高產(chǎn)生物膜乳酸菌的篩選、鑒定及胞外多糖分泌條件的研究

鐘華晨，張 悅，顧 悅，鄭硯學(xué)，紀(jì)亞楠，王 艷，賀銀鳳*

（1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特 010018 2內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院資源環(huán)境與檢測技術(shù)研究所 呼和浩特 010031）

乳酸菌作為一種重要的益生菌，在工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)、醫(yī)藥和食品等與人類生活密切相關(guān)的領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，然而，當(dāng)乳酸菌的生存條件發(fā)生改變時，其存活率也會受到影響，進(jìn)而可能導(dǎo)致其功能改變或喪失[1-2]。經(jīng)過長期的探索，人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)乳酸菌以被膜態(tài)生長時，能夠增強(qiáng)其抵抗外界不良環(huán)境影響的能力，而且自然界存在的大部分乳酸菌屬于有益菌，高產(chǎn)生物膜的乳酸菌可以更好地發(fā)揮其益生功能，對其應(yīng)用于各個領(lǐng)域具有重要意義[3-4]。

乳酸菌生物膜是乳酸菌包埋在自身產(chǎn)生的胞外多聚物的基質(zhì)上，不可逆地附著在載體表面，顯示出與游離細(xì)胞不同表型的一種菌落聚集體。胞外多聚物主要包括胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）、蛋白質(zhì)和胞外DNA 等，EPS 是乳酸菌在繁殖代謝過程中分泌出的水溶性大分子糖類物質(zhì)，在生物膜的形成過程中必不可少，能夠和蛋白質(zhì)共同維持生物膜的結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性[5-6]。

乳酸菌的EPS 產(chǎn)量越高，預(yù)示著其產(chǎn)生物膜的能力越強(qiáng)。在相同的培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)基組分，如碳源、氮源和無機(jī)鹽等都會對乳酸菌EPS 產(chǎn)量造成一定影響。有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加不同種類及不同濃度的碳源，乳酸菌產(chǎn)EPS 量會發(fā)生改變，植物乳桿菌70810 以蔗糖為碳源時EPS的生成量達(dá)到最大值[7]，德氏乳桿菌保加利亞亞種G1EPS 最大生成量的最適碳源為葡萄糖[8]，乳酸菌Z22 以葡萄糖為碳源時EPS 的生成量達(dá)到最大[9]。氮源缺乏會導(dǎo)致菌體生長量和EPS 的積累量降低，將乳清蛋白酶解物添至乳清培養(yǎng)基中能夠促進(jìn)保加利亞乳桿菌RR 的生長，并提高EPS 的合成量[10]。有研究表明當(dāng)胰蛋白胨和蛋白胨質(zhì)量比為2∶1 時，乳酸菌SR2-2 EPS 的產(chǎn)量達(dá)到最大值[11]。無機(jī)鹽、維生素和氨基酸等營養(yǎng)成分對乳酸菌EPS 的產(chǎn)量也會造成一定影響[12]，添加無機(jī)鹽可以提高植物乳桿菌C83 EPS 的合成量[13]，在乳清培養(yǎng)基中添加無機(jī)鹽和氨基酸后，鼠李糖乳桿菌RW-9595M EPS 的合成量明顯提高[14]，然而對保加利亞乳桿菌NCFB 2772 來說，將無機(jī)鹽和維生素添加在培養(yǎng)基中，EPS 的產(chǎn)量沒有明顯變化[15]，說明菌株之間的差異性導(dǎo)致提高EPS 產(chǎn)量所需的營養(yǎng)條件不同。

乳酸菌在人體內(nèi)具有良好的益生功能，當(dāng)乳酸菌以生物膜的狀態(tài)存在時，可以有效抵御外界不良環(huán)境，確保菌體正常生長。EPS 是生物膜的主要成分，研究乳酸菌EPS 的分泌，對于進(jìn)一步提高乳酸菌生物膜的生成量，增加代謝產(chǎn)物的利用，具有重要意義。本研究以前期分離出的乳酸菌為研究對象，篩選和鑒定高產(chǎn)生物膜的乳酸菌。以提高乳酸菌生物膜的主要成分EPS 的合成量為目標(biāo)，優(yōu)化培養(yǎng)基成分，為后續(xù)研究乳酸菌抵抗環(huán)境脅迫和機(jī)體免疫防御功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

