段長度多態(tài)性

擴增的片段長度多態(tài)性(AFLP)與RFLP相似，因為它使用限制性內切酶(通常是一對)來將基因組DNA切割成線型的，然后使用連接的銜接子來擴增限制片段的子集。通過使用與銜接子序列互補但也具有某些獨特核苷酸的引物實現該擴增。因此，僅少量的限制性片段被選擇性地擴增。然后使用凝膠電泳分析AFLP指紋，從單個細菌基因組DNA產生一組不同的DNA片段。顯然，在沒有任何現有的基因組序列知識的情況下，AFLP具有很高的特異性和辨別性[102]。

2.6 脈沖場凝膠電泳

脈沖場凝膠電泳(PFGE)是一種分離DNA大片段的方法，對流行病學研究中細菌的鑒定和分型特別有用，是目前在核酸和分子水平上鑒定細菌的主要手段。在PFGE中，用釋放染色體DNA的酶和去污劑(蛋白酶和SDS)處理瓊脂糖塞中的純細菌菌株。然后將瓊脂糖塞子與限制性內切酶一起孵育，該酶在特定位點切割以產生有限數量的DNA片段，使塞子在磁場中經電流作用，交替旋轉(這會增強大的DNA片段的運動)，導致DNA片段的大小分離并出現模式條帶[103]，從而實現細菌的鑒定。

2.7 核糖體分型

核糖體分型是一種用于細菌鑒定和表征的方法，與其它分子分型方法不同，它采用基于rRNA的系統(tǒng)發(fā)育分析。鑒于rRNA基因(如16S rRNA)在細菌物種內高度保守，因此識別16S rRNA基因多態(tài)性反映了細菌物種的進化譜系，可以闡明細菌的分類以及毒理學、分類學、流行病學研究[104]。核糖體分型通常涉及一個多步驟過程，該過程以靶向目標基因組序列的限制性內切酶為起點，然后進行Southern印跡轉移和與探針的雜交，并分析核糖型RFLP帶。隨著分子工具的進步和對基因組序列的了解，已對該技術進行了多種修改[104]。需要注意的是，出于引物和探針設計的目的，核糖體分型分析需要對所研究的基因組序列有一定了解[105，106]。

2.8 全基因組測序(WGS)

全基因組測序技術(WGS)最近已成為國際上食源性致病菌鑒定，分型和溯源的金標準技術。微生物全基因組測序涉及對細菌、病毒或其他微生物的整個基因組進行測序，并將序列與已知參考序列進行比較。對于檢測低頻突變、發(fā)現關鍵缺失與插入以及發(fā)現微生物菌株之間的其他基因變化來說，快速準確地生成微生物基因組序列信息十分重要。整個細菌基因組的分析不僅為細菌的類型和進化譜系提供了前所未有的見解，而且還徹底改變了我們了解抗菌素耐藥性和爆發(fā)調查的方法。WGS技術和分析管道的進步迅速提高了輸出和分析速度，同時也降低了總成本[107]。

3 總結

在過去的幾十年中，出現了很多用于確定糧食微生物樣品身份的工具。盡管有局限性，但培養(yǎng)和顯微鏡檢查方法仍然是最常用的兩種技術，快速，低成本，靈敏和可重現性的進行微生物篩選的方法的發(fā)展仍是現代科學發(fā)展中的重要問題。隨著分子生物學以及質譜技術的不斷發(fā)展，用現代方法(MALDI-TOF MS或電遷移技術等)替代費時費力的表型方法，是食品安全領域和醫(yī)學診斷行業(yè)所面臨的現有挑戰(zhàn)的解決方案。此外，我們一方面仍需不斷地研究和開發(fā)新的有效的儲糧微生物檢測技術，另一方面也要綜合利用現有的檢測方法，以形成多技術方法融合的快速、準確的檢測技術，為有害微生物的綜合防治提供可靠的、科學的決策依據，將儲糧損失降到最低。