基于衍生化反應(yīng)的母乳低聚糖質(zhì)譜檢測(cè)方法的建立

童文烽，楊國(guó)良，葉文慧，賴世云，任一平*，李 鐸*

（1浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州 310058 2浙江清華長(zhǎng)三角研究院 浙江嘉興 314006 3內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 呼和浩特 010110）

母乳是公認(rèn)的新生兒的最佳營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，含有大量難以被消化的母乳低聚糖（Human milk oligosaccharides，HMOs），它們是母乳中僅次于乳糖和脂肪的第三大組分[1]，在成熟乳中含量為5～15 g/L，在初乳中含量為20～25 g/L[2-5]。HMOs 由葡萄糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、巖藻糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸5 個(gè)單糖單元組成，其通常包含還原末端的乳糖核心（Galβ1-4Glc），通過幾種糖基轉(zhuǎn)移酶的作用與其余3 個(gè)單糖單元一起延長(zhǎng)，其單糖組成數(shù)量一般為3～14 個(gè)。根據(jù)HMOs 是否被唾液酸化，HMOs 被分類為酸性或中性[6]。雖然HMOs難以被嬰兒消化吸收，但是它在嬰兒健康成長(zhǎng)中仍起著重要作用。大量研究表明，HMOs 與大腦成熟[7-9]，免疫調(diào)節(jié)[10-11]，腸道菌群調(diào)節(jié)[12-13]有關(guān)，并且這些HMOs 的許多生物學(xué)功能與結(jié)構(gòu)有關(guān)。例如，3’-唾液酸乳糖（3’-SL）通過選擇性腸道細(xì)菌定植影響小鼠結(jié)腸炎，而其異構(gòu)體6’-SL 不具有這種生物功能[14]。因HMOs 的一些生理功能，而受到越來(lái)越多的關(guān)注，有2 種HMO 已在美國(guó)與歐洲被正式批準(zhǔn)作為新食品成分使用[15]。添加HMO 的嬰配粉產(chǎn)品也隨之出現(xiàn)。深入了解HMOs 的組成、功能以及生理活性，對(duì)于開發(fā)更為接近母乳的嬰幼兒配方奶粉至關(guān)重要。為此，研究HMOs 準(zhǔn)確的檢測(cè)方法至關(guān)重要。

母乳組成復(fù)雜，含有大量的乳糖與乳脂肪，給HMOs 的分離檢測(cè)帶來(lái)較大挑戰(zhàn)。HMOs 本身無(wú)發(fā)色基團(tuán)，在檢測(cè)器上的靈敏度低，需進(jìn)行衍生反應(yīng)，如發(fā)色活性標(biāo)記物標(biāo)記，常用的標(biāo)記物有2-氨基苯甲酸（2-AA）、2-氨基苯甲酰胺（2-AB）[16]和2-氨基吖啶酮（AMAC）[17]等。目前，針對(duì)母乳低聚糖的分離方法主要有高效陰離子交換色譜（HPAEC）[18-19]、多孔石墨化碳色譜（PGC）[20-22]、毛細(xì)管電泳（CE）[23-24]和高效液相色譜（HPLC）[5，25-26]，再輔以安培脈沖（PAD）、紫外（UV）、熒光檢測(cè)器（FLD）或質(zhì)譜（MS）來(lái)達(dá)到將HMOs 分離檢測(cè)的目的。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）相比熒光等檢測(cè)手段靈敏度更高，分離選擇性更好[27]，被廣泛應(yīng)用于HMOs 的定性與定量分析中。本研究基于衍生反應(yīng)，針對(duì)母乳基質(zhì)建立6 種母乳低聚糖的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的同步定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳樣品，伊利提供；氰基硼氫化鈉（純度95%），上海麥克林生化科技有限公司；硼酸（分析純），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；甲酸、甲醇、乙腈、2-氨基苯甲酸、乙酸鈉、甲酸銨等均為色譜純，德國(guó)Merck 公司；昆布三糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；2’-巖藻糖基乳糖（2’-FL）、3’-巖藻糖基乳糖（3’-FL）、3’-唾液酸乳糖（3’-SL）、6’-唾液酸乳糖（6’-SL）、乳-N-巖藻五糖-I（LNFP-I）、乳-N-巖藻五糖-V（LNFPV）標(biāo)準(zhǔn)品，純度均≥90%，英國(guó)Carbosynth 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC 超高效液相色譜儀、Xevo TQXS 三重四極桿質(zhì)譜儀、Masslynx 4.1 數(shù)據(jù)處理軟件，美國(guó)Waters 公司；Allegra X-30R 高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman 公司；BSA224S-CW 萬(wàn)分之一天平，德國(guó)Sartorius 公司；230V-EU PLUG 渦旋混勻器，美國(guó)Labnet 公司；JY88-11N 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；ST2100通用pH 計(jì)，美國(guó)OHAUS 公司；Cascada I 超純水儀，美國(guó)PALL 公司；MSC-100 恒溫金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 母乳預(yù)處理 將母乳樣品保存于-80 ℃冰箱，使用前轉(zhuǎn)移到-20 ℃的冰箱放置8～12 h 后，再轉(zhuǎn)移至4 ℃的冰箱放置相同時(shí)間，最后再轉(zhuǎn)移至室外放置到室溫。解凍后的樣品超聲10 min（超聲功率100%）后，使用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)時(shí)間共2 min，工作時(shí)間與間隙均為10 s，超聲功率為60%。