課題組前期從西藏不同地區(qū)的發(fā)酵乳制品中，在30 ℃下分離得到20 株，37 ℃下分離得到21 株，共41 株乳酸菌，具體編號及來源見表1。

表1 菌株編號及來源Table 1 Number of strains and strain source

主要試劑：Premix Taq Mix、DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer，寶生物工程有限公司；Gel View 核酸染料，TaKaRa 公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技有限公司；其余試劑均為分析純級。

1.2 培養(yǎng)基與主要儀器

MRS 培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[16]配制。

脫脂乳培養(yǎng)基：在10%脫脂乳水溶液中加入0.1%酵母提取粉，115 ℃高壓滅菌7 min，冰水激冷。

GelDoc XR+凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；Veriti96 孔快速梯度PCR 儀，美國ABI 公司；超微量蛋白核酸分析儀，英國BioDrop 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化、純化與保藏 對課題組前期分離出的41 株乳酸菌凍干粉用10%的脫脂乳活化一代，待脫脂乳凝乳后再用普通MRS 培養(yǎng)基繼續(xù)活化24 h，然后倒平板劃線培養(yǎng)48 h，挑取單菌落通過革蘭氏染色法確定菌株形態(tài)后，將乳酸菌在MRS 培養(yǎng)基中活化24 h，以4∶1 的體積比混合菌液和甘油于1.5 mL 離心管中，置于-80 ℃冰箱保藏。

1.3.2 供試菌液的制備 將甘油保存的試驗菌株按2%的體積分?jǐn)?shù)接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃或30 ℃活化二代，將活化好的二代培養(yǎng)液以4 000 r/min 的速率離心10 min（4 ℃）后，棄掉上清液，用滅菌的PBS 洗滌3 次后調(diào)節(jié)菌濃度至108CFU/mL（OD595nm值為1.0）制成供試菌液[17]。

1.3.3 具有成膜能力乳酸菌的篩選 采用結(jié)晶紫染色法測定生物膜的生成量。將供試菌液以2%的體積分?jǐn)?shù)接種于新的MRS 培養(yǎng)基中，以每孔200 μL 加入至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃或30 ℃靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)后棄上層發(fā)酵液，用滅菌的0.85%生理鹽水清洗細(xì)胞培養(yǎng)板，洗去未成膜的浮菌；待板晾干后，加入10%甲醇溶液固定細(xì)胞10 min，棄甲醇；待板晾干后，加1%結(jié)晶紫染液染色20 min，棄染液，用滅菌的PBS 洗滌3 次；待板晾干后，加33%醋酸溶液脫色10 min，測定波長595 nm 處的吸光值[18]。試驗時間為0～25 h，從4 h 開始每隔3 h 取樣進(jìn)行生物膜生成量的測定。

1.3.4 高產(chǎn)生物膜乳酸菌16S rDNA 序列的測定將1.3.3 節(jié)中篩選得到的高產(chǎn)生物膜乳酸菌用DNA 提取試劑盒提取每株菌的總DNA；通過超微量蛋白核酸分析儀測定其DNA 濃度。以提取出的DNA 作為模板，選用16S rDNA 通用引物（表2）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：預(yù)變性5 min，94 ℃；94 ℃變 性1 min，64 ℃退 火1 min，72 ℃延 伸2 min；4 ℃延伸10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若1 500 bp 處有清晰、明亮的擴(kuò)增條帶，無非特異性產(chǎn)物，表明PCR 擴(kuò)增成功；委托上海生工有限公司對PCR 產(chǎn)物測序分析，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 將菌株的16S rDNA 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中已登錄的序列進(jìn)行比較，使用DNAStar 中MegAlign 軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 通用引物序列Table 2 Universal primer sequences

