L-茶氨酸對CUMS抑郁大鼠海馬和腸道損傷的干預(yù)作用研究

陳美艷，劉芬，林勇,3*，左高隆，左穎鵬，劉仲華,3

-茶氨酸對CUMS抑郁大鼠海馬和腸道損傷的干預(yù)作用研究

陳美艷1,2，劉芬1,2，林勇1,2,3*，左高隆1,2，左穎鵬1,2，劉仲華1,2,3

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128

以SPF級SD雄性大鼠為實(shí)驗(yàn)動物，建立慢性不可預(yù)見輕度應(yīng)激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）大鼠模型，給予不同劑量-茶氨酸灌胃干預(yù)，觀察-茶氨酸對CUMS模型大鼠的抑郁樣行為、海馬和腸道組織病理變化，以及白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-）、5-羥色胺（5-HT）和胰高血糖素樣肽1（GLP-1）含量的影響，探討-茶氨酸干預(yù)對CUMS抑郁大鼠海馬和腸道損傷及功能異常的作用。結(jié)果表明，相比模型組，-茶氨酸各劑量組大鼠體質(zhì)量、糖水偏好、橫穿格數(shù)和站立次數(shù)、水中的活躍度、進(jìn)入明箱次數(shù)及停留時間均有不同程度的改善，中劑量組（100?mg·kg-1）達(dá)到顯著水平；-茶氨酸有效修復(fù)了CUMS造成的海馬神經(jīng)元損傷，降低了CUMS大鼠血清、結(jié)腸和盲腸中的IL-6和TNF-含量，并減輕結(jié)腸、盲腸組織的損傷和炎癥程度，且以中劑量組效果較好；-茶氨酸能增加CUMS大鼠海馬、大腦皮層以及結(jié)腸中5-HT、GLP-1的含量，部分條件下達(dá)到顯著水平。由此可見，-茶氨酸具有改善CUMS模型大鼠抑郁樣行為、修復(fù)海馬和腸道結(jié)構(gòu)損傷以及功能異常等作用，其對“腸-腦軸”的調(diào)節(jié)可能是抗抑郁的作用機(jī)制。

-茶氨酸；抑郁樣行為；海馬；腸道損傷；腸-腦軸

抑郁癥（Depression）是一種普遍存在、威脅生命、高度反復(fù)發(fā)作的精神障礙，主要由應(yīng)激性生活事件所引發(fā)，還涉及到遺傳和社會等多重因素的影響[1]，其特征是情緒低落、快感缺失和自殺率高等[2-3]。在高收入國家的成年人中，抑郁癥的患病率約為15%[4]。預(yù)計(jì)到2030年，抑郁癥在全球疾病負(fù)擔(dān)中將排名第三[5]。

抑郁的發(fā)生與大腦功能紊亂有關(guān)，尤其是大腦海馬組織損傷。大腦海馬是與情緒和認(rèn)知關(guān)系密切的重要腦區(qū)，也是調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)并受應(yīng)激影響最重要的腦部結(jié)構(gòu)之一，其結(jié)構(gòu)功能損傷是誘發(fā)抑郁癥的重要因素之一[6]。近年來，“腸-腦軸”（Gut-brain axis，GBA）理論指出，應(yīng)激反應(yīng)造成的腸道功能損傷可能與抑郁癥密切相關(guān)，是引起全身系統(tǒng)性炎癥的原因之一[7-8]。一方面，一些重要的神經(jīng)遞質(zhì)及化學(xué)介質(zhì)（如5-HT和GLP-1等）主要由腸道細(xì)胞合成分泌，腸道損傷會影響神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。另一方面，腸道受損導(dǎo)致腸道菌群變化和內(nèi)毒素進(jìn)入，能夠激活免疫系統(tǒng)，通過“腸-腦軸”上行途徑觸發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥和神經(jīng)結(jié)構(gòu)變性，造成大腦功能紊亂；激活的炎癥免疫反應(yīng)也會進(jìn)一步破壞腸道功能[9]。

-茶氨酸是茶樹中含量最高的游離氨基酸，是一種獨(dú)特的非蛋白氨基酸，2014年已被國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會批準(zhǔn)為新資源食品[10]。已有研究報(bào)道，茶氨酸具有預(yù)防糖尿病、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)和提高免疫力等保健作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，-茶氨酸對焦慮、恐慌、抑郁和強(qiáng)迫癥等精神疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用[12]；長期服用-茶氨酸是安全的，并且能夠改善重度抑郁障礙患者的抑郁癥狀[13-14]。近期，-茶氨酸的抗抑郁作用受到研究人員的廣泛關(guān)注。例如，在抑郁癥小鼠模型中，綠茶可觸發(fā)抗抑郁和抗氧化活性效應(yīng)[15]，茶氨酸能顯著減少應(yīng)激小鼠在游泳實(shí)驗(yàn)和尾部懸掛實(shí)驗(yàn)中的不動時間[16-17]；在慢性不可預(yù)見輕度應(yīng)激（CUMS）大鼠抑郁模型中，-茶氨酸可以明顯改善抑郁模型大鼠的行為學(xué)指標(biāo)[18-19]。