移取混勻后的母乳樣品50 μL 于10 mL 容量瓶中，加入50 μL 昆布三糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（125 μg/mL）作為內(nèi)標(biāo)，加水定容至刻度后搖勻，移取適量上述稀釋液至2 mL 離心管，4 ℃，12 000×g 離心10 min；隨后取清液100 μL 加入150 μL 乙腈混勻，相同條件繼續(xù)離心10 min 后，取上清備用。

1.3.2 衍生劑的選擇 分別使用2-氨基苯甲酸（2-AA）、2-氨基苯甲酰胺（2-AB）和2-氨基吖啶酮（AMAC）這3 種衍生劑對(duì)HMO 混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生，比較3 種衍生產(chǎn)物與未衍生HMO 的響應(yīng)、分離度和峰型，確定最優(yōu)衍生劑。

2-AA 衍生條件參照Anumula 等[28]的研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整。取試樣100 μL，加入100 μL 2-AA 溶液（30 mg 2-氨基苯甲酸和25 mg 氰基硼氫化鈉，溶于1 mL 含4%三水乙酸鈉和2%硼酸的甲醇溶液），混勻后于80 ℃金屬浴中反應(yīng)50 min；待反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后取出放至室溫，加入800 μL 70%乙腈水溶液，混勻后裝瓶進(jìn)樣。

2-AB 衍生條件參照Austin 等[5]的研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整。取試樣100 μL，加入200 μL標(biāo)記溶液（0.35 mol/L 的2-氨基苯甲酰胺和1.0 mol/L 氰基硼氫化鈉，溶于含30%乙酸的二甲基亞砜中）。將溶液充分混合，并將密閉的試管置于65 ℃的水浴中2 h，然后將試樣在4 ℃下冷卻10 min，加入700 μL 70%乙腈水溶液，混勻后裝瓶進(jìn)樣。

AMAC 衍生條件參照Volpi[17]的研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整。取試樣100 μL，加入50 μL 0.1 mol/L 的AMAC 溶液（溶劑為含15%乙酸的二甲亞砜溶液） 和50 μL 1 mol/L 氰基硼氫化鈉，11 000×g 離心3 min 后，45 ℃下反應(yīng)4 h，冷卻至室溫，加入800 μL 70%乙腈水溶液，混勻后裝瓶進(jìn)樣。

1.3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化 電噴霧離子源為正離子模式，毛細(xì)管電壓3.1 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度350 ℃，脫溶劑氣流速900 L/Hr，鞘氣流速150 L/Hr，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）參數(shù)的采集與優(yōu)化。

1.3.4 色譜條件優(yōu)化 色譜柱：Waters BEH Amide 柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.4 mL/min。進(jìn)樣室溫度：20℃。針對(duì)不同濃度的甲酸銨水溶液（流動(dòng)相A）對(duì)衍生后組分響應(yīng)的影響進(jìn)行流動(dòng)相優(yōu)化，設(shè)置4個(gè)濃度點(diǎn)，分別為10，25，50，75 mmol/L，pH 值均為4.5，B 相為純乙腈。相同梯度洗脫，比較不同流動(dòng)相條件下的響應(yīng)強(qiáng)度。

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.5.1 樣品穩(wěn)定性 取6 份解凍混勻后的母乳樣品，前處理后進(jìn)樣檢測(cè)，在室溫下放置24 h 后重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)，通過計(jì)算各HMO 的2 次進(jìn)樣結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來(lái)評(píng)價(jià)前處理后各HMO的穩(wěn)定性。

