青磚毛茶對(duì)高脂飲食小鼠腸道微生物的影響

馮 琳，龔自明，劉盼盼，鄭鵬程，鄭 琳，王雪萍，高士偉，桂安輝

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所 湖北省茶葉工程技術(shù)研究中心 武漢 430064）

青磚茶是我國(guó)特有的一種黑茶，主產(chǎn)于鄂南、湘北茶區(qū)，具有減肥、降脂，舒暢腸胃，抗氧化，降血糖等眾多生理功能，是西北等高脂、高熱飲食地區(qū)人民不可或缺的天然保健飲料[1-2]。青磚毛茶（老青茶）是加工青磚茶的原料，是決定青磚茶品質(zhì)和健康功能的重要因子；其加工工藝與綠茶較為類(lèi)似，通常以較為粗老的中、小葉種茶樹(shù)鮮葉為原料，經(jīng)殺青、揉捻、曬干等工藝加工而成[2]。眾所周知，云南大葉種茶樹(shù)鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、曬干制成的曬青毛茶（滇青），再將其蒸壓制成普洱生茶，具有減肥、降脂、抗氧化等較多的生理、藥理功能[3]。叢濤等[4]研究表明飼料中添加6%的普洱生茶，在不影響機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況的條件下，能有效降低大鼠體重和甘油三酯水平；江新鳳等[5]研究表明普洱生茶能顯著調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠機(jī)體的血脂水平，有效預(yù)防高脂血癥，起到抗氧化等功能；郭剛軍等[6]研究認(rèn)為云南曬青毛茶提取物對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基與超氧陰離子有較強(qiáng)的清除能力，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。然而，目前關(guān)于加工工藝與普洱生茶類(lèi)似的青磚毛茶的減肥、降脂、抗氧化等健康功能相關(guān)研究報(bào)道較少。

腸道菌群被認(rèn)為是肥胖、血脂異常和脂肪肝等代謝綜合癥發(fā)展的重要因素[7-9]。越來(lái)越多的研究表明茶葉中的有效成分能夠?qū)δc道中易失調(diào)菌群起到有效的調(diào)節(jié)作用，給動(dòng)物喂食茶多酚后，可以促進(jìn)糞便菌群中乳酸菌、雙歧桿菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而改善細(xì)菌微生態(tài)平衡[10-11]。高曉余[12]系統(tǒng)研究了普洱茶及其茶多酚、茶多糖、咖啡堿和沒(méi)食子酸等生物活性成分對(duì)基礎(chǔ)和高脂飲食小鼠的糖脂代謝、機(jī)體炎癥和腸道微生態(tài)的影響，結(jié)果表明：腸道微生物群在調(diào)節(jié)肥胖、炎癥、高血脂、高血壓、高血糖、非酒精脂肪肝等代謝性疾病中扮演著重要角色。Chen 等[13-14]利用高通量測(cè)序技術(shù)研究茯磚茶對(duì)小鼠腸道微生物、脂代謝、氧化應(yīng)激和炎癥的影響，結(jié)果表明：茯磚茶可能通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)脂代謝，緩解高脂飲食引起的肥胖。鑒于此，本研究通過(guò)對(duì)青磚毛茶干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖C57BL/6J 小鼠的主要生理、生化指標(biāo)分析，明確青磚毛茶的健康功能。利用高通量測(cè)序技術(shù)分析青磚毛茶對(duì)小鼠腸道微生物的影響，并結(jié)合相關(guān)生理、生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，闡明青磚毛茶調(diào)節(jié)和改善腸道微生物以實(shí)現(xiàn)其健康功能的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青磚毛茶（赤壁群體種，一芽五葉），赤壁趙李橋茶廠。

SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠（雄性，6 周齡），南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所；高脂飼料（60%的熱量來(lái)自脂肪，TP26303）、低脂飼料（10%熱量來(lái)自脂肪，TP26332），江蘇南通特洛菲科技有限公司。