已有的研究主要關(guān)注-茶氨酸對抑郁行為學(xué)的影響，較少從“腸-腦軸”的角度探討-茶氨酸的抗抑郁作用?；诖?，本研究進(jìn)一步優(yōu)化給藥劑量，通過行為學(xué)指標(biāo)評價、生理生化表征和病理組織切片的觀察，進(jìn)一步探討不同劑量-茶氨酸對CUMS抑郁大鼠行為學(xué)及海馬和腸道損傷的影響，闡述相關(guān)的抗抑郁機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD雄性大鼠（SPF級）由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，體質(zhì)量為(200±20)g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼料由南通特洛菲飼料科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：蘇飼證（2019）06092。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號：倫審科2020第（50）號]；動物飼養(yǎng)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所動物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)環(huán)境條件為潔凈環(huán)境，溫度為20～25℃，相對濕度50%～70%，12?h∶12?h明暗交替（兩只28?W白熾燈，安裝于面積15?m2，高4?m的動物房頂部），每小時通風(fēng)≥15次。試驗(yàn)開始前將實(shí)驗(yàn)大鼠放置在動物房中適應(yīng)7?d，不限制飼料和水。

1.1.2 藥品與試劑

-茶氨酸（純度≥99%），購于湖南省三福生物科技有限公司；鹽酸氟西汀購于禮來蘇州制藥有限公司；五羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）、胰高血糖素樣肽1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF-）ELISA試劑盒購于華美生物工程有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾上海儀器有限公司），MIKRO 22R冷凍離心機(jī)（德國Hettich公司），AllegraX-22R臺式離心機(jī)（美國貝克曼公司），壓力蒸汽滅菌鍋（上海中安醫(yī)療器械廠），AEU-210湘儀電子天平（長沙湘儀天平儀器公司），移液槍（美國Thermo公司），病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）、石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及干預(yù)方法

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后禁水24?h，進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)，剔除不活躍的大鼠（確保建模前所有大鼠活躍度一致），按體質(zhì)量將大鼠分成6組，每組10只，分別為對照組（CK）、模型組（CUMS）、鹽酸氟西汀組（FLX）、茶氨酸低劑量組（LLT）、茶氨酸中劑量組（MLT）、茶氨酸高劑量組（HLT）。

除對照組外，其余各組大鼠每天隨機(jī)接受一種刺激，參照文獻(xiàn)[20]稍作修改，建立SD大鼠CUMS抑郁模型。刺激包括禁食（24?h）、禁水（24?h）、鼠籠45°傾斜（24?h）、照明（24?h）、水平搖晃（5?min）、夾尾巴（1?min）、禁食禁水（24?h）、濕墊料（24?h）、4℃游泳（5?min），每種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，持續(xù)刺激28?d。

1.2.2 受試物的配制

成年人（平均體重60?kg）每天飲茶量以泡飲5～15?g干茶為宜[21]，茶氨酸占茶葉干重1%～2%[22]。參照文獻(xiàn)[23]，采用千克體重劑量折算系數(shù)法，成年人和大鼠的每千克體重劑量系數(shù)為6.25，若成年人每日飲茶量為10?g，即166.67?mg·kg-1·d-1，則大鼠的飲茶劑量應(yīng)該為1?041.69?mg·kg-1·d-1（1.042?g·kg-1·d-1）。已知茶氨酸占茶葉干重2%，則1?g茶葉含0.02?g茶氨酸，故設(shè)計(jì)-茶氨酸低劑量組為20?mg·kg-1，結(jié)合課題組前期研究[19]，設(shè)計(jì)中、高劑量分別為100、500?mg·kg-1·d-1。

成年人（60?kg）鹽酸氟西汀的推薦劑量為20?mg·kg-1·d-1，參照文獻(xiàn)[24]中動物劑量換算方法，結(jié)合說明書將人體推薦劑量換算為大鼠的劑量，則大鼠氟西汀劑量為2.06?mg·kg-1·d-1。

1.2.3 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

各處理組大鼠每天早上9：00接受灌胃，對照組和模型組灌服等體積水，灌胃體積為10?mL·kg-1·d-1，連續(xù)灌胃28?d。在試驗(yàn)7、14、21、28、35?d分別測定各組大鼠體質(zhì)量，在試驗(yàn)35?d測定各組大鼠糖水偏好[24-25]（圖1）。糖水偏好測試方法為：在每個飼養(yǎng)籠中放置兩個水瓶，分別裝有200?mL蒸餾水和200?mL 1%蔗糖溶液；大鼠適應(yīng)糖水1?h后，禁水24?h，次日進(jìn)行糖水偏好測試。測量并記錄兩種液體的消耗量，糖水偏好度/%=蔗糖溶液消耗量÷（蔗糖溶液消耗量＋蒸餾水消耗量）×100%。在36、37、38?d分別進(jìn)行明暗箱實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫性游泳實(shí)驗(yàn)。在39?d，各組大鼠注射2%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，每次采血不超過5?min，并迅速于冰上解剖腦組織、海馬組織和腸道組織。

1.2.4 明暗箱實(shí)驗(yàn)

明暗箱實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[26]做適當(dāng)修改，明暗箱由兩個40?cm×40?cm×40?cm的紙箱組成，中間由40?cm×15?cm×15?cm的不透光通道連接，明箱無蓋，且中心上方40?cm處懸置一個45?W的白熾燈；暗箱上方可開合，測試開始后蓋實(shí)并加黑布覆蓋，確保全遮光。測試時，提前安置好攝像裝置，將大鼠置于暗箱，記錄7?min內(nèi)每只大鼠出現(xiàn)在明箱的次數(shù)和停留時間。

注：SPT表示糖水偏好實(shí)驗(yàn)；LDB表示明暗箱實(shí)驗(yàn)；OFT表示曠場實(shí)驗(yàn)；FST表示強(qiáng)迫性游泳實(shí)驗(yàn)

