黃原膠對大麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

肖 俐， 羅 秋 穎， 劉 春 曉， 陶 虹 宇， 李 憲 臻， 俞 志 敏

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

黃原膠(Xanthan)是一種由黃單胞菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖[1]，具有很高黏度和分子質(zhì)量的天然多糖，黃原膠易溶于水，抗水解能力優(yōu)于很多其他水溶性多糖或者多聚體[2]。黃原膠對酸堿也有較好的耐受能力，在pH 1～13，黃原膠的黏性不受影響[3]。黃原膠還被廣泛用作食品添加劑[4]，不僅能夠提高微生物的穩(wěn)定性，也可以作為農(nóng)用化學(xué)品或植物保護(hù)劑的載體，以促進(jìn)它們的黏附并保留在植物葉子中，甚至黃原膠及其衍生物作為植物啟動子、誘導(dǎo)子或刺激物參與植物生長調(diào)節(jié)[5]。

以往的研究發(fā)現(xiàn)黃原膠具有一定的生理活性[5]，但是對于黃原膠促進(jìn)植物生長方面鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在大麥種子萌發(fā)和幼苗生長階段通過不同方式添加不同濃度的黃原膠溶液，研究其對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，以期篩選最佳施用方式和最佳施用濃度。

1 材料與方法

1.1 材 料

大麥(HordeumvulgareL.)，中糧麥芽(大連)有限公司；黃原膠，山東阜豐發(fā)酵有限公司；霍格蘭營養(yǎng)液，上海鈺博生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 種子處理

選取顆粒飽滿的大麥種子15份，每份100粒，置于燒杯中，加入50 mL 3%的次氯酸鈉浸泡種子10 min，用50 mL去離子水清洗3遍。將大麥分別浸入50 mL去離子水(CK)、1 mg/L(A)、10 mg/L(B)、100 mg/L(C)、200 mg/L(D)的黃原膠溶液中，環(huán)境溫度保持20 ℃，浸泡24 h。每個(gè)處理100粒，3組平行。之后用去離子水沖洗去除種子表面黃原膠溶液，沖洗干凈的種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入10 mL去離子水。大麥種子于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中避光發(fā)芽3 d，發(fā)芽溫度22 ℃，濕度95%，在發(fā)芽過程中保持大麥種子表面濕潤，使大麥發(fā)芽充分。第3天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

1.2.2 幼苗處理

將發(fā)芽結(jié)束的幼苗從培養(yǎng)箱中移出，采用霍格蘭營養(yǎng)液進(jìn)行水培，待大麥幼苗長至兩葉一心時(shí)對葉片進(jìn)行表面噴施處理，并在營養(yǎng)液中添加體積分?jǐn)?shù)10%的黃原膠溶液。實(shí)驗(yàn)共設(shè)15個(gè)處理組，分別為CK1(僅去離子水浸種)、CK2(去離子水浸種，噴施1 mg/L黃原膠)、CK3(去離子水浸種，營養(yǎng)液添加10% 1 mg/L黃原膠)；A1(1 mg/L 黃原膠浸種)、A2(1 mg/L黃原膠浸種，噴施1 mg/L黃原膠)、A3(1 mg/L黃原膠浸種，營養(yǎng)液添加10% 1 mg/L黃原膠)；B1(10 mg/L黃原膠浸種)、B2(10 mg/L黃原膠浸種，噴施10 mg/L 黃原膠)、B3(10 mg/L黃原膠浸種，營養(yǎng)液添加10% 10 mg/L黃原膠)；C1(100 mg/L黃原膠浸種)、C2(100 mg/L黃原膠浸種，噴施100 mg/L 黃原膠)、C3(100 mg/L黃原膠浸種，營養(yǎng)液添加10%、100 mg/L黃原膠)；D1(200 mg/L黃原膠浸種)、D2(200 mg/L黃原膠浸種，噴施200 mg/L黃原膠)、D3(200 mg/L黃原膠浸種，營養(yǎng)液添加10% 200 mg/L黃原膠)。每個(gè)處理設(shè)2組平行實(shí)驗(yàn)，每組50株幼苗。

1.2.3 發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)測定

發(fā)芽勢(Gp)=n/N×100%

式中：n為規(guī)定天數(shù)內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)，N為種子總數(shù)。