1.4 乳酸菌EPS 的粗提取

將活化三代的10 mL 發(fā)酵液以8 000 r/min 離心5 min，棄菌泥，將質(zhì)量濃度為0.8 g/mL 的三氯乙酸加入無細(xì)胞上清發(fā)酵液中，使其終質(zhì)量濃度為0.04 g/mL，4 ℃靜置24 h，10 000 r/min 離心20 min，除去蛋白質(zhì)，收集上清液，加入3 倍體積95%的冰乙醇，4 ℃靜置24 h，沉淀多糖后，10 000 r/min 離心20 min，收集沉淀（紅色），超純水等體積溶解后進(jìn)行24 h 透析（中間換水4～6 次），即得到粗多糖。

1.5 培養(yǎng)基成分對乳酸菌EPS 形成的影響

1.5.1 碳源的篩選 以MRS 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將其中的葡萄糖用20.0 g/L 蔗糖、乳糖、麥芽糖和半乳糖替代，將供試菌液以2%體積分?jǐn)?shù)接種于添加不同碳源的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃或30℃靜置培養(yǎng)24 h，按照1.4 節(jié)的方法提取粗多糖，并用苯酚硫酸法測定其EPS 含量，結(jié)合菌體生長量選擇最佳碳源。

在確定出最佳碳源種類的基礎(chǔ)上，分別添加0.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 g/L 碳源，篩選出最佳的碳源質(zhì)量濃度。

1.5.2 氮源的篩選 以MRS 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將其中的大豆蛋白胨用10.0 g/L 胰蛋白胨、蛋白胨和硫酸銨替代，將供試菌液以2%的體積分?jǐn)?shù)接種于添加不同碳源的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃或30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，按照1.4 節(jié)的方法提取粗多糖，并用苯酚硫酸法測定其EPS 含量，結(jié)合菌體生長量選擇最佳氮源。

在確定出最佳氮源種類的基礎(chǔ)上，分別添加0.0，5.0，10.0，15.0，20.0 g/L 氮源，篩選出最佳的氮源質(zhì)量濃度。

1.5.3 磷酸鹽篩選 將供試菌液以2%的體積分?jǐn)?shù)接種于不同質(zhì)量濃度磷酸氫二鉀（0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 g/L）的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃或30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，按照1.4 節(jié)的方法提取粗多糖，并用苯酚硫酸法測定其EPS 含量，結(jié)合菌體生長量確定出最佳磷酸氫二鉀的質(zhì)量濃度。

1.5.4 正交試驗設(shè)計 見表3。

表3 乳酸菌EPS 最佳培養(yǎng)基成分正交設(shè)計水平因素表Table 3 Orthogonal design level and factor for the medium composition of LAB EPS

1.6.5 數(shù)據(jù)處理及分析 每組試驗重復(fù)3 次，用SPSS 23.0 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有數(shù)值用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)生物膜菌株的篩選結(jié)果

將41 株乳酸菌用96 孔板培養(yǎng)4，7，10，13，16，19，22，25 h，通過結(jié)晶紫染色法測定生物膜生成量，試驗結(jié)果見表4、5。

由表4可知，在37 ℃條件下培養(yǎng)21 株乳酸菌，在13 h 生物膜產(chǎn)量達(dá)到最高，此時乳酸菌大都處于對數(shù)末期和穩(wěn)定期，增值數(shù)與死亡數(shù)達(dá)到平衡，并產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，同時生物膜累積量也達(dá)到最高。隨著培養(yǎng)時間的延長，營養(yǎng)成分被大量消耗，菌株生長速率逐漸降低，生物膜生成量也隨之降低，由于部分浮游菌株會重新定植于載體表面，生物膜積累量會再次升高。由表5可知，在30 ℃條件下培養(yǎng)乳酸菌，大部分乳酸菌在16 h 時生物膜積累量最多，此時菌株處于穩(wěn)定期生長速率達(dá)到動態(tài)平衡，代謝產(chǎn)物大量積累。綜上所述，生物膜的形成是先上升后下降再逐漸上升的過程。

