堿提甘蔗皮多糖提取工藝、初步結(jié)構(gòu)及其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

王萱萱，劉春宇，謝貝昱，張淑淑，王丹陽，朱振元

天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457

0 引言

【研究意義】甘蔗（Saccharumofficinarum）為禾本科（Poaceae）甘蔗屬（Sacchrum）的一種多年生高大實(shí)心草本高光效C4植物，是重要的糖料與生物能源作物，主要生產(chǎn)國是巴西、印度和中國等國家[1]。甘蔗皮作為一種廢棄物，約占甘蔗本身重量的20%，富含纖維、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、蔗糖、天然色素等物質(zhì)[2]。然而，大多數(shù)甘蔗皮被當(dāng)作加工副產(chǎn)物丟棄，造成一定的資源浪費(fèi)，開展甘蔗皮堿提多糖結(jié)構(gòu)和活性研究，旨在為甘蔗皮多糖的綜合開發(fā)應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，對廢棄資源的再利用有著重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，以甘蔗皮為原料的研究主要集中在甘蔗皮黃酮、多酚及花色苷的提取分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性等方面。周慧芳[3]采用超聲輔助法提取甘蔗皮黃酮，通過有機(jī)溶劑萃取、聚酰胺層析、葡聚糖凝膠色譜和制備液相色譜分離得到黃酮單體，通過質(zhì)譜、核磁、紅外光譜分析了黃酮單體的結(jié)構(gòu)，此外，甘蔗皮黃酮表現(xiàn)出良好的抑菌活性、抗氧化活性和降血糖活性；陳純[4]采用超聲波法提取甘蔗皮多酚，利用X-5樹脂對甘蔗皮多酚進(jìn)行純化，通過DPPH·自由基清除法和FRAP法兩種體系表明甘蔗皮多酚具有一定的抗氧化活性，隨著多酚濃度的升高，抗氧化能力越強(qiáng)；閆懷峰等[5]采用溶劑法提取甘蔗皮中的花色苷，并用輔色劑對花色苷的輔色作用進(jìn)行了研究。植物多糖含有大量的細(xì)胞壁多糖，采用適當(dāng)濃度的堿溶液可從熱水浸提的殘?jiān)欣^續(xù)提取出細(xì)胞壁結(jié)合多糖，使不溶性多糖轉(zhuǎn)化為可溶性多糖，從而提高多糖得率。田洛等[6]采用堿提取法提取黃芪多糖，黃芪多糖的提取率達(dá)到水提取法的3.25倍。此外，研究表明堿性溶液提取的多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和抗衰老等多種生物活性。焦中高等[7]研究表明，堿提紅棗多糖是一種優(yōu)良的自由基清除劑和α-葡萄糖苷酶及透明質(zhì)酸酶抑制劑，利用堿提工藝可提高紅棗資源的利用率，并獲得高活性的紅棗多糖?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，甘蔗皮水溶性多糖、黃酮、多酚和花色苷有一些研究，但堿溶液提取甘蔗皮多糖的提取工藝條件、結(jié)構(gòu)表征及其生物活性尚鮮有報道，堿提甘蔗皮多糖的得率、構(gòu)效關(guān)系有待研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以甘蔗皮為原料，利用單因素、響應(yīng)面試驗(yàn)確定堿提甘蔗皮多糖的最佳提取工藝；綜合運(yùn)用GC-MS、FT-IR等現(xiàn)代儀器分析技術(shù)對堿提甘蔗皮多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；并以體外α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，評價堿提甘蔗皮多糖降血糖效果，旨在為甘蔗皮多糖在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)加工等領(lǐng)域的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2019—2020年在天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

黑皮甘蔗，購自海南省三亞市，保存于實(shí)驗(yàn)室。單糖標(biāo)準(zhǔn)品（L-鼠李糖，D-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖）、α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖水合物、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖糖苷（4-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside）購自美國 Sigma公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（T-10、T-40、T-70、T-110、T-500、T-2000）購自北京索萊寶科技有限公司；試驗(yàn)用其他有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent-1260 infinity Ⅱ高效液相色譜系統(tǒng)，美國安捷倫公司；Scion TQ氣相色譜-質(zhì)譜儀，美國布魯克公司；IS 50傅里葉紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；SP-2102UV紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；RE-52AA真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TGL-16B臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 堿提甘蔗皮多糖的提取工藝 甘蔗→清洗后去皮→烘干→粉碎→過篩→稱取粉末→氫氧化鈉堿溶液提取→多糖浸提液→濃縮→乙醇沉淀→離心→甘蔗皮粗多糖→除蛋白→除色素→堿提甘蔗皮多糖。