總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST），南京建成生物工程研究所；β-巰基乙醇和HE（蘇木精-伊紅）染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛、二甲苯、無(wú)水乙醇、甲醛等試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M2 酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司；IKARA11 basic 分析研磨機(jī)、IKA Lab Dancer 渦旋振蕩器，德國(guó)IKA 集團(tuán)；ML204 萬(wàn)分一電子天平，美國(guó)METTLER TOLEDO 公司；石蠟切片脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)及其刀片，德國(guó)Leica公司；Allegra 64R 臺(tái)式高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter 有限公司；血糖儀（活力型），德國(guó)Roche 公司；Milli-Q Reference 超純水機(jī)，美國(guó)Millipore 公司；DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DK-8D 電熱水槽，上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 飼養(yǎng)環(huán)境：SPF 級(jí)動(dòng)物房，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度45%～65%，12 h 黑暗/12 h 光照（9：00-21：00）。SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠24 只（雄性，6 周齡）自由飲食、飲水，適應(yīng)1 周實(shí)驗(yàn)環(huán)境后，隨機(jī)分為3 組，每組8 只，并記錄每組小鼠的體重。低脂組飼喂低脂飼料，飲用純水；高脂組飼喂高脂飼料，飲用純水；青磚毛茶組飼喂高脂飼料，飲用青磚毛茶茶湯（茶水比1∶50），即稱(chēng)取3.0 g 青磚毛茶茶樣，加入150 mL 沸水，沖泡10 min，過(guò)濾。小鼠飲用的茶湯每天更換，并記錄飲用量和采食量。每周記錄小鼠體重，在第7，12，16 周時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的空腹血糖。茶湯干預(yù)16 周后，禁食12 h，每組隨機(jī)取出6 只小鼠進(jìn)行主要生理生化指標(biāo)測(cè)定和腸道微生物分析。

1.3.2 樣品收集與處理 使用4%水合氯醛將小鼠麻醉，摘眼球取血后，脫頸處死，解剖后取小鼠肝臟、脂肪組織、血液、盲腸等實(shí)驗(yàn)所需樣品。血液：將獲得的全血在4 ℃下6 000×g 離心10 min，取血清-30 ℃保存。肝臟組織：取出后立即稱(chēng)重，生理鹽水漂洗，取少量放入4%中性甲醛溶液（甲醛∶0.1 mol/L PBS=1∶9，體積比）固定24 h 后，于70%的乙醇中保存，用于組織病理學(xué)研究；剩余肝臟于-80 ℃保存。脂肪組織：分類(lèi)取下附睪脂肪、腸系脂肪和腎周脂肪，稱(chēng)重后液氮速凍，-80 ℃保存。

1.3.3 肝臟組織HE 染色分析 將保存在70%乙醇中的肝臟組織塊放置脫水機(jī)中脫水，用熔融的石蠟包埋，凝固后用切片機(jī)切片（厚度5 μm），取完整切片，將其貼附在載玻片上，55 ℃烘烤約8 h，完成石蠟切片制作。脫蠟、復(fù)水后，在蘇木精染料中染色10 min，流水沖洗后，再在0.2%伊紅酒精染液中浸泡60 s，95%乙醇分色10 s。分色后的切片迅速放于蒸餾水中搖洗3 次，每次5 min，自然晾干后，浸入二甲苯中透明3 min，滴加中性樹(shù)膠于載玻片，用蓋玻片封片后，放入55 ℃烘箱內(nèi)干燥6～8 h，完成切片染色。將切片置于顯微鏡下觀察組織形態(tài)并拍攝照片。

1.3.4 血清相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定 血清中TC（COD-PAP 法）、TG（GPO-PAP 法）、HDL-C（直接法）、LDL-C（直接法）、ALT（賴(lài)氏法）和AST（賴(lài)氏法）均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定。