發(fā)芽率(Gv)=no/No×100%

式中：no為結(jié)束發(fā)芽時(shí)發(fā)芽種子數(shù)，No為種子總數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)(Gi)=∑Gt/t

式中：Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，t為時(shí)間，d。

活力指數(shù)(Vi)=GiS

式中：S為最后1 d的幼苗生長勢(根干重)。

1.2.4 幼苗相關(guān)指標(biāo)測定

大麥幼苗處理21 d后，測定各處理組大麥幼苗生理指標(biāo)(株高、根長、濕重)、葉綠素含量、抗氧化酶活性(POD、CAT、SOD)、膜脂抗氧化程度(丙二醛(MDA)含量)、幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性[6]。

1.2.4.1 生理指標(biāo)

測量大麥幼苗株高和根長，稱重。

1.2.4.2 葉綠素含量的測定

取大麥葉片0.5 g于研缽中，加入少量石英石及碳酸鈣粉，加入80%丙酮2～3 mL，研磨成勻漿，用80%丙酮沖洗研缽并轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶，定容。搖勻后，3 000 r/min離心10 min，取上清液在波長663、645、652和440 nm下測定吸光度(以80%丙酮為空白)。計(jì)算葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量[7]。

ca=12.21A663-2.81A645

cb=20.13A645-5.03A663

1.2.4.3 抗氧化酶活性

POD活性的測定[8]：取大麥葉片0.5 g于研缽中，加入20 mmol/L的KH2PO4溶液25 mL研磨，10 000 r/min離心10 min，上清液冷藏，殘?jiān)?5 mL KH2PO4再提取一次，合并上清液。取兩只比色皿，一只加入反應(yīng)液3 mL和KH2PO41 mL為對照，另一只加入反應(yīng)混合液3 mL 和酶液1 mL(活性過高可稀釋)。470 nm波長下測吸光度，每30 s讀數(shù)一次。以每分鐘吸光度的變化值表示酶活性。

CAT活性的測定[8]：取大麥葉片1.0 g于預(yù)冷的研缽中，加入50 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液(PBS)8 mL，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液即為酶液。PBS(0.15 mmol/L pH 7.0)取200 mL加入0.309 2 mL 30% H2O2溶液混合均勻?yàn)榉磻?yīng)液。取3 mL反應(yīng)液加0.1 mL酶液，以PBS為對照，240 nm波長下測定40 s內(nèi)OD值的變化。以每分鐘OD降低0.01為一個(gè)酶活性單位。

SOD活性的測定[8]：取大麥葉片2.5 g于研缽中，加入pH 7.8磷酸緩沖溶液冰浴研磨成勻漿，定容至25 mL，12 000 r/min冷凍離心20 min。取質(zhì)地相同的比色管，兩只對照，一只避光保存，與其他各比色管同時(shí)置于4 000 lx光照下反應(yīng)30 min，反應(yīng)溫度25～35 ℃，以避光的比色管為空白對照，在560 nm下比色，計(jì)算SOD活性。

式中：A0為對照管吸光度；As為樣品管吸光度；Vt為樣品液總體積，mL；V1為測定時(shí)樣品用量，mL；mf為樣品鮮重，g。

1.2.5 膜脂抗氧化程度

取大麥葉片1.0 g于研缽中，加入10%三氯乙酸(TCA)2 mL和少量石英石，研磨勻漿，再加入8 mL TCA進(jìn)一步研磨，轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃下4 000 r/min離心10 min，吸取上清液2 mL(對照加2 mL去離子水)加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸(TBA)，充分混勻后沸水浴15 min。迅速冷卻離心，取上清液測532、600、450 nm下吸光度。

MDA質(zhì)量摩爾濃度=6.45(A532-A600)-0.56A450

1.2.6 幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性

幾丁質(zhì)酶活性的測定[9-10]：稱取大麥葉片1.0 g于預(yù)冷的研缽中，加0.1 mol/L的乙酸緩沖液(pH 5.0)5 mL冰浴研磨，12 000 r/min離心10 min，上清液在12 000 r/min下再離心10 min，上清液置于冰箱保存。取酶液0.4 mL，加入40 mL 1%蝸牛酶，37 ℃水浴反應(yīng)30 min后加入0.2 mL飽和硼砂，放在沸水浴中7 min，冷卻后加入2 mL冰醋酸和1 mL 1%對二甲氨基苯甲醛(DMAB)，37 ℃保溫15 min，585 nm下測定吸光度。酶活性單位(U)定義：每克植物材料產(chǎn)生1 mmol N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。