1.2.5 曠場實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[27]自制曠場箱，長×寬×高為100?cm×100?cm×50?cm的無蓋木箱，箱子底部由白色實(shí)線劃分為25個20?cm×20?cm的小方格。在裝有兩只28?W白熾燈、面積15?m2、高4?m的動物房中，提前安置好攝像裝置，保持室內(nèi)安靜，將大鼠置于木箱底部格子的正中央，操作人員迅速離開，讓大鼠自由探索5?min，且確保每只大鼠的放置位置一致；通過錄像觀察并記錄大鼠在5?min內(nèi)穿越格子的次數(shù)和站立次數(shù)（前肢同時離地的次數(shù)）。

1.2.6 強(qiáng)迫性游泳實(shí)驗(yàn)

將單只大鼠放在高80?cm，直徑40?cm的圓柱形塑料桶中，桶中水溫25℃，水高40?cm（大鼠四肢無法觸碰到桶底）?？傆斡緯r間為6?min，前2?min為適應(yīng)性游泳階段，通過雙盲法記錄后4?min大鼠的不動時間（大鼠四肢停止劃水，放棄掙扎，整個身軀呈漂浮狀態(tài)，頭部始終保持在水面以上的時間）。

1.2.7 取樣及樣品分析

所有行為學(xué)測試完成后，次日用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，于冰上斷頭取大腦皮層、海馬組織，剖腹取結(jié)腸和盲腸組織。用ELISA試劑盒檢測各處理組大鼠海馬組織、皮層組織、結(jié)腸組織中的5-HT和GLP-1，以及血清、結(jié)腸和盲腸中的IL-6和TNF-含量。另取完整腦部組織、2?cm盲腸和結(jié)腸組織，用4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，用于HE染色，腦組織還用于Nissl染色，顯微鏡下拍照觀察，利用Caseviewer圖像分析軟件（濟(jì)南丹吉爾電子有限公司）觀察大鼠海馬各區(qū)、盲腸和結(jié)腸組織的病變情況并分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 L-茶氨酸對大鼠體質(zhì)量和進(jìn)食量的影響

各組大鼠在建模過程中體質(zhì)量和進(jìn)食量的變化如表1所示。7～35?d，各處理組大鼠體質(zhì)量均增加，CK組每周增長幅度較大且穩(wěn)定，而CUMS組增長緩慢，CK組大鼠體質(zhì)量增長顯著高于CUMS組（＜0.01）。與CUMS組相比，F(xiàn)LX組在14?d和35?d體質(zhì)量極顯著增加（＜0.01），在21?d顯著增加（＜0.05）；MLT組大鼠體質(zhì)量在14～35?d均極顯著性增加（＜0.01），而LLT組和HLT組分別在21?d和14?d后與CUMS組無顯著差異（＞0.05）。這些結(jié)果表明，-茶氨酸能夠不同程度地增加CUMS模型大鼠的體質(zhì)量，尤其中劑量達(dá)到顯著水平。而在進(jìn)食量方面，-茶氨酸各劑量組大鼠的進(jìn)食量與CUMS組均無顯著性差異（＞0.05）。

2.2 L-茶氨酸對CUMS大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響

2.2.1 糖水偏好度分析

如圖2-A所示，造模28?d后，CUMS組大鼠對糖水的偏好度較CK組極顯著降低（＜0.01）。與CUMS組相比，F(xiàn)LX組顯著提高大鼠糖水偏好度（＜0.01），-茶氨酸各劑量組在一定程度上改善了大鼠的糖水偏好度，尤其MLT組達(dá)到顯著水平（＜0.05）。說明-茶氨酸能有效提高CUMS大鼠的糖水偏好度。

表1 不同處理下大鼠體質(zhì)量和進(jìn)食量增長變化

注：與對照組比較，#＜0.05，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01。下同

Note: Compared with CK group,#＜0.05,##＜0.01. Compared with CUMS group,*＜0.05,**＜0.01. The same below

注：A為糖水偏好實(shí)驗(yàn)；B和C為明暗箱實(shí)驗(yàn)；D為強(qiáng)迫性游泳實(shí)驗(yàn)；E和F為曠場實(shí)驗(yàn)

2.2.2 明暗箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

大鼠焦慮行為可以通過測定其在暗箱中的等待時間確定[26]。試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2-B和2-C），CUMS組5?min內(nèi)出現(xiàn)在明箱的次數(shù)和停留時間極顯著低于CK組（＜0.01）。與CUMS組大鼠相比，F(xiàn)LX組極顯著增加大鼠明箱出現(xiàn)次數(shù)和停留時間（＜0.01），-茶氨酸各劑量組大鼠在明箱的出現(xiàn)次數(shù)也有不同程度地增加，但無顯著差異（＞0.05）（圖2-C）；另外，-茶氨酸中劑量顯著增加大鼠在明箱的停留時間（＜0.05），而低、高劑量組雖有增加，但無顯著差異（圖2-B）。這說明-茶氨酸對CUMS大鼠的焦慮行為有一定的改善作用。

2.2.3 強(qiáng)迫性游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

大鼠在水中的靜止時間增加表明逃避欲望降低，可能與抑郁癥的無助癥狀相似。與CK組相比，CUMS組的不動時間極顯著增加（＜0.01）。與CUMS組相比，-茶氨酸中劑量極顯著降低大鼠在水中的不動時間（＜0.01），改善效果與FLX組相當(dāng)，-茶氨酸低、高劑量組有降低，但無顯著差異（圖2-D）。