1.3.5 小鼠腸道微生物分析 將每組小鼠盲腸取出后，立即收集盲腸內(nèi)含物，-80 ℃保存并用干冰送到深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行腸道微生物檢測(cè)。小鼠盲腸內(nèi)含物DNA 根據(jù)提取試劑盒QiAamp DNA stool Mini Kit 說(shuō)明書(shū)提取，利用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道中微生物16S rDNA 的V4 高變區(qū)的序列進(jìn)行測(cè)定，利用Usearch 軟件將有97%相似性的序列歸并到一個(gè)可操作分類(lèi)單元（Operational taxonomic unit，OTU），將其與16S 細(xì)菌RDP（Ribosomal database project）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并注釋種屬信息。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差、相關(guān)性分析；采用SIMCA-P 13 軟件進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal projections to latent structure-discriminant analysis，OPLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 青磚毛茶對(duì)小鼠體重、脂肪和肝臟組織的影響

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)16 周后低脂飲食小鼠的體重為（32.20±0.78）g，而高脂飲食小鼠的體重為（45.05±2.02）g，顯著高于低脂組小鼠體重；在喂食高脂飼料同時(shí)給予青磚毛茶干預(yù)后小鼠體重為（41.21±2.55）g，顯著降低了高脂引起小鼠體重的增加（P＜0.01）。對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟質(zhì)量分析表明（圖1），高脂組小鼠的肝臟質(zhì)量顯著高于低脂組，而青磚毛茶干預(yù)16 周后能夠顯著降低高脂飲食小鼠肝臟的質(zhì)量（P＜0.01）。為進(jìn)一步了解青磚毛茶對(duì)高脂飲食小鼠脂肪積累的影響，分析了腎周脂肪、腸系脂肪和附睪脂肪質(zhì)量，結(jié)果表明（圖1）高脂組小鼠的腎周脂肪、腸系脂肪和附睪脂肪質(zhì)量均明顯高于低脂組，且存在極顯著差異；青磚毛茶干預(yù)16 周后僅能夠顯著減少腸系脂肪質(zhì)量（P＜0.05），而對(duì)腎周脂肪和附睪脂肪質(zhì)量無(wú)顯著性改變。

圖1 小鼠體重、脂肪和肝臟組織質(zhì)量分析Fig.1 Analysis of body weight，fat and liver tissue mass of mice

肝臟是人體重要的生命器官，在物質(zhì)代謝尤其是脂肪代謝、生物轉(zhuǎn)化上起重要作用，而高脂飲食極易引起脂質(zhì)代謝異常，形成脂肪肝等病變[15]。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟表觀形態(tài)的觀察表明（圖2a），低脂組小鼠肝臟形態(tài)規(guī)則，邊緣銳利，顏色暗紅而有光澤，無(wú)油膩感；高脂組小鼠肝臟腫大明顯，包膜緊張，邊緣較鈍，顏色多為發(fā)白，有油膩感；青磚毛茶組小鼠肝臟表觀形態(tài)介于高脂組和低脂組之間，對(duì)高脂飲食的小鼠肝臟有不同程度的恢復(fù)作用。為了進(jìn)一步研究青磚毛茶對(duì)高脂飲食小鼠肝臟組織形態(tài)的影響，采用HE 染色對(duì)小鼠肝臟切片進(jìn)行分析，HE 染色結(jié)果如圖2b 所示，低脂組小鼠肝細(xì)胞大小一致，細(xì)胞核清晰，胞漿均勻，而高脂組小鼠肝細(xì)胞大面積腫脹，細(xì)胞界限不清，脂肪溶解后的空泡明顯增加，并呈現(xiàn)出嚴(yán)重的肝損傷現(xiàn)象；青磚毛茶干預(yù)后可明顯看出脂肪空泡的體積和數(shù)量均明顯減少，一定程度上改善了高脂飲食引起的肝損傷。