β-1，3-葡聚糖酶活性的測定[11]：稱取大麥葉片0.5 g于預(yù)冷的研缽中，加0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)3 mL和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.0 5 g，在冰浴中充分研磨，4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，上清液在12 000 r/min下再離心10 min，所得上清液即為粗酶液，放于冰箱保存。取1 mg/mL的昆布多糖(溶于醋酸鈉緩沖液)0.4 mL，加入0.1 mL酶液，于37 ℃保溫15 min，立即加入0.5 mL銅試劑混勻，并于100 ℃ 水浴10 min，置冷水中冷卻，再加入砷鉬酸試劑0.5 mL，呈現(xiàn)藍(lán)色后加去離子水3.5 mL，搖勻，660 nm波長下測定其吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品液的還原糖含量。一個(gè)酶活性單位(U)定義：每克植物材料產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃原膠施用質(zhì)量濃度對大麥種子發(fā)芽的影響

從表1中可以看出，施用黃原膠浸種能夠顯著影響大麥種子發(fā)芽，A、B兩個(gè)處理組發(fā)芽率均顯著提升，其中處理A(1 mg/L黃原膠浸種)與CK(去離子水浸種)相比發(fā)芽率提升了10%，處理B(10 mg/L黃原膠)與CK相比發(fā)芽率提升了4%，處理C(100 mg/L黃原膠)和處理D(200 mg/L 黃原膠)發(fā)芽率有所下降，這可能是黃原膠濃度過高引起的。低濃度的黃原膠溶液能夠顯著地促進(jìn)大麥種子發(fā)芽率的提高。從發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)來看，處理A和B顯著優(yōu)于CK，說明低濃度的黃原膠溶液能夠顯著促進(jìn)大麥種子發(fā)芽，最適質(zhì)量濃度為1 mg/L，高質(zhì)量濃度的黃原膠則有一定的抑制作用。

表1 黃原膠施用濃度對大麥種子發(fā)芽的影響

2.2 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗生長的影響

從表2中可以看出，黃原膠能夠顯著影響大麥幼苗的生長。從平均濕重看，處理B顯著優(yōu)于其他各處理組，處理A和處理C相比于CK也有明顯提高。從株高看，處理B和處理C的株高顯著高于對照。從根長看，各處理組根長基本持平且略低于對照組。同時(shí)可以看到，在葉面噴施黃原膠對株高的影響更為顯著，在營養(yǎng)液中添加黃原膠對根長有較大的影響，而且僅浸種處理的大麥幼苗相對于其他兩種方式處理的大麥幼苗并沒有特別明顯的差距，說明僅僅在浸種階段添加黃原膠已經(jīng)能夠有效的促進(jìn)大麥種子的發(fā)芽。

表2 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗生長的影響

2.3 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗葉綠素含量的影響

從圖1中可以看出，經(jīng)過黃原膠處理的大麥幼苗嫩葉中葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量與對照相比變化并不顯著，而通過葉面噴施黃原膠能夠有效提高葉綠素質(zhì)量濃度。當(dāng)黃原膠質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí)，在葉面噴施黃原膠溶液相比于僅浸種處理的大麥幼苗，葉綠素質(zhì)量濃度提升了18%。另外，黃原膠對葉綠素a的影響更大，而對葉綠素b影響相對較小。

圖1 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗葉綠素質(zhì)量濃度的影響

2.4 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗抗氧化酶活性的影響

2.4.1 對POD活性的影響

從圖2可以看出，黃原膠能夠顯著提升大麥幼苗中POD活性，提升的幅度隨黃原膠質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當(dāng)黃原膠質(zhì)量濃度為1 mg/L 時(shí)相比于空白POD活性增加了20%。在葉片表面施用黃原膠溶液更能有效提升POD酶活性，當(dāng)黃原膠質(zhì)量濃度為1和10 mg/L時(shí)，相對于空白POD酶活性分別提升了19.5%和20.7%。在營養(yǎng)液中添加黃原膠對POD酶活性并沒有顯著影響。