2.2.4 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

曠場模擬實(shí)驗(yàn)可以作為評估動物抑郁樣行為的指標(biāo)，正常大鼠通常會因探索敞箱的中心區(qū)域而花費(fèi)更多時間[27]。圖2-E和2-F表明，CUMS組大鼠的總跨越格子數(shù)和站立次數(shù)均明顯低于CK組（＜0.01）。與CUMS組相比，-茶氨酸各組不同程度的提高了CUMS大鼠的跨越格子數(shù)和站立次數(shù)。以上結(jié)果說明了-茶氨酸能夠一定程度上提高CUMS模型大鼠的探索能力。

2.3 L-茶氨酸對CUMS大鼠海馬組織病理的影響

2.3.1 大鼠海馬HE染色結(jié)果分析

海馬由CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回（DG區(qū)）3個主要亞區(qū)組成，HE染色后如圖3所示。比較分析各組大鼠海馬3個亞區(qū)的400倍圖譜發(fā)現(xiàn)，CK組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞核、胞漿清晰可見，細(xì)胞形態(tài)飽滿（綠色箭頭）。CUMS組經(jīng)應(yīng)激處理后，CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)元排列松散紊亂，神經(jīng)元死亡消失或發(fā)生形態(tài)改變，胞漿減少，結(jié)構(gòu)形態(tài)較差（黑色箭頭）。與CUMS組相比，-茶氨酸各組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)基本正常，沒有明顯核固縮現(xiàn)象；其中-茶氨酸低、中劑量組改善效果趨近于FLX組；說明長期的應(yīng)激刺激對大鼠大腦造成了損傷，神經(jīng)元損傷或缺失，-茶氨酸具有明顯的改善作用。

2.3.2 大鼠海馬Nissl染色的結(jié)果分析

研究表明，海馬神經(jīng)元的再生能夠調(diào)節(jié)人的情緒和行為，增強(qiáng)記憶和儲備[28]，Nissl小體結(jié)構(gòu)變化可作為神經(jīng)元受損的標(biāo)志[29]。Nissl染色后海馬整體組織切片圖如圖4所示，CK組海馬CA1區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、緊密，Nissl小體清晰。與CK組相比，CUMS組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞排列松散，3個區(qū)的Nissl體淺染甚至溶解，Nissl陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。經(jīng)氟西汀和-茶氨酸干預(yù)后，可明顯改善CUMS誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷，尤其是MLT組大鼠CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞排列更整齊、密集，Nissl體染色深于CUMS組，說明-茶氨酸對由慢性應(yīng)激造成的海馬神經(jīng)元損傷起到了保護(hù)作用。

2.4 L-茶氨酸對CUMS大鼠腸道組織病理的影響

如圖5-A所示，CK組大鼠結(jié)腸腸壁結(jié)構(gòu)完整，即黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜4層組織結(jié)構(gòu)清晰；腺體排列整齊，杯狀細(xì)胞豐富，無炎癥細(xì)胞浸潤及絨毛壞死脫落。CUMS組大鼠腸黏膜組織遭到破壞；固有層出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤（黑色箭頭），腺體減少，杯狀細(xì)胞減少，腸絨毛排列紊亂；漿膜與肌層之間結(jié)合不緊密（綠色箭頭）。FLX組的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)得到明顯改善；-茶氨酸各劑量組大鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)無明顯損壞，腸壁結(jié)構(gòu)完整，腺體排列較CUMS組整齊，損傷有所減輕，且炎癥細(xì)胞浸潤黏膜層有明顯的減少。說明-茶氨酸可以改善CUMS誘導(dǎo)的結(jié)腸組織損傷，修復(fù)結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)，其中-茶氨酸中劑量組尤為明顯。

盲腸組織切片結(jié)果顯示（圖5-A），CK組大鼠盲腸黏膜形成的皺襞排列整齊均勻，無斷裂，腸腺、血管分布于固有層和黏膜下層內(nèi)。CUMS組黏膜上皮的腸絨毛排列紊亂甚至部分脫落（藍(lán)色箭頭），黏膜層部分腸腺出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤（黑色箭頭），形態(tài)結(jié)構(gòu)部分破壞。與CUMS組相比，F(xiàn)LX組和MLT組明顯改善了盲腸細(xì)胞的炎癥現(xiàn)象，恢復(fù)了大鼠盲腸黏膜的固有結(jié)構(gòu)，說明-茶氨酸可以修復(fù)CUMS誘導(dǎo)造成的盲腸組織損傷。

圖3 大鼠海馬病理組織切片

圖4 大鼠海馬組織Nissl染色切片

圖5-B是利用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算的結(jié)腸和盲腸炎癥面積占比，通過計(jì)算分析，CUMS組炎癥細(xì)胞浸潤面積占比顯著大于CK組（＜0.001）；與CUMS組相比，氟西汀和-茶氨酸處理組的炎癥面積占比明顯減少（＜0.01或＜0.001），說明-茶氨酸能夠有效減輕CUMS大鼠腸道炎癥，具有一定的修復(fù)作用。

注：與對照組相比，＃P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。下同

2.5 L-茶氨酸對CUMS大鼠血清、結(jié)腸和盲腸炎癥的影響

大鼠的血清、結(jié)腸和盲腸IL-6、TNF-含量如表2所示。與CK組相比，CUMS組大鼠表現(xiàn)出了較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)（＜0.01或＜0.001），表明慢性應(yīng)激會損傷腸道組織結(jié)構(gòu)，引發(fā)炎癥；與CUMS組相比，氟西汀和茶氨酸低、中劑量處理均明顯降低了大鼠血清、結(jié)腸和盲腸的IL-6、TNF-含量（＜0.05或＜0.01或＜0.001）；而茶氨酸高劑量處理僅顯著降低了血清中TNF-和結(jié)腸中IL-6含量（＜0.01）。