圖2 肝臟組織形態(tài)觀察Fig.2 Morphological observation of liver tissues

2.2 青磚毛茶對(duì)小鼠血清中主要生理和生化指標(biāo)影響

為了系統(tǒng)全面的評(píng)價(jià)青磚毛茶對(duì)高脂飲食小鼠脂代謝的影響，分析了各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TC、TG、HDL-C 和LDL-C 等4 個(gè)主要血脂指標(biāo)。由表1可知，高脂組小鼠血清中的TC、TG、HDLC 和LDL-C 含量均高于低脂組，其中僅TG 無(wú)顯著性差異，其余均存在極顯著差異（P＜0.01）；而青磚毛茶干預(yù)后能顯著降低小鼠TC、TG、HDL-C 和LDL-C 含量，其中HDL-C 存在顯著差異（P＜0.05），TC、TG 和LDL-C 存在極顯著差異（P＜0.01）。與低脂組相比，青磚毛茶干預(yù)后小鼠血清中僅TG 含量要低于低脂組，而無(wú)顯著性差異；TC、HDL-C 和LDL-C 含量均高于低脂組，其中HDL-C 無(wú)顯著性差異，TC 和LDL-C 有顯著性差異（P＜0.05）。血清中LDL-C 的水平通常被作為衡量動(dòng)脈粥樣硬化的重要指標(biāo)[16]，說(shuō)明青磚毛茶有降低動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的能力。研究表明，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)的AST 和ALT 可進(jìn)入血液中，引起血AST 和ALT 含量升高[17]。為了進(jìn)一步分析青磚毛茶改善由高脂飲食引起的肝損傷或損傷程度的能力，對(duì)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的活力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明（表1），高脂組小鼠血清中AST 和ALT 活力極顯著高于低脂組（P＜0.01），而青磚毛茶干預(yù)后小鼠血清中AST 和ALT 活力顯著降低（P＜0.01），且與低脂組無(wú)顯著差異。

表1 青磚毛茶對(duì)小鼠血清中主要生理生化指標(biāo)的影響Table 1 Effects of Qingzhuan Maocha on the main physiological and biochemical indexes in serum of mice

2.3 青磚毛茶對(duì)小鼠腸道微生物的影響

2.3.1 腸道微生物菌群多樣性分析 高通量測(cè)序表明，18 只小鼠盲腸內(nèi)含物樣品的平均測(cè)序深度（Clean reads）為64 950 個(gè)，共得到398 個(gè)不同的OTU。基于OTU 的相對(duì)豐度對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道微生物進(jìn)行主成分分析表明（圖3a），低脂組、高脂組和青磚毛茶組被明顯分開(kāi)，說(shuō)明3 組小鼠的腸道微生物在OTU 水平上存在較大差異；其次，明顯看出青磚毛茶組在Y 軸上的投影逐漸向低脂組移動(dòng)，說(shuō)明青磚毛茶干預(yù)可以將高脂飲食小鼠的腸道微生物組成逐漸向正常狀態(tài)移動(dòng)。為了更好地展示不同實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道微生物的差異，對(duì)獲得的398 個(gè)OTU 進(jìn)行維恩圖分析表明（圖3b），低脂組、高脂組和青磚毛茶組有292 個(gè)共有OTU，說(shuō)明各實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道微生物種類(lèi)在OTU 水平上差異相對(duì)較小。然而，不同實(shí)驗(yàn)組間的腸道微生物種類(lèi)存在一定差異，如低脂組、高脂組和青磚毛茶組中分別有10，14，16 個(gè)特有OTU，說(shuō)明飲食能夠誘導(dǎo)小鼠腸道微生物種類(lèi)的變化。