1.3.2 操作要點(diǎn) 將新鮮的甘蔗清洗干凈后去皮，置于60℃烘箱內(nèi)烘干。使用粉碎機(jī)將甘蔗皮粉碎，過60目篩，備用。精確稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照料液比1﹕50（g·mL-1）加入6%氫氧化鈉溶液，于35℃恒溫水浴提取1 h，沉淀物重復(fù)以上操作2次，于4 000 r/min離心15 min后，加入HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0，收集上清液，即多糖浸提液。將上清液在60℃條件下濃縮至一定體積后，按照1﹕4（v﹕v）的比例加入無水乙醇，4℃醇沉靜置過夜。4 000 r/min離心15 min后收集沉淀，得到堿提甘蔗皮粗多糖[8]。粗多糖采用Sevge法除蛋白、AB-8樹脂除色素進(jìn)行純化[9]，冷凍干燥后，得到精制的堿提甘蔗皮多糖，命名為SPAP。

1.3.3 堿提甘蔗皮多糖提取單因素試驗(yàn)

（1）提取溫度對堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照氫氧化鈉濃度2%，料液比1﹕30（g·mL-1），提取時間1 h，提取次數(shù)1次，考察不同提取溫度（15、25、35、45和55℃）對堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

（2）NaOH溶液濃度對堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照提取溫度35℃，料液比1﹕30（g·mL-1），提取時間1 h，提取次數(shù)1次，考察不同NaOH濃度（2%、4%、6%、8%和10%）對堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

（3）料液比對堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照提取溫度35℃，氫氧化鈉濃度6%，提取時間1 h，提取次數(shù)1次，考察不同料液比（1﹕20、1﹕30、1﹕40、1﹕50和1﹕60 g·mL-1）對堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

（4）提取時間對堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照提取溫度35℃，氫氧化鈉濃度6%，料液比1﹕50（g·mL-1），提取次數(shù)1次，考察不同提取時間（1、1.5、2、2.5和3 h）對堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

（5）提取次數(shù)對堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照提取溫度35℃，氫氧化鈉濃度6%，料液比1﹕50（g·mL-1），提取時間1 h，考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4和5 次）對堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

1.3.4 堿提甘蔗皮多糖Box-Behnken中心組合試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計原理，選取提取溫度、NaOH濃度、料液比、提取次數(shù)4個因素為自變量，以堿提甘蔗皮多糖得率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 8.0.7軟件對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計，對堿提甘蔗皮多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。Box-Behnken中心組合試驗(yàn)各因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 堿提甘蔗皮多糖基本成分的測定 采用苯酚-硫酸法[10]測定堿提甘蔗皮多糖中性糖的含量，分別精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 mg·mL-1）0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置于具塞試管中，加入蒸餾水補(bǔ)足至1 mL；然后加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液，再依次垂直滴加5 mL濃硫酸，用渦旋混合儀充分振蕩混合，常溫靜置15 min至冷卻，在λ＝490 nm處測定其吸光度值。經(jīng)回歸分析得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.0411x+0.0064，R2=0.9992（其中，y代表吸光度，x代表葡萄糖濃度）。采用硫酸-咔唑法[11]測定堿提甘蔗皮多糖糖醛酸的含量，分別精確吸取半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 mg·mL-1）0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置于10 mL具塞試管中，加入蒸餾水補(bǔ)足至1 mL；在冰水浴中向各管加入5 mL硼砂-硫酸溶液，混勻后沸水浴中加熱5 min，取出后冷卻至室溫；再加入 0.1%咔唑溶液 0.2 mL，渦旋30 s，沸水浴5 min，冷卻后測定各管在523 nm處的吸光度。經(jīng)回歸分析得到半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8.5169x-0.0097，R2=0.9990（其中，y代表吸光度，x代表半乳糖醛酸濃度）。分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算中性糖及糖醛酸含量，多糖提取得率按照公式計算：