2.6 L-茶氨酸對CUMS大鼠5-HT和GLP-1含量的影響

5-HT是參與情緒的主要神經(jīng)遞質(zhì)，而神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)參與了神經(jīng)元的生成和突觸的重塑過程。GLP-1被認(rèn)為是連接“腸-腦軸”的化學(xué)介質(zhì)之一[30]。如圖6所示，與CK組相比，4周應(yīng)激過程導(dǎo)致CUMS組大鼠的海馬、大腦皮層和結(jié)腸的5-HT和GLP-1含量極顯著降低（＜0.01），經(jīng)-茶氨酸處理后，大鼠海馬和大腦皮層中5-HT和GLP-1含量與CUMS組相比均不同程度增加。在結(jié)腸組織中，與CUMS組相比，LLT組和MLT組極顯著增加了結(jié)腸5-HT水平（＜0.01），而HLT組與CUMS組無顯著差異（＞0.05，圖6-C）；FLX組結(jié)腸GLP-1含量較CUMS組有所升高，但未達(dá)顯著水平（＞0.05），LLT組和MLT組結(jié)腸GLP-1的含量較CUMS組分別增加了24.22%和23.35%，但差異不顯著（＞0.05，圖6-F）。這些結(jié)果表明，-茶氨酸能有效增加CUMS大鼠海馬、皮層及結(jié)腸中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、神經(jīng)肽GLP-1的含量，但不同劑量間存在差異。

3 討論

抑郁癥正成為威脅人類健康和影響人們生活的嚴(yán)重疾病，抑郁情況較嚴(yán)重者需要考慮藥物（如氟西?。└深A(yù)治療。近年來，尋找高效、安全的天然產(chǎn)物來改善抑郁行為已成為社會迫切需求和研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，CUMS可用于模擬抑郁癥的壓力源來制作抑郁動物模型[31-32]。本研究中，CUMS組大鼠的體質(zhì)量及糖水的喜好度、明箱中停留時間、敞箱中活躍度以及在水中掙扎時間極顯著低于CK組，表明CUMS方法建模成功；-茶氨酸處理有效改善了CUMS大鼠的抑郁行為，部分結(jié)果接近于陽性藥物氟西汀的效果，說明-茶氨酸對CUMS大鼠的抑郁行為有明顯的干預(yù)效果。

表2 L-茶氨酸對CUMS大鼠血清、結(jié)腸和盲腸中IL-6、TNF-α含量的影響

圖6 L-茶氨酸對CUMS大鼠海馬、大腦皮層和結(jié)腸中5-HT和GLP-1含量的影響

彭彬[33]研究發(fā)現(xiàn)，-茶氨酸的抗抑郁效果與劑量呈現(xiàn)正相關(guān)（劑量5?mg·kg-1·d-1＜劑量20?mg·kg-1·d-1＜劑量100?mg·kg-1·d-1）。為尋找更優(yōu)的給藥濃度范圍，本研究設(shè)計(jì)了-茶氨酸更高劑量等比例梯度20、100、500?mg·kg-1·d-1。結(jié)果顯示，-茶氨酸的抗抑郁效果并非劑量越高越好；整體上來說，-茶氨酸抗抑郁效果是劑量100?mg·kg-1·d-1＞劑量20?mg·kg-1·d-1＞劑量500?mg·kg-1·d-1。500?mg·kg-1·d-1-茶氨酸干預(yù)的CUMS大鼠14?d以后體質(zhì)量與CUMS組無顯著差異（＞0.05），幾項(xiàng)行為學(xué)中僅曠場實(shí)驗(yàn)中的跨格數(shù)與CUMS組有顯著差異（＜0.05），且MLT組Nissl染色切片中大鼠海馬組織存在一定損傷現(xiàn)象，血清和腸道炎癥因子（IL-6和TNF-）含量與CUMS組無顯著性差異，改善效果均不及LLT組和MLT組。以上結(jié)果表明，過高劑量的-茶氨酸可能會產(chǎn)生一定的毒副作用，從而影響其修復(fù)海馬和腸道損傷以及調(diào)節(jié)抑郁行為的作用效果。茶氨酸每日食用量應(yīng)不多于0.4?g[10]，換算成大鼠的劑量約為42?mg·kg-1·d-1，遠(yuǎn)低于本研究中高劑量-茶氨酸的使用劑量，但也有-茶氨酸的安全性評價研究指出，-茶氨酸的使用劑量可以達(dá)到4?000?mg·kg-1·d-1[34]。