為進(jìn)一步了解低脂組、高脂組和青磚毛茶組小鼠腸道微生物的組成，從門(mén)和科水平上對(duì)小鼠腸道微生物菌群的相對(duì)豐度進(jìn)行分析。各實(shí)驗(yàn)組小鼠的腸道微生物菌群在門(mén)水平的影響如圖3c所示，小鼠腸道微生物主要是由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria） 和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）組成，與其它報(bào)道結(jié)果相似[18]。與低脂組相比，高脂能夠顯著增加厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，并降低變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，從而導(dǎo)致厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值顯著增加，進(jìn)而可能會(huì)導(dǎo)致宿主能量攝取的增強(qiáng)，從而增加患代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)[19]；青磚毛茶干預(yù)后可以顯著降低厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，增加變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，從而降低厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比例，進(jìn)而降低患代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)。小鼠的腸道微生物菌群在科水平的影響如圖3d 所示，與低脂組相比，高脂能夠顯著降低脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、S24-7 等相對(duì)表達(dá)豐度，增加毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、紅蝽?xiàng)U菌科（Coriobacteriaceae）的相對(duì)豐度；青磚毛茶干預(yù)后可以增加脫硫弧菌科的相對(duì)豐度，降低毛螺菌科、丹毒絲菌科、紅蝽?xiàng)U菌科等的相對(duì)豐度。

圖3 青磚毛茶對(duì)小鼠腸道微生物菌群組成的影響Fig.3 Effects of Qingzhuan Maocha on composition of gut microbiota of mice

2.3.2 青磚毛茶誘導(dǎo)的關(guān)鍵差異OTU 分析 高脂、藥物等干預(yù)對(duì)同一個(gè)種屬的腸道微生物在OTU 水平上存在較大差異，在OTU 水平上分析腸道微生物的變化具有重要意義[20]。因此，利用SIMCA-P 13 軟件對(duì)低脂組、高脂組和青磚毛茶組的OTU 相對(duì)豐度進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），獲得大于1 的關(guān)鍵變量，同時(shí)結(jié)合相對(duì)豐度超過(guò)0.1%的OTU（P＜0.05）進(jìn)行關(guān)鍵差異OTU 篩選。由圖4可知，共篩選出71 個(gè)關(guān)鍵差異OTU，主要為厚壁菌門(mén)/梭菌綱（Clostridia）/梭菌目（Clostridiales）的瘤胃球菌科和毛螺菌科的腸道微生物菌群；部分?jǐn)M桿菌門(mén)/擬桿菌綱（Bacteroidia）/擬桿菌目（Bacteroidales） 和少數(shù)放線菌門(mén)（Actinobacteria）/紅椿菌綱（Coriobacteriia）/紅椿菌目（Coriobacteriales）的腸道微生物菌群。與低脂組相比，高脂組增加了34 個(gè)OTU、降低了37 個(gè)OTU 的相對(duì)豐度，青磚毛茶干預(yù)增加了33 個(gè)OTU、降低了38 個(gè)OTU 的相對(duì)豐度。由圖4可知，共有46 個(gè)OTU 在高脂飲食后發(fā)生顯著改變，后又被青磚毛茶調(diào)節(jié)回來(lái)，其中有25 個(gè)OTU 相對(duì)豐度因高脂飲食后發(fā)生顯著降低，而在青磚毛茶干預(yù)作用下增加；21 個(gè)OTU 相對(duì)豐度因高脂飲食后發(fā)生顯著增加，而在青磚毛茶干預(yù)作用下降低。

圖4 關(guān)鍵差異OTU 熱圖分析（相對(duì)豐度標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換）Fig.4 Analysis of key differentially OTU by heat map（normalized conversion of relative abundance）