式中：m為堿提甘蔗皮粗多糖質(zhì)量（g），M為甘蔗皮粉末質(zhì)量（g）。

1.3.6 堿提甘蔗皮多糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析

1.3.6.1 堿提甘蔗皮多糖的含量測定 精確稱取精制后的堿提甘蔗皮多糖，將其配成濃度為 1 mg·mL-1的溶液，按照1.3.5中所述方法測定并計算堿提甘蔗皮多糖的含量。

1.3.6.2 堿提甘蔗皮多糖的純度鑒定 將精制后的多糖用蒸餾水溶解配制成濃度為1 mg·mL-1的溶液，利用紫外分光光度計（SP-2102UV）在波長為 190—400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.3.6.3 堿提甘蔗皮多糖分子量分布的測定（HPLC）采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）對多糖樣品分子量進(jìn)行測定[12]。精確稱取樣品2 mg溶于1 mL超純水，過水膜后，取20 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析。色譜條件：色譜柱：TSK gel G4000 PWXL column（7.8 mm×300 mm）；檢測器：折射率檢測器（RID）；流動相：超純水；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：35℃。以葡聚糖T-2000、T-500、T-110、T-70、T-40和T-10（分子量分別為 2 000 000、500 000、110 000、70 000、40 000和10 000 Da）為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)分子量及保留時間繪制分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.4 堿提甘蔗皮多糖的紅外光譜分析（FT-IR）將干燥的多糖樣品1 mg與干燥的KBr 150 mg混合，研磨均勻后利用壓片機(jī)將其壓成透明薄片。利用傅里葉變換紅外光譜儀（Thermo Nicolet Corporation，USA）進(jìn)行掃描[13]。掃描范圍：400—4 000 cm-1，分辨率：4 cm-1，掃描次數(shù)：16。

1.3.6.5 堿提甘蔗皮多糖的單糖組成分析 堿提甘蔗皮多糖的單糖組成參考ZHANG等[14]的氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測定。稱取樣品（5 mg）置于具塞試管中，用2 mL 2.0 mol·L-1TFA（三氟乙酸）在110℃水解 3 h。水解后，向全水解樣品中加入鹽酸羥胺（10 mg），內(nèi)標(biāo)物肌醇六乙酸酯（2 mg）和吡啶（0.5 mL），振蕩均勻后，于90℃油浴鍋中反應(yīng)30 min。冷卻后，繼續(xù)加入醋酸酐（0.5 mL）于90℃油浴下反應(yīng)30 min。得到的糖精乙酸酯衍生物用N2吹干，加入1 mL二氯甲烷重新溶解，取0.2 μL進(jìn)行氣質(zhì)色譜分析。色譜條件：色譜柱：HP-5MS（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）；檢測器：氫火焰電離檢測器（FID）；載氣：N2；流速1.0 mL·min-1；程序升溫：100℃保持 2 min→260℃（10℃·min-1）→260℃保持3 min。6種單糖（L-鼠李糖，D-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖）處理方式同上。

1.3.7 堿提甘蔗皮多糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用α-葡萄糖苷酶抑制活性的反應(yīng)體系參照 LIU等[15]的方法，并略作改進(jìn)。分別配制 0.1 moL·L-1磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH 6.8）、0.6252 mmoL·L-1PNPG 溶液（PBS 溶解）、1 U·mL-1α-葡萄糖苷酶酶液（PBS溶解）以及 0.1 moL·L-1Na2CO3溶液（PBS溶解）；待測樣品用蒸餾水溶解，采用倍比稀釋法稀釋至濃度為4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg·mL-1的待測液。用阿卡波糖作為陽性對照，同樣將濃度稀釋為 4、2、1、0.5、0.25 和 0.125 mg·mL-1。取40 μL的樣品，加入到96孔板中，然后加入40 μL的酶液（1 U·L-1），混勻，于37℃黑暗中孵育10 min，加入20 μL的PNPG溶液，于37℃黑暗中孵育 30 min，最后加入 0.1 moL·L-1Na2CO3溶液100 μL結(jié)束反應(yīng)，于410 nm波長測OD值，每組做3個平行。按照公式計算抑制率，溶液具體加入量見表2。

表2 堿提甘蔗皮多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用試驗(yàn)設(shè)計Table 2 Experimental design of polysaccharide with alkaline-extracted from sugarcane peel on α-Glucosidase inhibition