大腦中的海馬體管理著人類的學(xué)習(xí)、記憶和情緒認(rèn)知。研究表明，CA1、CA3和DG區(qū)容易受到壓力的影響，會通過神經(jīng)元的樹突分枝和脊椎密度的減少而導(dǎo)致其體積減少[35]，故海馬可能在嚴(yán)重抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在嚙齒動物中，腹側(cè)海馬與焦慮調(diào)節(jié)有關(guān)，該區(qū)域的損傷會改變焦慮樣行為和活動水平[36]。同時，應(yīng)激刺激引起的神經(jīng)沖動經(jīng)由神經(jīng)－內(nèi)分泌傳送到腸神經(jīng)系統(tǒng)或通過迷走神經(jīng)作用于腸肌纖維和腸血管組織[37]，收縮腸道平滑肌和血管，調(diào)節(jié)腸道動力，改變腸道黏膜和支配腸道供血、供氧，從而破壞正常的屏障功能[38]。一旦這種屏障的完整性被破壞，炎癥紊亂和代謝穩(wěn)態(tài)失衡就會因?yàn)槠琳蠐p傷而開始并持續(xù)下去[39-40]。迷走神經(jīng)作為“腸-腦軸”的重要組成部分，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與和調(diào)節(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)[41]。本研究中，CUMS組大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞和腸道組織結(jié)構(gòu)的損傷，以及腸道炎性細(xì)胞浸潤和促炎因子（IL-6和TNF-）過量表達(dá)都表明長期的不良應(yīng)激引起了大腦海馬功能紊亂，并基于“腸-腦軸”造成了腸道特別是腸道屏障功能的破壞，腸道功能紊亂將繼續(xù)引起局部和外周免疫激活，加重抑郁樣行為；而氟西汀的干預(yù)作用能明顯逆轉(zhuǎn)不良應(yīng)激引起的上述不利變化；同時-茶氨酸特別是低中劑量的干預(yù)處理也明顯改善CUMS對大鼠海馬和腸道結(jié)構(gòu)功能的損傷，其根本原因可能是一定濃度范圍的-茶氨酸能調(diào)節(jié)或優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，修復(fù)腸道及腸粘膜屏障功能，改善了機(jī)體的炎癥現(xiàn)象，從而改善了海馬結(jié)構(gòu)損傷，阻斷惡性循環(huán)；而高劑量-茶氨酸整體改善效果不及低、中劑量，可能是由于過高濃度的-茶氨酸引起腸道菌群結(jié)構(gòu)的一些不利變化，從而影響其改善效果。

此外，大量研究表明，調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及化學(xué)介質(zhì)濃度可以緩解抑郁癥癥狀[42]。5-HT是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與痛覺情緒、食欲、睡眠和體溫等生理功能的調(diào)節(jié)[43-44]，而人體內(nèi)90%以上的5-HT是由腸道內(nèi)的腸嗜鉻細(xì)胞合成[44]。GLP-1是一種腸內(nèi)分泌肽，參與了食物攝取的神經(jīng)調(diào)節(jié)、體重、下丘腦-垂體-腎上腺軸的調(diào)節(jié)，可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，與腦內(nèi)GLP-1受體結(jié)合發(fā)揮對應(yīng)激的生物學(xué)作用[45]。本研究結(jié)果顯示，-茶氨酸能增加CUMS大鼠海馬、大腦皮層和結(jié)腸中5-HT、GLP-1的含量，部分條件下達(dá)到顯著水平；-茶氨酸低、中劑量的改善效果趨近于鹽酸氟西汀，均顯著優(yōu)于高劑量組，這可能是因?yàn)椴璋彼嵩诘蛣┝肯拢ㄍ扑]劑量20?mg·kg-1·d-1）就達(dá)到了一個較好的藥效水平（藥效的平臺期），而過高劑量（500?mg·kg-1·d-1）-茶氨酸會對腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸道功能產(chǎn)生不利影響，從而影響了一些神經(jīng)遞質(zhì)及化學(xué)介質(zhì)的釋放。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，適合濃度的-茶氨酸可以基于“腸-腦軸”調(diào)節(jié)腸道及海馬功能，從而較好地改善抑郁樣行為。

綜上所述，-茶氨酸能夠?qū)UMS誘導(dǎo)的大鼠抑郁樣行為、海馬及腸道損傷起到一定防治作用，其抗抑郁作用可能與對大鼠海馬和腸道的保護(hù)，以及調(diào)節(jié)與抑郁發(fā)生相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)和化學(xué)介質(zhì)的釋放有關(guān)。本研究從“腸-腦軸”整體水平闡述了-茶氨酸的抗抑郁作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步探究抑郁癥的干預(yù)機(jī)制及茶氨酸的高值化利用提供基礎(chǔ)。

[1] Lillberg K, Verkasalo P K, Kaprio J, et al. Stressful life events and risk of breast cancer in 10808 women: a cohort study [J]. American Journal of Epidemiology, 2003, 157(5): 415-423.

[2] Paykel E S. Depression: major problem for public health [J]. Epidemiologia E Psichiatria Sociale, 2006, 15(1): 4-10.

[3] Faulconbridge L F, Wadden T A, Berkowitz R I, et al. Changes in symptoms of depression with weight loss: results of a randomized trial [J]. Obesity, 2009, 17(5): 1009-1016.

[4] Bromet E, Andrade L H, Hwang I, et al. Cross-national epidemiology of DSM-IV major depressive episode [J]. BMC Medicine, 2011, 9: 90. doi: 10.1186/1741-7015-9-90.

[5] Mathers C D, Loncar D. Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030 [J]. PLoS Medicine, 2006, 3(11): e442. doi: 10.1371/journal.pmed.0030442.

[6] 呂富榮, 劉崗, 王靜怡. 王靜怡治療抑郁癥臨床經(jīng)驗(yàn)[J]. 陜西中醫(yī), 2011, 32(12): 1643-1644.

Lv F R, Liu G, Wang J Y. Wang Jingyi's clinical experience in treating depression [J]. Shaanxi Journal of Traditional Chinese Medicine, 2011, 32(12): 1643-1644.