2.3.3 關(guān)鍵差異OTU 與生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析 將青磚毛茶在高脂飲食小鼠中起顯著作用的46 個(gè)關(guān)鍵差異OTU 與小鼠的生理生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析（圖5）。結(jié)果表明，其中有39 個(gè)OTU與小鼠體重、肝臟質(zhì)量、腎周脂肪、腸系脂肪、附睪脂肪、TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT 和AST 中至少1 個(gè)指標(biāo)呈顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。相關(guān)研究表明，丹毒絲菌科、紅蝽?xiàng)U菌科、紅蝽?xiàng)U菌科和瘤胃球菌科均被報(bào)道與代謝綜合癥密切相關(guān)[21-23]。由圖5可知，OTU18、OTU7 屬于丹毒絲菌科；OTU8、OTU289 屬于紅蝽?xiàng)U菌科；OTU28、OTU34、OTU52、OTU55、OTU67、OTU86、OTU88、OTU134 和OTU265等9 個(gè)OTU 屬于紅蝽?xiàng)U菌科；OTU13、OTU14、OTU33、OTU47、OTU51、OTU62、OTU75、OTU91、OTU111 和OTU261 等10 個(gè)OTU 屬于瘤胃球菌科；因此推測(cè)這些OTU 可能是青磚毛茶在預(yù)防和治療代謝綜合征中起重要作用。此外，由圖5可知，有20 個(gè)OTU 與至少2 個(gè)小鼠生理生化指標(biāo)呈顯著正相關(guān)，這些OTU 的相對(duì)表達(dá)豐度被青磚毛茶干預(yù)后顯著降低；主要包括Oscillospira（OTU14、OTU51、OTU33 和OTU47）、Dorea（OTU265）、Allobaculum（OTU7）、Adlercreutzia（OTU289）、Bac-注：○低脂組和青磚毛茶組OTU 相對(duì)豐度少于高脂組；●低脂組和青磚毛茶組OTU 相對(duì)豐度高于高脂組；★高脂導(dǎo)致變化的OTU被青磚毛茶恢復(fù)回來(lái)。熱圖顏色表示相關(guān)性系數(shù)；* 和** 表示顯著性分別為P<0.05 和P<0.01。teroides_uniformis（OTU260）和Lactobacillus_reuteri（OTU49）。相反的，有9 個(gè)OTU 與至少2 個(gè)小鼠生理生化指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)，這些OTU 的相對(duì)表達(dá)豐度被青磚毛茶干預(yù)后顯著增加；主要包括Bacteroides（OTU74）、Dorea（OTU52）和 Ruminococcus_gnavus（OTU265）。另外，有10 個(gè)OTU僅與小鼠TG 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明這些OTU在青磚毛茶調(diào)節(jié)小鼠的TG 中起重要作用。綜上所述，青磚毛茶干預(yù)可以調(diào)節(jié)高脂誘導(dǎo)的腸道微生物菌群紊亂，并與低脂組有相似的健康腸道菌群組成。

圖5 關(guān)鍵差異OTU 相對(duì)豐度和主要生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of key differentially OTU relative abundance and the main physiological and biochemical indexes

3 討論與結(jié)論

肥胖、高血壓、高血脂、胰島素抵抗和高血糖癥為特征的代謝綜合癥已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的一個(gè)重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。近年來(lái)，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均已經(jīng)證實(shí)了茶葉具有預(yù)防和緩解代謝綜合癥的功能。研究表明，綠茶具有顯著的減肥、降血脂、保護(hù)肝臟、降血糖的功能。廖素鳳等[24]研究認(rèn)為綠茶提取物能顯著降低、高脂飲食引起的體重增加和血清中TC、TG、ALT 和AST 的含量，具有顯著降血脂功能；Xu 等[25]研究結(jié)果表明綠茶多糖對(duì)體重增加和脂肪質(zhì)量升高有顯著的抑制作用，并可以改善大鼠血脂和肝臟氧化應(yīng)激水平。青磚毛茶通常以較為粗老的中、小葉種茶樹(shù)鮮葉為原料經(jīng)殺青、揉捻、曬干等工藝加工而成，在加工工藝和生化成分上與綠茶較為相似。本研究通過(guò)對(duì)青磚毛茶干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖C57BL/6J 小鼠的主要生理生化指標(biāo)分析表明，青磚毛茶可以顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體重、腸系脂肪、肝臟質(zhì)量的增加以及血清中TC、TG、HDL-C 和LDL-C 的增加，與前人的研究結(jié)果較為類(lèi)似。肝臟是機(jī)體脂肪合成和脂質(zhì)代謝最主要的場(chǎng)所，高脂飲食極易引起脂質(zhì)代謝異常，形成脂肪肝等病變[15]。通過(guò)對(duì)肝臟表觀形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，青磚毛茶能夠有效緩解高脂飲食小鼠肝臟腫大、肝臟病變等癥狀；肝臟HE 染色結(jié)果表明青磚毛茶干預(yù)后可明顯降低高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪空泡的體積和數(shù)量增加。AST、ALT 是反映肝損傷或損傷程度一個(gè)重要指標(biāo)，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)AST 和ALT 可進(jìn)入血液中，引起血AST 和ALT 含量升高[17]。青磚毛茶干預(yù)后小鼠血清中AST、ALT 含量顯著降低，且與低脂組無(wú)顯著差異。因此，青磚毛茶具有緩解高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟損傷或病變，保護(hù)肝臟的功能。