1.3.5.2 線性與定量限 將各HMO 標(biāo)準(zhǔn)品配制成2’-FL、3’-FL、3’-SL、6’-SL、LNFP-I 質(zhì)量濃度為100 μg/mL，LNFP-V 質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用純水稀釋混標(biāo)，得到8 個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，其中2’-FL、3’-FL、3’-SL、6’-SL、LNFP-I 的質(zhì)量濃度范圍為50～10 000 ng/mL，LNFP-V 的質(zhì)量濃度范圍為5～1 000 ng/mL。分別移取100 μL 上述混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，各加入10 μL 昆布三糖溶液（2.5 μg/mL），使用最優(yōu)衍生劑進(jìn)行衍生后，用70%乙腈水溶液定容至1 mL，混勻后裝瓶進(jìn)樣，由液相色譜分離，質(zhì)譜檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積或峰面積與內(nèi)標(biāo)濃度的乘積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性相關(guān)系數(shù)（R2）。通過對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品的逐步稀釋進(jìn)樣，以信噪比S/N=10 為定量限（LOQ）。

1.3.5.3 精密度與回收率 取解凍混勻后的母乳樣品，平行6 份，在母乳樣品提取之前將已知量的HMOs 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入母乳樣品中，加標(biāo)量為高、中、低3 個(gè)水平，經(jīng)過同樣的前處理步驟完成3 d、3 水平、6 平行加標(biāo)試驗(yàn)。測(cè)定樣品濃度，計(jì)算測(cè)定值的RSD，得到日內(nèi)精密度和日間精密度。通過從加標(biāo)樣品中測(cè)得的量減去未加標(biāo)樣品中測(cè)得的每種HMO 的量除以加標(biāo)量，計(jì)算回收率，來(lái)評(píng)估方法的準(zhǔn)確性。以上試驗(yàn)結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示。

1.4 方法應(yīng)用

完成上述方法學(xué)驗(yàn)證后，應(yīng)用該方法對(duì)來(lái)自于10 位志愿者的初乳和成熟乳共20 份母乳樣品進(jìn)行6 種HMO 的定量檢測(cè)，每份樣品重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件

2.1.1 衍生試劑 利用1.3.2 節(jié)所述3 種衍生試劑分別對(duì)HMO 混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生后，對(duì)其衍生產(chǎn)物與未衍生的HMO 進(jìn)行比較。6 種HMO 在衍生后響應(yīng)均有極大的提升，以3’-SL 為例，從圖1可知，衍生后與未衍生相比，目標(biāo)物的響應(yīng)升高，峰型良好。而2-AA 的衍生產(chǎn)物相較其它2 種衍生，其在色譜柱上的保留更強(qiáng)，前處理也更為簡(jiǎn)便（反應(yīng)時(shí)間僅50 min），因此本研究選取2-AA 作為HMO 的衍生劑。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the derivative of the standard

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù) 使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HMO 及其2-AA 衍生物的母離子和子離子掃描，通過對(duì)比不同錐孔電壓下的母離子碎片強(qiáng)度和不同碰撞能量下的子離子碎片強(qiáng)度，對(duì)錐孔電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，得到的參數(shù)結(jié)果如表1所示。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）參數(shù)Table 1 Parameters of multiple reaction monitoring mode（MRM）

2.1.3 色譜條件的優(yōu)化結(jié)果 流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)組分響應(yīng)的影響如圖2所示，首先這6 種糖在相同條件下，LNFP-I 和LNFP-V 的質(zhì)譜響應(yīng)最低，其余4 種HMO 的響應(yīng)較高。而LNFP-I+LNFP-V 的響應(yīng)隨著甲酸銨濃度升高，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在甲酸銨濃度為25 mmol/L 時(shí)響應(yīng)強(qiáng)度最高，因此選取25 mmol/L 甲酸銨為流動(dòng)相A，并進(jìn)行洗脫梯度的優(yōu)化，得到線性梯度洗脫程序：0～0.5 min，90%B；0.5～1 min，90%～80%B；1～2 min，80%～76%B；2～8 min，76%～73.5%B；8～10.5 min，73.5%～70%B；10.5～10.6 min，70%～60%B；10.6～11.6 min，60%B；11.6～11.7 min，60%～90%B，隨后保持2.3 min。如圖3所示，該方法能夠在14 min 內(nèi)將6 種HMO 很好的分離開。