[7] Bhattarai Y. Microbiota-gut-brain axis: interaction of gut microbes and their metabolites with host epithelial barriers [J]. Neurogastroenterology and Motility, 2018, 30(6): e13366. doi: 10.1111/nmo.13366.

[8] Zalar B, Haslberger A, Peterlin B. The role of microbiota in depression: a brief review [J]. Psychiatria Danubina, 2018, 30(2): 136-141.

[9] Han L, Wang X M, Di S, et al. Innate lymphoid cells: a link between the nervous system and microbiota in intestinal networks [J]. Mediators of Inflammation, 2019, 2019: 1978094. doi: 10.1155/2019/1978094.

[10] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會. 關(guān)于批準(zhǔn)茶葉茶氨酸為新食品原料等的公告(2014年第15號) [J]. 中國食品添加劑, 2014(6): 172.

National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China, Announcement on Approving Tea Theanine as New Food Ingredients (2014 No. 15) [J]. China Food Additives, 2014(6): 172.

[11] 楊洲. 茶氨酸保健作用研究進(jìn)展[J]. 茶葉通訊, 2018, 45(2): 3-7.

Yang Z. Research progress in the healthy functions of theanine [J]. Journal of Tea Communication, 2018, 45(2): 3-7.

[12] Lardner A L. Neurobiological effects of the green tea constituent theanine and its potential role in the treatment of psychiatric and neurodegenerative disorders [J]. Nutritional Neuroence, 2014, 17(4): 145-155.

[13] Mu W, Zhang T, Jiang B. An overview of biological production of-theanine [J]. Biotechnology Advances, 2015, 33(3/4): 335-342.

[14] Yokogoshi H, Kobayashi M, Mochizuki M, et al. Effect of theanine, r-glutamylethylamide, on brain monoamines and striatal dopamine release in conscious rats [J]. Neurochemical Research, 1998, 23(5): 667-673.

[15] Di Lorenzo A , Nabavi S F , Sureda A , et al. Antidepressive-like effects and antioxidant activity of green tea and GABA green tea in a mouse model of post-stroke depression [J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2016, 60(3): 566-579.

[16] Takarada T, Nakamichi N, Kakuda T, et al. Daily oral intake of theanine prevents the decline of 5-bromo-2'-deoxyuridine incorporation in hippocampal dentate gyrus with concomitant alleviation of behavioral abnormalities in adult mice with severe traumatic stress [J]. Journal of Pharmacological Sciences, 2015, 127(3): 292-297.

[17] Yin C, Gou L, Liu Y, et al. Antidepressant-like effects of-theanine in the forced swim and tail suspension tests in mice [J]. Phytotherapy Research, 2011, 25(11): 1636-1639.

[18] 楊怡. 茶氨酸對抑郁模型大鼠行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)的影響[D]. 長沙: 中南大學(xué), 2013.

Yang Y. The effect of-theanine on behavior and neurotransmitter of depression model rats [D]. Changsha: Central South University, 2013.

[19] 彭彬, 劉仲華, 林勇, 等.-茶氨酸改善慢性應(yīng)激大鼠抑郁行為作用研究[J]. 茶葉科學(xué), 2014, 34(4): 355-363.

Peng B, Liu Z H , Lin Y , et al. The ameliorative effect of-theanine on chronic unpredictable mild stress-induced depression in rats [J]. Journal of Tea Science, 2014, 34(4): 355-363.

[20] Wang Q Z, Timberlake M A, Prall K, et al. The recent progress in animal models of depression [J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, 2017, 77: 99-109.

[21] 屠幼英. 茶與健康[M]. 北京: 世界圖書出版公司, 2011.

Tu Y Y. Tea and health [M]. Beijing: World Publishing Corporation, 2011.

[22] 宛曉春. 茶葉生物化學(xué)[M]. 3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2013.

Wan X C. Tea biochemistry [M]. 3rd ed. Beijing: China Agriculture Press, 2013.

[23] 趙偉, 孫國志. 不同種實(shí)驗(yàn)動物間用藥量換算[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2010(5): 54-55.

Zhao W, Sun G Z. Conversion of dosage between different kinds of experimental animals [J]. Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2010(5): 54-55.

[24] Banasr M, Valentine G W, Li X Y, et al. Chronic unpredictable stress decreases cell proliferation in the cerebral cortex of the adult rat [J]. Biological Psychiatry, 2007, 62(5): 496-504.

[25] 洪燈, 齊亞靈, 張彥慧, 等. 簡單易操作的大鼠CUMS抑郁模型的構(gòu)建方法[J]. 中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè), 2011, 8(8): 3-4.

Hong D, Qi Y L, Zhang Y H, et al. The simple and easy to approach's method to building the CUMS depression model of rats [J]. China Health Industry, 2011, 8(8): 3-4.

[26] Ma X C, Dong J, Jiang W H, et al. Social isolation-induced aggression potentiates anxiety and depressive-like behavior in male mice subjected to unpredictable chronic mild stress [J]. Plos One, 2011, 6(6): e20955. doi: 10.1371/journal.pone.

0020955.

[27] Zheng H, Liu Y Y, Li W, et al. Beneficial effects of exercise and its molecular mechanisms on depression in rats [J]. Behavioural Brain Research, 2006, 168(1): 47-55.

[28] Spalding K L, Bergmann O, Alkass K, et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans [J]. Cell, 2013, 153(6): 1219-1227.

[29] 韓濟(jì)生, 關(guān)新民. 醫(yī)用神經(jīng)生物學(xué)[M]. 武漢: 武漢出版社, 1996.