越來(lái)越多的研究表明腸道微生物在茶葉健康功能上扮演著重要的角色。普洱茶、茯磚茶和茶多酚、茶多糖、咖啡堿和沒(méi)食子酸等茶葉中的主要生物活性成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)脂代謝，緩解高脂飲食引起的肥胖[12，20]。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)低脂組、高脂組和青磚毛茶組小鼠腸道微生物多樣性進(jìn)行分析表明，3 組小鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)和組成在OTU 水平上存在較大差異，且青磚毛茶干預(yù)可以將高脂飲食小鼠的腸道微生物組成逐漸向低脂組移動(dòng)。肥胖與正常人或小鼠的厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值顯著不同，厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比值增加可能會(huì)導(dǎo)致宿主能量攝取的增強(qiáng)，從而增加代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)[19]。青磚毛茶干預(yù)后可以顯著降低厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，增加擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，降低厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比值，進(jìn)而降低代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)。在科水平上，青磚毛茶干預(yù)后可以增加脫硫弧菌科的相對(duì)豐度，降低紅蝽?xiàng)U菌科、丹毒絲菌科、紅蝽?xiàng)U菌科等的相對(duì)豐度。本研究共篩選出71 個(gè)關(guān)鍵差異OTU，其中有46 個(gè)OTU 在高脂飲食后發(fā)生顯著改變，后又被青磚毛茶調(diào)節(jié)回來(lái)。在46 個(gè)關(guān)鍵OTU 中有39 個(gè)OTU 與小鼠主要生理生化指標(biāo)中至少1 個(gè)指標(biāo)呈顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，這些OTU主要屬于丹毒絲菌科、紅蝽?xiàng)U菌科、紅蝽?xiàng)U菌科和瘤胃球菌科。飲食誘導(dǎo)肥胖宿主的腸道中比普通個(gè)體含有更高豐度的丹毒絲菌科和紅蝽?xiàng)U菌科。丹毒絲菌科可能會(huì)增加宿主對(duì)食物中能量的提取，并且丹毒絲菌科的相對(duì)豐度與宿主中的血脂呈顯著的正相關(guān)[26]。Martínez 等[21]發(fā)現(xiàn)在倉(cāng)鼠腸道中丹毒絲菌科和紅蝽?xiàng)U菌科的相對(duì)豐度與膽固醇代謝物顯示出顯著的相關(guān)性。與此同時(shí)，越來(lái)越多的研究表明紅蝽?xiàng)U菌科和瘤胃球菌科與代謝綜合癥密切相關(guān)[22-23]。綜上所述，青磚毛茶可以調(diào)節(jié)高脂誘導(dǎo)的腸道微生物菌群紊亂，并與低脂組有相似的健康腸道菌群組成；同時(shí)，推測(cè)青磚毛茶可能是通過(guò)調(diào)節(jié)厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比值和丹毒絲菌科、紅蝽?xiàng)U菌科、紅蝽?xiàng)U菌科、瘤胃球菌科等菌群的相對(duì)豐度來(lái)緩解高脂飲食引起的代謝綜合癥。