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Design Expert 8.0.7軟件對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計分析、Origin 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與作圖，并利用SPSS 20.0軟件中的Duncan法進(jìn)行方差分析，以P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溫度對甘蔗皮多糖提取的影響 不同提取溫度對堿提甘蔗皮多糖得率的影響如圖1所示，當(dāng)溫度在15—35℃，堿提甘蔗皮多糖得率隨著溫度升高而增加；當(dāng)提取溫度為35℃時，多糖得率達(dá)到最大值5.86%；當(dāng)溫度超過35℃后，多糖得率反而下降。一定程度上升高提取溫度會增加樣品多糖的溶出，提高多糖得率，但是過高的提取溫度可能會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，致使多糖得率低[16]。因此，選擇提取溫度為35℃。

2.1.2 NaOH濃度對堿提甘蔗皮多糖得率的影響 堿液濃度在2%—6%時，堿提甘蔗皮多糖得率隨堿液濃度升高而增加；當(dāng)NaOH濃度超過6%后，堿提甘蔗皮多糖得率反而下降，可能堿液濃度過高會破壞多糖結(jié)構(gòu)[17]；當(dāng)NaOH濃度為6%時，其多糖得率最高為6.82%（圖2）。綜合考慮各項(xiàng)因素，選擇NaOH濃度為6%效果最佳。

2.1.3 料液比對堿提甘蔗皮多糖得率的影響 隨著料液比的增加，在 1﹕20—1﹕40（g·mL-1）范圍內(nèi)，堿提甘蔗皮多糖得率呈現(xiàn)升高趨勢。當(dāng)料液比過低時，溶液多黏稠狀，細(xì)胞空化不完全，導(dǎo)致多糖提取不徹底；當(dāng)料液比過高時，會使得溶液體積過大，不易后續(xù)的分離操作并且浪費(fèi)資源[18-19]。當(dāng)料液比為1﹕50（g·mL-1）時，堿提甘蔗皮多糖得率出現(xiàn)峰值為6.82%（圖 3）。因此，選取料液比為 1﹕50（g·mL-1）最合適。

2.1.4 提取時間對堿提甘蔗皮多糖得率的影響 在1.0—3.0 h內(nèi)，隨著提取時間的增加，曲線呈現(xiàn)一條直線，波動較小，表明堿提甘蔗皮多糖得率基本不變，多糖得率約為7.5%（圖4）。其他條件一定，綜合考慮成本、資源利用等因素[20]，選擇提取時間為1 h。

2.1.5 提取次數(shù)對堿提甘蔗皮多糖得率的影響 提取次數(shù)為1—4次時，堿提甘蔗皮多糖得率與提取次數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)；當(dāng)提取次數(shù)為 4次時，多糖得率達(dá)到10.96%；當(dāng)提取次數(shù)大于4次，隨著提取次數(shù)的增加，多糖得率沒有顯著性變化（圖5）。因此，提取次數(shù)4次最優(yōu)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化堿提甘蔗皮多糖提取工藝

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度（A）、NaOH濃度（B）、料液比（C）、提取次數(shù)（D）為自變量，以甘蔗皮堿提多糖得率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計四因素三水平試驗(yàn)方法，共包括29組試驗(yàn)方案，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及數(shù)值分析 利用Design Expert軟件對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到堿提甘蔗皮多糖提取率的回歸方程：

Y=10.87+0.093A-0.066B+0.042C+0.076D+0.037AB+（2.500E-003）AC+0.083AD+0.20BC-0.30BD+ 0.012CD-0.11A2-0.15B2-0.11C2-0.28D2

由表 4可見該模型顯著（P＜0.0001），失擬項(xiàng)P=0.0641＞0.05，不顯著。R2=0.9048，表明90%的數(shù)據(jù)可以用這個方程解釋。各因素影響堿提甘蔗皮多糖得率的主次順序?yàn)?A＞D＞B>C，即提取溫度＞提取次數(shù)＞NaOH濃度＞料液比。失擬項(xiàng)各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析表明該模型失擬不顯著，因此該二次方程能夠較好地擬合真實(shí)的響應(yīng)面。另外，由表4和圖6分析可知，交互因素中，BC、BD 交互作用顯著，A2、B2、C2和D2均達(dá)到顯著。經(jīng)軟件預(yù)測分析得到堿提甘蔗皮多糖得率的最佳條件為：提取溫度 37.52℃，NaOH濃度5%、料液比為46.69 mL·g-1，提取次數(shù)為4.72次，因此，為避免資源浪費(fèi)以及實(shí)際試驗(yàn)操作的方便，將堿提甘蔗皮多糖得率的最佳條件修改為提取溫度37℃，NaOH濃度5%、料液比為46 mL·g-1，提取次數(shù)為 4次，相應(yīng)提取液中甘蔗皮多糖含量為10.98 mg·g-1。在修正后的最佳條件下重復(fù)3次平行試驗(yàn)，得到甘蔗皮多糖含量平均值為10.84%，與模型預(yù)測值相對誤差為1.28%，說明模型預(yù)測值與試驗(yàn)實(shí)際值符合度較高，該回歸模型參數(shù)合理，能真實(shí)反映各因素對堿提甘蔗皮多糖得率的影響。