圖2 甲酸銨濃度對(duì)HMOs 質(zhì)譜響應(yīng)的影響Fig.2 Effect of ammonium formate concentration on the mass spectral response of the HMOs

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 特異性與樣品穩(wěn)定性 如圖3所示，空白對(duì)照在各HMO 相應(yīng)的質(zhì)譜采集通道不出峰，而母乳樣品與混合標(biāo)準(zhǔn)品在相應(yīng)的質(zhì)譜采集通道有明顯的色譜峰，且響應(yīng)較強(qiáng)，峰型較好。樣品穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果如表2所示，可看出經(jīng)前處理后的樣品，經(jīng)過間隔24 h 的重復(fù)進(jìn)樣后，各低聚糖檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值范圍在1.9%～10.3%之間，均小于15%，說明樣品具有較好的穩(wěn)定性，在大批量進(jìn)樣的情況下測(cè)定值不會(huì)受到較大影響。

圖3 空白、標(biāo)準(zhǔn)品以及母乳樣品色譜圖Fig.3 Chromatograms of blank，standard，and breast milk samples

2.2.2 線性與定量限 由表2可知，2’-FL、3’-FL、3’-SL、6’-SL、LNFP-I 的線性范圍為5～1 000 ng/mL，LNFP-V 的線性范圍為0.5～100 ng/mL，所有HMO 的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，說明6 種HMOs 在試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)線性良好。2’-FL、3’-FL 的定量限為1.5 mg/L，3’-SL、6’-SL、LNFP-I 的定量限為5.0 mg/L，LNFP-V 的定量限為4.5 mg/L，表明該方法的靈敏度較好。

表2 樣品穩(wěn)定性評(píng)價(jià)以及方法線性情況Table 2 Evaluation of sample stability and method linearity

2.2.3 方法精密度與回收率 通過連續(xù)3 d 的3水平、6 平行試驗(yàn)，通過計(jì)算日內(nèi)精密度、日間精密度以及方法回收率來(lái)評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，各HMO 的日內(nèi)精密度范圍在1.0%～7.9%之間，日間精密度范圍在4.5%～7.4%之間（表3），且回收率為83.2%～119.9%（表4），說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度與精密度，滿足6 種HMO 的準(zhǔn)確定量需求。

表3 日內(nèi)及日間精密度結(jié)果Table 3 Results of intra-and inter-day precision

表4 3 水平加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of three-level spiked recovery test

（續(xù)表3）

2.3 母乳檢測(cè)結(jié)果

對(duì)母乳樣品 進(jìn)行定量檢 測(cè)，測(cè)定 結(jié)果如圖4所示，HMOs 含量 的個(gè)體差異 較大，2’-FL、3’-FL、3’-SL、6’-SL、LNFP-I 和LNFP-V 質(zhì)量濃 度范圍分別為6.9～3 863.6 mg/L，10.1～2 030.5 mg/L，124.1～451.7 mg/L，317.1～1 225.9 mg/L，6.3～3 624.7 mg/L和4.9～145.8 mg/L，各HMO 測(cè)定所得含量基本在前人研究的質(zhì)量濃度范圍之內(nèi)[5，29-30]，而質(zhì)量濃度下限要低于文獻(xiàn)值，這可能是由于不同方法的檢出限與定量限不同所致。

圖4 初乳與成熟乳中6 種HMO 的含量情況Fig.4 Contents of 6 HMOs in colostrum and mature milk

3 結(jié)論

本研究對(duì)2-AA、2-AB 與AMAC 共3 種衍生劑進(jìn)行比較，選取2-AA 作為最優(yōu)衍生劑，基于2-AA 衍生化反應(yīng)，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜平臺(tái)建立了6 種母乳低聚糖的定量檢測(cè)方法。該方法前處理步驟簡(jiǎn)單，能夠在14 min 內(nèi)完成6種目標(biāo)HMO 的分離與定量，各HMO 的線性與穩(wěn)定性良好，精密度為1.0%～7.9%，回收率為83.2%～119.9%，2’-FL、3’-FL 的定量限為1.5 mg/L，3’-SL、6’-SL、LNFP-I 的定量限為5.0 mg/L，LNFP-V的定量限為4.5 mg/L。方法的精密度與準(zhǔn)確度良好，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，可滿足母乳中6 種HMO 的準(zhǔn)確定量。