南極磷蝦油改善蝦青素生物利用度的研究

劉小芳，劉建志，唐一新，2，孫偉紅，張輝珍，冷凱良，4*

（1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點實驗室 山東青島 266071 2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院 山東青島 266021 3青島市食品藥品檢驗研究院 山東青島 266071 4 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室 山東青島 266200）

南極磷蝦（Euphausia superba），廣泛分布于南極海域，生物量達(dá)到6.5～10 億t[1]，資源蘊(yùn)藏量巨大，具有打造我國第2 個遠(yuǎn)洋漁業(yè)的巨大潛力。近年來，近海資源面臨枯竭，形勢嚴(yán)峻，積極開發(fā)遠(yuǎn)洋生物資源成為我國海洋漁業(yè)發(fā)展的重要戰(zhàn)略抉擇。南極磷蝦是南大洋中最大的單種生物資源，加快對其的開發(fā)利用具有重要意義。我國南極磷蝦加工產(chǎn)業(yè)起步較晚，關(guān)鍵技術(shù)核心競爭力較弱，高附加值產(chǎn)品種類單一，產(chǎn)業(yè)發(fā)展驅(qū)動力不足[2]。加快系列高值產(chǎn)品開發(fā)，是推動南極磷蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。

南極磷蝦油是南極磷蝦經(jīng)提取、濃縮、過濾等工序制成的油脂制品，富含EPA/DHA 磷脂、蝦青素等活性成分[3]，與傳統(tǒng)魚油（EPA/DHA 甘油三酯）相比，其在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝/糖代謝[4-6]，抑制炎癥反應(yīng)[6]，改善神經(jīng)細(xì)胞功能[7-8]等方面具有更優(yōu)的生理功效。國際上，以南極磷蝦油為基礎(chǔ)，結(jié)合共軛亞油酸、輔酶Q10、維生素D、益生菌Lactobacillus reuteri 等功能食品原料[9-11]，定位不同人群需求的衍生功能產(chǎn)品開發(fā)成為南極磷蝦商業(yè)化發(fā)展的主要方向。南極磷蝦油及其系列衍生產(chǎn)品市場產(chǎn)值達(dá)到數(shù)億美元，直接驅(qū)動國際磷蝦產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。尋找適宜的功能食品原料，創(chuàng)新南極磷蝦油衍生產(chǎn)品開發(fā)，提高產(chǎn)品國際競爭力，成為我國南極磷蝦加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向。

蝦青素（Astaxanthin），作為非維生素A 原脂溶性類胡蘿卜素，廣泛分布于蝦、蟹、微藻等海洋食品原料中，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中最強(qiáng)的抗氧化劑[12]。天然蝦青素以游離態(tài)或酯化態(tài)存在[13-15]，具有改善體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，預(yù)防和治療心腦血管疾病與神經(jīng)退行性疾病等多種生理活性[15-16]，近年來在食品、功能食品、生物醫(yī)藥制品領(lǐng)域引起極大關(guān)注。蝦青素在體內(nèi)無法合成，只能通過膳食攝取，然而，受自身疏水特性的影響，其在生物體內(nèi)的消化吸收利用率較低[15，17]。目前有研究指出，添加脂類物質(zhì)是提高類胡蘿卜素類物質(zhì)生物利用度的有效辦法[18-20]，這為南極磷蝦油結(jié)合天然蝦青素提取物定向開發(fā)功能性產(chǎn)品提供了思路。綜上，本研究擬在建立生物樣品中蝦青素定量檢測方法的基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)消化吸收實驗評價南極磷蝦油對天然蝦青素生物利用度的影響，旨在證實南極磷蝦油-蝦青素功能組方產(chǎn)品開發(fā)的可行性，為新型南極磷蝦油衍生產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF 級雄性Wistar 大鼠 【生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20140007】，體重180～200 g，青島大任富城畜牧有限公司；雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）蝦青素提取物【蝦青素含量（16.0±0.57）%】，云南愛爾發(fā)生物技術(shù)股份有限公司；南極磷蝦油【磷脂含量（49.8±0.52）g/100g，蝦青素含量（188.3±4.71）mg/kg，脂肪酸組成中EPA（21.7±0.33）%、DHA（12.5±0.19）%】，青島南極維康生物科技有限公司；甘油三酯型魚油【脂肪酸組成中EPA（21.9±0.56）%、DHA（12.6±0.22）%】，江蘇奧奇海洋生物工程有限公司。

