一株豬丹毒絲菌的分離鑒定

程玉婷

（廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，廣東 廣州 510000）

豬丹毒病是一種在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生且對(duì)養(yǎng)豬業(yè)有重要影響的疾病。豬丹毒病由豬丹毒絲菌引起。豬丹毒絲菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌、菌體平直或稍彎曲的纖細(xì)小桿菌、兼性厭氧、耐酸、無(wú)芽孢[1]。豬丹毒絲菌一般感染豬，但同時(shí)也可以感染綿羊、火雞和人。豬丹毒絲菌感染人時(shí)，可以引起心內(nèi)膜炎癥、敗血癥[2]。豬丹毒絲菌作為一種條件致病菌，多達(dá)10%～50%的健康豬扁桃體中攜帶該菌，并且在健康豬及病豬的唾液、糞便中均可以分離到該病原體，該病最常見(jiàn)的感染途徑是通過(guò)攝入受污染的食物或水及皮膚傷口感染，3月齡到3歲豬均易感。豬丹毒菌感染的臨床癥狀有3種：急性、亞急性和慢性[3]。急性型又稱(chēng)敗血型，發(fā)病豬只呈急性經(jīng)過(guò)，體溫突然升至42～43 ℃，食欲不振，糞便干結(jié)，后期下痢。病程急，死亡率高。亞急性型也稱(chēng)疹塊型，豬只耳后、頸部、胸腹側(cè)等部位會(huì)有紅色形狀的不規(guī)則斑塊出現(xiàn)，界限明顯、觸之有熱感，指壓而褪色，俗稱(chēng)“打火印”。而慢性型一般表現(xiàn)為慢性關(guān)節(jié)炎、慢性心內(nèi)膜炎和皮膚壞死等癥狀[4]。豬丹毒病一年四季均可以發(fā)病，但以潮濕、炎熱多雨的季節(jié)多發(fā)[5]。

1 材料與方法

1.1 病料

病料來(lái)自廣東省潮州市某大型豬場(chǎng)，采取新鮮病死豬的肝、脾等臟器進(jìn)行病原菌分離鑒定。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基和相關(guān)試劑

胰酶大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

新生牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司，使用前56 ℃滅活30 min，保存于-20 ℃。

革蘭氏染色液采購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 引物合成設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)中所用到的引物（見(jiàn)表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用到的引物

1.4 豬丹毒絲菌的分離與鑒定

1）以燒紅的無(wú)菌剪刀燙烙病例臟器表面，用接種環(huán)自燙烙的部位插入組織中，在無(wú)菌的加入5%新生牛血清的TSA平板上涂拭，在超凈工作臺(tái)內(nèi)對(duì)平板進(jìn)行劃線(xiàn)，目的是可以得到單菌落；

2）將劃線(xiàn)稀釋的平板置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h；

3）在平板上挑選單菌落，轉(zhuǎn)到新鮮的TSA平板（添加5%新生牛血清）上繼續(xù)劃線(xiàn)培養(yǎng)18～24 h進(jìn)行純化；

4）革蘭氏染色鑒定；

5）16S rRNR PCR鑒定

PCR反應(yīng)、條件體系如下：

TaKaRa Ex Taq（5 units/μL）0.25 μL

10×Ex Taq Buffer（Mg2+free）2 μL

dNTP Mixture（2.5 mM each）2 μL

25 mM MgCl21.5 μL

16SrRNA-F、16SrRNA-R各1.5 μL

dd H2O up to 25 μL

反應(yīng)總體系為25μL，模板為挑選的3-5個(gè)單菌落。PCR反應(yīng)條件為

1.5 藥物敏感性的測(cè)定

藥敏實(shí)驗(yàn)采用Kirby-Baner（K-B）紙片擴(kuò)散法，檢測(cè)分離得到的菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。

1）將復(fù)蘇好的菌株進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng)，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h；

2）取無(wú)菌棉簽蘸取平板上3～5個(gè)菌落，于3 mL生理鹽水中進(jìn)行稀釋?zhuān){(diào)節(jié)菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛龋?/p>

3）另取一無(wú)菌棉簽伸入細(xì)菌瓶中，待無(wú)菌棉簽浸潤(rùn)后，在細(xì)菌瓶管壁上擠壓掉多余的水分，用棉簽涂布TSA平板。為使平板上菌落分布均勻，應(yīng)涂布完平板后將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60°，再次進(jìn)行涂布，依次重復(fù)6次；

4）用鑷子夾取藥敏紙片，使藥敏紙片平貼于涂滿(mǎn)菌液的培養(yǎng)基表面，所有藥敏紙片應(yīng)當(dāng)在15 min內(nèi)貼到培養(yǎng)基上；

5）將平板翻轉(zhuǎn)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～24 h后，將平板從恒溫培養(yǎng)箱中拿出，依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行耐藥性的判定。

2 結(jié)果

2.1 革蘭氏染色結(jié)果

從病變組織中分離培養(yǎng)細(xì)菌后，制成細(xì)菌涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，可觀察到該菌為纖細(xì)的小桿菌，成對(duì)或呈長(zhǎng)絲狀。鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 革蘭氏染色鏡檢圖

2.2 16SrRNR PCR鑒定結(jié)果

從經(jīng)純化的培養(yǎng)物中挑取3～5個(gè)菌落，通過(guò)PCR擴(kuò)增后，經(jīng)電泳檢驗(yàn)，出現(xiàn)特異性條帶，目的條帶大小為472 bp，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 PCR鑒定結(jié)果

2.3 藥物敏感性的測(cè)定

藥物敏感性的測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)表2）。藥敏測(cè)定結(jié)果顯示，該豬丹毒絲菌對(duì)阿莫西林、青霉素、氟苯尼考敏感，對(duì)多西環(huán)素中度敏感，對(duì)恩諾沙星、替米考星、四環(huán)素不敏感。

表2 藥敏測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

1）以上結(jié)果符合豬丹毒絲菌的相應(yīng)特性，確診為感染豬丹毒絲菌。

2）本株豬丹毒絲菌能引起豬的全身性敗血性死亡，說(shuō)明毒力較強(qiáng)。經(jīng)了解，該豬場(chǎng)發(fā)病豬群發(fā)病時(shí)間為5月份，這段時(shí)間天氣出現(xiàn)連續(xù)性降雨，豬舍糞便清理不夠徹底，環(huán)境相對(duì)較差，這可能誘發(fā)了本次豬群的病因。

3）針對(duì)該次豬丹毒絲菌發(fā)病，可以選擇性采用阿莫西林、青霉素、氟苯尼考結(jié)合實(shí)際予以治療。

4）豬丹毒絲菌病不常發(fā)，但一旦發(fā)病，病程急，病程短，豬場(chǎng)養(yǎng)殖者往往措手不及，養(yǎng)殖者應(yīng)加強(qiáng)防范。