表4 方差表分析Table 4 Analysis of variance table

2.3 堿提甘蔗皮多糖的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 堿提甘蔗皮多糖的分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法和高效液相色譜法對多糖的分子量分布進(jìn)行檢測。以保留時間為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量對數(shù)為縱坐標(biāo)，得到以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程y=-0.3395x+9.2104（y=lgMw，x=Rt），R2=0.9953。如圖7所示，經(jīng)除色素、除蛋白后的堿提甘蔗皮多糖高效液相色譜圖為單一峰，說明分子量相對均勻[21]。經(jīng)檢測，SPAP中性糖含量為（86.54±0.98）%，糖醛酸含量為（2.82±0.28）%。將多糖的出峰時間（t=8.039 min）代入回歸方程，計算得 SPAP的分子量為 3.03×103kD。張斌[22]研究表明，甘蔗滓水提多糖主要由兩個組分組成，分子量分別為1.93×104Da和7.523×103Da，這些差異表明甘蔗不同部位及不同提取方式等會引起多糖間分子量的極大差異。

2.3.2 多糖純度的鑒定 堿提甘蔗皮多糖 SPAP的紫外-可見光全波長掃描結(jié)果如圖8所示，SPAP在260和280 nm處基本無吸收峰，表明多糖中基本不含蛋白和核酸[23]。

2.3.3 單糖組成分析 SPAP經(jīng)TFA降解，吡啶和乙酸酐衍生化后進(jìn)行GC-MS分析。如圖9所示，混標(biāo)中1—7的出峰順序依次代表鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和內(nèi)標(biāo)肌醇六乙酸酯。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時間對堿提甘蔗皮多糖水解樣品中的色譜峰進(jìn)行定位，并按照mi=Ai·ms·f/As公式計算樣品中各單糖的含量及比例（Ai、As分別代表待測組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積；mi、ms分別代表待測組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量；f為相對校正因子，計算公式：f=（m0/As）/（mi/A0），A0為標(biāo)準(zhǔn)單糖的峰面積，m0為標(biāo)準(zhǔn)單糖組分的質(zhì)量和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量）[24]。從圖中可以看出，SPAP主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成，其中木糖為主要成分。經(jīng)計算，SPAP中鼠李糖﹕阿拉伯糖﹕木糖﹕甘露糖﹕葡萄糖﹕半乳糖的摩爾比為0.47﹕5.75﹕15.47﹕1.00﹕3.22﹕2.32。

2.3.4 堿提甘蔗皮多糖的紅外光譜分析 采用 KBr壓片法對SPAP進(jìn)行FT-IR分析，在4 000—450 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜如圖10所示。在3 404.708 cm-1處有一寬峰，是多糖特征的-OH和水的O-H鍵之間的伸縮振動引起；2 920.663 cm-1處為C-H伸縮振動[25]；1 632.447 cm-1處有一強(qiáng)吸收峰，是由-COOH或-CO基團(tuán)的C=O非對稱伸縮振動引起，表示含有醛基-CHO，一般糖分子結(jié)合水在此區(qū)域都有吸收峰[26]；1 420.798 cm-1周圍的吸收峰是C-H的變角振動，以上4處為多糖的特征吸收峰[27]。1 152.741 cm-1、1 072.710 cm-1、1 043.783 cm-13處特征吸收峰表明SPAP中含有吡喃型糖苷鍵，可能存在α-(1→6)糖苷鍵；897 cm-1附近的吸收峰表示SPAP中存在β型糖苷鍵[28]。FT-IR結(jié)果表明，SPAP中的單糖是吡喃糖基型，可呈現(xiàn)α或β構(gòu)型。