全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95.8 %），德國Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、甲基叔丁基醚等色譜純試劑，德國Merck 公司；豬膽鹽，北京索萊寶科技有限公司；戊巴比妥鈉，山東西亞化學(xué)服務(wù)有限公司；丙酮、三氯甲烷、甲醇、磷酸、氫氧化鈉等分析純試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-16 型液相色譜儀（配置Essentia SPD-16型紫外檢測器），日本島津公司；YMC-Carotenoid色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），日本YMC 公司；T10 型高速分散機(jī)，德國IKA 公司；Neofuge 15R型高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；CTFD-10P 型真空冷凍干燥機(jī)，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；MD200 型氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；MIX-28+型旋渦混勻器，杭州米歐儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 灌胃乳劑的配制 參照文獻(xiàn)[21]的方法，根據(jù)實驗分組制備灌胃乳劑。分別稱取適量雨生紅球藻蝦青素提取物、南極磷蝦油、魚油，加入0.5%豬膽鹽溶液中，超聲處理5 min 后，采用高速分散勻漿機(jī)于10 000 r/min 均質(zhì)5 min，形成均一分散的乳濁液，即灌胃乳劑。

1.3.2 動物分組與飼養(yǎng) SPF 級雄性Wistar 大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為4 組：空白對照組、蝦青素組、南極磷蝦油+蝦青素組、魚油+蝦青素組，每組50 只。按照成人每日膳食攝入量（南極磷蝦油2 g/d 或魚油2 g/d、蝦青素12 mg/d）等量換算成大鼠劑量，灌胃給予相應(yīng)脂肪乳劑，空白對照組給予等量豬膽鹽溶液作對照。實驗前12 h 禁食、不禁水，于灌胃后0，0.5，1，2，4，8，10，12，16，24 h，經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血后致死，分離血清，剝離腸道（胃幽門部至盲腸頂端），采用生理鹽水沖洗收集腸道內(nèi)容物，然后將小腸部分縱向剖開，刮取小腸絨毛。血清、小腸絨毛、腸道內(nèi)容物等生物樣品經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱，備用。

1.3.3 蝦青素含量測定

1.3.3.1 樣品前處理 參照文獻(xiàn)[22]至[24]方法提取生物樣品中蝦青素，實驗過程盡量避光操作。

血清樣品前處理：取適量血清，加入5 倍體積三氯甲烷-甲醇溶液（2∶1，體積比） 渦旋浸提1 min，靜置5 min，于4 ℃8 000 r/min 離心5 min，收集下層溶液，重復(fù)提取3 次，合并提取液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后氮?dú)獯蹈?，采用甲?甲基叔丁基醚溶液（1∶1，體積比）復(fù)溶，待測。

小腸絨毛樣品前處理：小腸絨毛經(jīng)真空冷凍干燥后，研磨粉碎，加入三氯甲烷-甲醇溶液（2∶1，體積比）渦旋浸提1 min，靜置5 min，于4 ℃8 000 r/min 離心5 min，收集上清液，重復(fù)提取3 次，合并提取液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，氮?dú)獯蹈?，采用甲?甲基叔丁基醚溶液（1∶1，體積比）復(fù)溶，待測。

腸道內(nèi)容物樣品前處理：腸道內(nèi)容物經(jīng)真空冷凍干燥后，研磨粉碎，加入三氯甲烷-甲醇溶液（2∶1，體積比）渦旋浸提1 min，靜置5 min 后，于4℃8 000 r/min 離心5 min，收集上清液，重復(fù)提取3 次，合并提取液，定容25 mL。移取浸提液2 mL于10 mL 容量瓶中，加入0.5 mL 0.1 mol/L 氫氧化鈉-甲醇溶液，充氮密封，于4 ℃皂化12 h 后采用2%磷酸-甲醇溶液中和剩余堿液，混勻，定容10 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，待測。