圖2 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗POD活性的影響

2.4.2 CAT活性的影響

從圖3可以看出，低濃度的黃原膠溶液能夠有效提升CAT酶的活性，高濃度黃原膠對CAT酶活性稍有抑制。黃原膠質(zhì)量濃度為1和10 mg/L 時(shí)影響最為顯著，分別提升了34.7%和41.5%。葉面噴施的效果優(yōu)于在營養(yǎng)液中添加黃原膠。其中10 mg/L的黃原膠溶液在葉面噴施時(shí)CAT酶活力最高，為0.993 U/(g·min)；10 mg/L 的黃原膠溶液在營養(yǎng)液中添加的CAT酶活力為0.940 U/(g·min)。

圖3 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗CAT活性的影響

2.4.3 對SOD活性的影響

從圖4可以看出，用黃原膠處理大麥幼苗能夠提升SOD的酶活力，低濃度黃原膠效果更好，1、10、100和200 mg/L分別提升了15.6%、22.2%、13.2%和5.0%。在大麥幼苗葉片表面噴施黃原膠效果最好，黃原膠質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)SOD酶活力最高，為215.32 U/(g·h)。結(jié)果表明，低濃度的黃原膠能夠提升SOD酶活力，隨著黃原膠濃度的升高而逐漸失去作用。

圖4 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗SOD的影響

2.5 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對膜脂抗氧化程度的影響

由圖5可以看出，低濃度的黃原膠能夠有效降低大麥葉片的膜脂氧化程度，與對照相比1 mg/L 的黃原膠MDA質(zhì)量摩爾濃度降低了8%，10 mg/L的黃原膠MDA質(zhì)量摩爾濃度降低了28%。而高濃度的黃原膠溶液反而加劇了膜脂過氧化程度。就施加方式而言，在葉面噴施黃原膠溶液比在營養(yǎng)液中添加黃原膠溶液更能夠避免膜脂的過氧化程度，質(zhì)量濃度為10 mg/L的黃原膠浸種且葉面噴施黃原膠的大麥幼苗MDA質(zhì)量摩爾濃度最低，為3.28 mmol/g。

圖5 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗葉膜脂抗氧化程度的影響

2.6 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活力的影響

2.6.1 對幾丁質(zhì)酶活力的影響

從圖6可以看出來，僅用黃原膠浸種對大麥幼苗葉片的幾丁質(zhì)酶活力影響不大，但是通過在葉面表面施用黃原膠溶液能有效提高幾丁質(zhì)酶活力，而在營養(yǎng)液中添加黃原膠溶液，在濃度低的情況下也能提升幾丁質(zhì)酶活力，高濃度的黃原膠則影響不大。其中葉片表面噴灑1 mg/L黃原膠時(shí)幾丁質(zhì)酶活力最大，為6.81 U/g，其次是在營養(yǎng)液中添加1 mg/L黃原膠，幾丁質(zhì)酶活力為6.30 U/g。

圖6 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗幾丁質(zhì)酶活力的影響

2.6.2 對β-1，3-葡聚糖酶活力的影響

從圖7中可以看出，無論是哪種施加方式，黃原膠都能夠提升大麥幼苗葉片中β-1，3-葡聚糖酶的活性。而在營養(yǎng)液中添加黃原膠，低濃度有促進(jìn)作用，2個(gè)高濃度處理反而降低了大麥幼苗葉片中β-1，3-葡聚糖酶活力。

圖7 黃原膠施用方式及質(zhì)量濃度對大麥幼苗β-1，3-葡聚糖酶活力的影響

3 結(jié) 論

黃原膠能夠?qū)Υ篼湻N子萌發(fā)及幼苗生長起到促進(jìn)作用，提升大麥幼苗品質(zhì)。結(jié)果表明，黃原膠能夠促進(jìn)大麥種子萌發(fā)，黃原膠溶液質(zhì)量濃度為1 mg/L對大麥種子發(fā)芽的促進(jìn)效果最為顯著。低濃度的黃原膠通過葉面噴施的方式處理大麥幼苗可有效提升大麥幼苗品質(zhì)。當(dāng)葉面噴施質(zhì)量濃度為1 mg/L的黃原膠溶液時(shí)，葉綠素質(zhì)量濃度提升了18%，POD活性提高了20%，同時(shí)幼苗的膜脂氧化程度也降低；當(dāng)噴施的黃原膠質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，CAT活性和SOD活性分別提升了41.5%和22.2%。黃原膠還能提升幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活力，從而提升大麥幼苗的抗病能力。