2.4 堿提甘蔗皮多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

當(dāng)樣品濃度由 0.125 mg·mL-1增加到 4.00 mg·mL-1，抑制率由28.52%上升至78.31%，抑制曲線呈現(xiàn)先上升后逐漸平緩的趨勢，說明SPAP對α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在劑量依賴性。與陽性對照阿卡波糖相比，樣品SPAP雖不及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率，但在 4.00 mg·mL-1時，抑制率達(dá)到78.31%，有較好的抑制作用（圖11）。IC50值越低，說明樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用越好，經(jīng)計算，阿卡波糖的IC50為0.178 mg·mL-1，堿提甘蔗皮多糖的IC50為0.3 mg·mL-1，SPAP的 IC50值略高于陽性對照。以上結(jié)果說明，堿提甘蔗皮多糖對α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用。

3 討論

據(jù)研究，多糖的提取工藝主要有超聲解法、酶解法及水提醇沉解法等[29-30]。堿解法是一項(xiàng)經(jīng)驗(yàn)成熟的多糖提取方法，能夠準(zhǔn)確、快速及穩(wěn)定地提取多糖。此外，堿性溶液提取可以使細(xì)胞壁結(jié)合多糖更好地轉(zhuǎn)化為可溶性多糖，該方法不僅可以提高多糖提取得率、縮短反應(yīng)時間，而且提取方法簡便、設(shè)備要求低、原料可再利用，有利于生產(chǎn)。本研究采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化堿提甘蔗皮多糖提取工藝，得到堿提甘蔗皮多糖最佳提取工藝。張斌[22]研究表明，甘蔗滓經(jīng)過脫脂、水提醇沉、Sevag法脫蛋白和透析后，得到甘蔗滓多糖的提取率為1.02%。肖亞聰[31]通過水提法、纖維素酶解法、木瓜蛋白酶解法、混合酶-超聲聯(lián)合法等不同提取方法提取甘蔗渣多糖發(fā)現(xiàn)，不同提取方法的多糖提取率有較大的差異，整體水平上看酶解-超聲聯(lián)合法都比單種酶酶解多糖提取率要高，酶解-超聲聯(lián)合法平均提取率約在 8%。本研究采用堿提多糖工藝方法與水提、酶解等提取方法相比，甘蔗皮多糖提取得率顯著提高，該工藝參數(shù)下，原料綜合利用率高，同時可有效提高產(chǎn)出和效率。

近年來，多糖由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性而備受關(guān)注[32]。據(jù)報道，許多堿性溶液多糖具有各種有用的生物學(xué)功能，例如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫活性和降血糖作用[33-36]。多糖的生物活性可能與結(jié)構(gòu)特征有關(guān)[37]，例如單糖組成及分子量分布。LI等[38]闡述了多糖的功能活性與分子量、單糖組成等幾個參數(shù)的綜合效應(yīng)有關(guān)。低分子量南瓜多糖具有較好的體外降血糖作用，原因可能是低分子量南瓜多糖中含有半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸，可以有效增強(qiáng)多糖與α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的結(jié)合。堿提甘蔗皮多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，其中木糖為主要成分。已有研究證實(shí)，含有更多阿拉伯糖或木糖殘基的多糖對α-葡糖苷酶表現(xiàn)出顯著的抑制作用。ZHANG等[14]用 5%NaOH溶液從甘草殘?jiān)刑崛?、分離、純化出一種中性多糖，該多糖由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖組成，其中木糖含量最高，且對α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出一定的抑制活性，與本研究結(jié)果一致。呂青青等[39]從麥麩獲得兩種多糖級分（WXA-1和 AXA-1），與 WXA-1相比，AXA-1的阿拉伯糖和木糖含量更高，這些原因可能導(dǎo)致AXA-1 比WXA-1具有更高的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。上述結(jié)果表明，木糖可能對α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用。但堿提甘蔗皮多糖糖苷鍵連接方式等結(jié)構(gòu)特性與生物活性之間的關(guān)系及機(jī)理機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

堿提甘蔗皮多糖（SPAP）的最佳提取條件為提取溫度37℃、NaOH濃度5%、料液比1﹕46（g·mL-1）、提取次數(shù)4次，可有效利用原料、提高產(chǎn)出和效率；由 HPLC、FT-IR、GC-MS等方面初步闡述了 SPAP的結(jié)構(gòu)特性，同時SPAP對α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出良好的抑制作用，具有一定的降糖潛力。