1.3.3.2 色譜條件[24]色譜柱：YMC-Carotenoid 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：甲醇；流動相B：甲基叔丁基醚；流動相C：1%磷酸溶液；梯度洗脫程序見表1。流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：474 nm；外標(biāo)法定量。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program of HPLC

1.4 生物利用度的計算

根據(jù)血清蝦青素含量變化曲線，采用梯形面積法計算曲線下面積（Area under the curve，AUC0-t），通過AUC0-t的大小來衡量不同實驗組蝦青素的生物利用度高低[25-26]。AUC0-t計算公式：

式中，A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J——分別表示0，0.5，1，2，4，8，10，12，16，24 h 時間節(jié)點下血清蝦青素濃度水平。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，采用Excel 2016、SPSS Statistic 20 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。不同實驗組間采用one-way ANOVA（Tukey）進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物樣品中蝦青素定量檢測方法的方法學(xué)考察

2.1.1 檢出限及線性范圍 按照信噪比為3，測得方法檢出限為0.05 μg/mL。在質(zhì)量濃度0.10～5.0 μg/mL 范圍，蝦青素濃度（X）與儀器響應(yīng)峰面積（Y）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，Y=240735X-7526.3（R2=0.9993），可通過外標(biāo)法實現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

2.1.2 回收率及精密度 不同生物樣品中蝦青素的分離圖譜見圖1。在確定的檢測條件下，蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間為10.122 min，大鼠血清、小腸絨毛、腸道內(nèi)容物等樣品中蝦青素與其它雜質(zhì)實現(xiàn)良好分離，基本無干擾，加標(biāo)回收率為85.24%～110.49%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.63%～9.50%（表2、表3）。同一樣品重復(fù)測定6 次，RSD 為1.06%。本方法的加標(biāo)回收效果良好，準(zhǔn)確度高，可用于生物樣品中蝦青素含量的測定。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和生物樣品中蝦青素高效液相分離圖譜Fig.1 The HPLC chromatograms of astaxanthin in standard substance and biological samples

表2 大鼠血清中蝦青素加標(biāo)回收率Table 2 The recoveries of astaxanthin in the serum of rats

表3 大鼠腸道內(nèi)容物中蝦青素加標(biāo)回收率Table 3 The recoveries of astaxanthin in the intestinal contents of rats

2.2 生物樣品中蝦青素含量的變化

2.2.1 不同實驗組大鼠腸道內(nèi)容物中蝦青素含量的變化 大鼠腸道內(nèi)容物中蝦青素含量變化見圖2。各實驗組大鼠腸道內(nèi)容物中蝦青素含量呈先上升后下降的變化，于灌胃給予受試物后2～4 h達(dá)到峰值，而后逐漸降低，12 h 時在其腸道內(nèi)容物中檢出的蝦青素極少，至24 h 受試物在消化道內(nèi)基本排空。在0.5，1，2，4，8，10 h 等時間節(jié)點，不同實驗組大鼠腸道內(nèi)容物中蝦青素含量存在顯著差異（P<0.05）。蝦青素組大鼠腸道內(nèi)容物蝦青素含量于2 h 時達(dá)到峰值（18.1±2.59）μg，南極磷蝦油+蝦青素組大鼠腸道內(nèi)容物蝦青素含量于4 h時達(dá)到峰值（64.9±9.54）μg，魚油+蝦青素組大鼠腸道內(nèi)容物蝦青素含量于2 h 時達(dá)到峰值（57.5±4.98）μg。

圖2 大鼠腸道內(nèi)容物中蝦青素含量變化Fig.2 Changes of the astaxanthin levels in the intestine contents of rats from different experimental groups