Han J S, Guan X M. Medical neurobiology [M]. Wuhan: Wuhan Publishing House, 1996.

[30] Everard A, Cani P D. Gut microbiota and GLP-1 [J]. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders, 2014, 15: 189-196.

[31] Willner P . Animal models as simulations of depression [J]. Trends in Pharmacological Sciences, 1991, 12(4): 131-136.

[32] Anisman H, Matheson K. Stress, depression, and anhedonia: caveats concerning animal models [J]. Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 2005, 29(4/5): 525-546.

[33] 彭彬.-茶氨酸的抗抑郁作用評價及相關(guān)機(jī)理研究[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

Peng B. Evaluation of the antidepressant effect of-theanine and the research of its relevant mechanism [D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2014.

[34] Borzelleca J F, Peters D, Hall W. A 13-week dietary toxicity and toxicokinetic study with-theanine in rats [J]. Food & Chemical Toxicology, 2006, 44(7): 1158-1166.

[35] Mcewen B S. Physiology and neurobiology of stress and adaptation: central role of the brain [J]. Physiological Reviews, 2007, 87(3): 873-904.

[36] Murthy S, Kane G A, Katchur N J, et al. Perineuronal nets, inhibitory interneurons, and anxiety-related ventral hippocampal neuronal oscillations are altered by early life adversity [J]. Biological Psychiatry, 2019, 85(12): 1011-1020.

[37] Slim M, Calandre E P, Rico-Villademoros F. An insight into the gastrointestinal component of fibromyalgia: clinical manifestations and potential underlying mechanisms [J]. Rheumatology International, 2015, 35(3): 433-444.

[38] Bailey M T, Dowd S E, Galley J D, et al. Exposure to a social stressor alters the structure of the intestinal microbiota: implications for stressor-induced immunomodulation [J]. Brain Behavior Immunity, 2011, 25(3): 397-407.

[39] Diehl G E, Longman R S, Zhang J X, et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX3CR1hicells [J]. Nature, 2013, 494: 116-120.

[40] Slyepchenko A, Maes M, Jacka F N, et al. Gut microbiota, bacterial translocation, and interactions with diet: pathophysiological links between major depressive disorder and non communicable medical comorbidities [J]. Psychotherapy And Psychosomatics, 2017, 86: 31-46.

[41] Fang J L, Rong P J, Hong Y, et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation modulates default mode network in major depressive disorder [J]. Biological Psychiatry, 2016, 79(4): 266-273.

[42] Marathe S V, D'almeida P L, Virmani G, et al. Effects of monoamines and antidepressants on astrocyte physiology: implications for monoamine hypothesis of depression [J]. Journal of Experimental Neuroscience, 2018, 12: 1179069518789149. doi: 10.1177/1179069518789149.

[43] O'Mahony S M, Clarke G, Borre Y E, et al. Serotonin, tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis [J]. Behavioural Brain Research, 2015, 277: 32-48.

[44] Wikoff W R, Anfora A T, Liu J, et al. Metabolomics analysis reveals large effects of gut microflora on mammalian blood metabolites [J]. PNAS, 2009, 106(10): 3698-3703.

[45] Sun J, Wang F Y, Hu X Z, et al.attenuates chronic unpredictable mild stress-induced depressive-like behavior in mice via the gut-brain axis [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(31): 8415-8421.

Intervention Effects of-Theanine on the Damage of Hippocampus and Gut in CUMS Depressed Rats

CHEN Meiyan1,2, LIU Fen1,2, LIN Yong1,2,3*, ZUO Gaolong1,2, ZUO Yingpeng1,2, LIU Zhonghua1,2,3

1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China; 3. Hunan Collaborative Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China

Using SPF-grade SD male rats as experimental animals, a rat model of chronic unpredictable mild stress (CUMS) was established and different doses of-theanine were given intragastrically for intervention. Then, the effects of-theanine on the depression-like behaviors, histopathological changes and the levels of interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor alpha (TNF-), 5-hydroxytryptamine (5-HT) and glucagon-like peptide 1 (GLP-1) contents of hippocampus and gut were observed and evaluated, which aimed to explore the intervention effects of-theanine on the structural damage and dysfunction of hippocampus and gut in CUMS depressed rats. The results show that, compared with the model group, pretreatment with different doses of-theanine improved the body weight,sugar-water preference, number of crossing and rearing, activity in water, number of entering the light box and the duration time of ratsat different degrees, especially the middle-dose group (100?mg·kg-1) reached a significant level.-theanine effectively repaired hippocampal neuron damage caused by CUMS, reduced IL-6 and TNF-levels in serum, colon and cecum and attenuated the damage and inflammation degree of the colon and cecum tissues, and the middle-dose group also exhibited better effect.-theanine could increase the contents of 5-HT and GLP-1 in hippocampus, cerebral cortex and colon of CUMS rats, and reached significant levels under some conditions. These results indicate that-theanine can effectively improve the depression-like behavior, structural damage and dysfunction of hippocampus and gut in CUMS model rats, and its regulation of ‘gut-brain axis’ may be the action mechanism of anti-depression.

-theanine, depression-like behavior, hippocampus, gut damage, gut-brain axis

S571；R749.4

A

1000-369X(2021)04-511-14

2020-11-02

2021-03-13

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020JJ4351、2017JJ3106）、湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（19A223）、湖南省科技特派員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（2020NK4260）

陳美艷，女，碩士研究生，主要從事茶葉功能成分利用相關(guān)研究。*通信作者：ly2005306@163.com

（責(zé)任編輯：黃晨）