2.2.2 不同實驗組大鼠小腸絨毛中蝦青素含量的變化 大鼠小腸絨毛中蝦青素含量變化見圖3。灌胃給予大鼠受試物后，小腸絨毛中蝦青素含量逐漸升高，于4 h 達(dá)到峰值，而后逐漸下降，至16h 后基本無檢出。在1，2，4，8，10 h 等時間節(jié)點，不同實驗組大鼠小腸絨毛中蝦青素含量存在顯著差異（P<0.05）。蝦青素組大鼠小腸絨毛蝦青素含量峰值為（101.8±25.52）ng；魚油+蝦青素組大鼠小腸絨毛蝦青素含量峰值為（226.7±41.39）ng，是蝦青素組的2.23 倍（P＜0.05）；南極磷蝦油+蝦青素組大鼠小腸絨毛蝦青素含量峰值為（700.2±128.68）ng，是蝦青素組的6.88 倍（P＜0.05），是魚油+蝦青素組的3.09 倍（P＜0.05）。

圖3 大鼠小腸絨毛中蝦青素含量變化Fig.3 Changes of the astaxanthin levels in the intestinal villus of rats from different experimental groups

2.2.3 不同實驗組大鼠血清中蝦青素含量的變化大鼠血清中蝦青素含量變化見圖4。各實驗組大鼠血清中蝦青素含量在灌胃給予受試物0.5 h后開始緩慢上升，于8 h 達(dá)到峰值，隨后開始逐步下降，于12～16 h 恢復(fù)至初始水平。在0.5，1，2，4，8，10，12 h 等時間節(jié)點，不同實驗組大鼠血清蝦青素含量存在顯著差異（P<0.05）。蝦青素組大鼠血清蝦青素含量峰值為（1.89±0.26）μg/L；魚油+蝦青素組大鼠血清蝦青素含量峰值為（3.94±0.27）μg/L，是蝦青素組的2.08 倍（P＜0.05）；南極磷蝦油+蝦青素組大鼠血清蝦青素含量峰值為（15.8±2.09）μg/L，是蝦青素組的8.37 倍（P＜0.05），是魚油+蝦青素組的4.02 倍（P＜0.05）。

圖4 大鼠血清中蝦青素含量變化Fig.4 Changes of the astaxanthin levels in the serum of rats from different experimental groups

2.2.4 生物利用度評價 大鼠血清蝦青素含量變化曲線AUC0-t值見表4。不同實驗組大鼠蝦青素生物利用度存在顯著差異（P＜0.05）。蝦青素組大鼠AUC0-t值為（14.4±0.21）μg·h/L；魚油+蝦青素組大鼠AUC0-t值為（23.4±0.46）μg·h/L，是蝦青素組的1.63 倍（P＜0.05）；南極磷蝦油+蝦青素組大鼠AUC0-t值為（108.4±2.34）μg·h/L，是蝦青素組的7.55 倍（P＜0.05），是魚油+蝦青素組的4.63 倍（P＜0.05）。

表4 不同實驗組大鼠血清蝦青素含量變化曲線AUC0-t 值Table 4 AUC0-t values of serum astaxanthin contents in rats from different experimental groups

3 討論

蝦青素在體內(nèi)無法合成，只能通過膳食攝取，根據(jù)目前相關(guān)研究報道[14-15，18，23，27-30]，推測天然蝦青素消化吸收過程如下：食品基質(zhì)中的蝦青素在口腔的咀嚼、胃的蠕動以及消化酶系的作用下被逐步釋放，釋放出來的蝦青素（游離態(tài)或酯化態(tài)）在胃中與脂類物質(zhì)混合并被包裹在脂滴中，進(jìn)入小腸后，在胰脂肪酶、異構(gòu)酶等消化酶的作用下，蝦青素從脂滴中釋放，以酯化態(tài)存在的蝦青素同時被消化為游離態(tài)[23，28-29]，而后與體系中的脂肪酸、單酰基甘油酯、磷脂、膽鹽等一起乳化形成混合膠束；隨后，包裹游離態(tài)蝦青素的混合膠束通過簡單擴(kuò)散、被動擴(kuò)散或膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)等方式被小腸上皮細(xì)胞吸收[30]。在小腸細(xì)胞內(nèi)，蝦青素被包裹在乳糜微粒中進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，而后進(jìn)入血液循環(huán)，并最終到達(dá)肝臟、心臟、脾等靶器官發(fā)揮作用[31]。雨生紅球藻是目前公認(rèn)的天然蝦青素的首選食品原料，其所富含的蝦青素主要為酯化態(tài)蝦青素，少量以游離態(tài)形式存在[14，23]。本研究中，灌胃給予雨生紅球藻蝦青素提取物后，大鼠腸道內(nèi)容物中蝦青素含量于2～4 h 達(dá)到峰值，小腸絨毛中于4 h 達(dá)到峰值，血清中于8 h 達(dá)到峰值，消化吸收的動態(tài)過程與周慶新等[23]、Coral-Hinostroza 等[28]的研究結(jié)果基本一致。

天然類胡蘿卜素類物質(zhì)普遍存在消化吸收利用率較低的問題[15，17]，而攝入過程中添加脂類物質(zhì)是有效的改善辦法[18-20，32]。本研究中，灌胃大鼠雨生紅球藻蝦青素提取物的同時，給予南極磷蝦油或魚油等海洋來源膳食脂質(zhì)，大鼠血清蝦青素水平及AUC0-t值明顯提高，表明南極磷蝦油或魚油能顯著改善天然蝦青素在大鼠體內(nèi)的生物利用度。在體內(nèi)消化環(huán)境，物理、化學(xué)、生物等因素共同作用下，食品基質(zhì)成分對類胡蘿卜素類物質(zhì)的分子構(gòu)象、溶解性、穩(wěn)定性等的影響，是引起類胡蘿卜素類物質(zhì)營養(yǎng)特性發(fā)生改變的主要原因[32]。本研究中南極磷蝦油+蝦青素組和魚油+蝦青素組大鼠腸道內(nèi)容物中蝦青素的檢出量均明顯高于蝦青素組，推測南極磷蝦油和魚油改善蝦青素生物利用度的作用與二者能夠提高蝦青素的溶解度及其在胃、腸道中的穩(wěn)定性密切相關(guān)。另外，有研究指出，不同類型膳食脂質(zhì)對類胡蘿卜素類物質(zhì)生物利用度的影響效果不同[19，33-34]。本研究中采用的魚油為甘油三酯型魚油，甘油三酯在體內(nèi)胰脂肪酶作用下被消化為單酰基甘油酯，可提高類胡蘿卜素類物質(zhì)的微膠束化率[34]，促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞對類胡蘿卜素類物質(zhì)的有效吸收。本研究中大鼠小腸絨毛中蝦青素含量變化的測定結(jié)果也證明了這一結(jié)論。值得關(guān)注的是，與甘油三酯型魚油相比，南極磷蝦油改善蝦青素生物利用度的效果更佳。南極磷蝦油中除含甘油三酯外，磷脂的含量達(dá)到40%以上，而磷脂是在機(jī)體消化過程中包裹其它膳食成分乳化形成混合膠束的重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，在構(gòu)建膠束運(yùn)載體系以提高脂溶性膳食功能因子、非水溶性藥物等的生物利用度方面得到成熟應(yīng)用[35-37]。南極磷蝦油具有的高磷脂含量的營養(yǎng)特性，決定了其在改善蝦青素生物利用度方面表現(xiàn)出優(yōu)于魚油的效果，這一營養(yǎng)特性也將為以南極磷蝦油為基礎(chǔ)的其它衍生產(chǎn)品的開發(fā)提供極大空間。

4 結(jié)論

南極磷蝦油或魚油等海洋來源脂質(zhì)能夠顯著改善雨生紅球藻源蝦青素在大鼠體內(nèi)的生物利用度，其中南極磷蝦油的作用效果更佳。南極磷蝦油改善天然蝦青素生物利用度的機(jī)制主要包括：一方面，南極磷蝦油能夠提高蝦青素的溶解度及其在胃、腸道中的穩(wěn)定性；另一方面，南極磷蝦油中包含甘油三酯和高含量磷脂，經(jīng)生物體消化酶消化后，可提高蝦青素的微膠束化率，促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞對其有效吸收。以上兩方面機(jī)制值得后續(xù)研究和證實。本研究結(jié)果表明南極磷蝦油-蝦青素功能組方產(chǎn)品開發(fā)具有可行性，將有效指導(dǎo)南極磷蝦油相關(guān)衍生產(chǎn)品的開發(fā)，對于保障我國南極磷蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。