25 0.166 ± 0.018 0.259 ± 0.018 0.244 ± 0.005 0.240 ± 0.005 0.141 ± 0.023 0.191 ± 0.025 0.175 ± 0.005 0.148 ± 0.002 0.162 ± 0.015 0.170 ± 0.007 0.154 ± 0.028 0.146 ± 0.025 0.378 ± 0.016 0.142 ± 0.015 0.211 ± 0.008 0.121 ± 0.011 0.133 ± 0.011 0.226 ± 0.008 0.189 ± 0.010 0.174 ± 0.024 0.287 ± 0.016），n=3 ˉ±s（x量成生膜物生的間時同不在菌酸乳的養(yǎng)培并離分下37 ℃4表），n=3（images/BZ_103_1816_2946_1842_2988.png±s at different times Biofilm production of lactic acid bacteria isolated and cultured at 37 ℃Table 4 /h間時養(yǎng)培22 19 16 13 10 7 4 0.185 ± 0.007 0.205 ± 0.022 0.308 ± 0.036 0.413 ± 0.028 0.246 ± 0.013 0.118 ± 0.011 0.162 ± 0.020 0.242 ± 0.021 0.254 ± 0.023 0.268 ± 0.024 0.504 ± 0.036 0.396 ± 0.009 0.223 ± 0.008 0.283 ± 0.046 0.320 ± 0.019 0.234 ± 0.015 0.180 ± 0.016 0.530 ± 0.026 0.272 ± 0.020 0.166 ± 0.037 0.127 ± 0.015 0.302 ± 0.021 0.263 ± 0.011 0.343 ± 0.036 0.669 ± 0.018 0.386 ± 0.053 0.241 ± 0.023 0.324 ± 0.078 0.223 ± 0.006 0.132 ± 0.031 0.200 ± 0.038 0.439 ± 0.049 0.253 ± 0.033 0.205 ± 0.004 0.130 ± 0.040 0.221 ± 0.031 0.141 ± 0.008 0.194 ± 0.023 0.506 ± 0.026 0.356 ± 0.037 0.218 ± 0.017 0.193 ± 0.020 0.214 ± 0.018 0.154 ± 0.023 0.169 ± 0.039 0.463 ± 0.009 0.289 ± 0.039 0.183 ± 0.009 0.145 ± 0.012 0.240 ± 0.008 0.138 ± 0.015 0.208 ± 0.040 0.531 ± 0.011 0.387 ± 0.036 0.223 ± 0.014 0.108 ± 0.017 0.145 ± 0.006 0.134 ± 0.023 0.168 ± 0.028 0.589 ± 0.018 0.341 ± 0.049 0.241 ± 0.054 0.153 ± 0.036 0.230 ± 0.008 0.210 ± 0.031 0.180 ± 0.019 0.691 ± 0.014 0.336 ± 0.008 0.376 ± 0.026 0.201 ± 0.031 0.188 ± 0.025 0.229 ± 0.018 0.237 ± 0.021 0.316 ± 0.039 0.291 ± 0.010 0.115 ± 0.031 0.174 ± 0.038 0.202 ± 0.031 0.215 ± 0.023 0.219 ± 0.012 0.366 ± 0.037 0.286 ± 0.044 0.143 ± 0.009 0.233 ± 0.035 0.373 ± 0.034 0.279 ± 0.017 0.330 ± 0.012 0.487 ± 0.052 0.394 ± 0.054 0.250 ± 0.039 0.305 ± 0.047 0.153 ± 0.010 0.125 ± 0.012 0.272 ± 0.017 0.473 ± 0.047 0.373 ± 0.023 0.118 ± 0.003 0.154 ± 0.041 0.340 ± 0.033 0.233 ± 0.012 0.337 ± 0.008 0.521 ± 0.032 0.509 ± 0.043 0.227 ± 0.006 0.276 ± 0.010 0.161 ± 0.014 0.137 ± 0.021 0.257 ± 0.026 0.541 ± 0.081 0.368 ± 0.023 0.170 ± 0.034 0.163 ± 0.032 0.193 ± 0.006 0.115 ± 0.017 0.202 ± 0.024 0.439 ± 0.070 0.316 ± 0.011 0.189 ± 0.046 0.130 ± 0.040 0.311 ± 0.030 0.210 ± 0.024 0.344 ± 0.029 0.646 ± 0.004 0.392 ± 0.042 0.265 ± 0.033 0.213 ± 0.004 0.208 ± 0.023 0.191 ± 0.031 0.515 ± 0.002 0.637 ± 0.024 0.448 ± 0.047 0.243 ± 0.049 0.134 ± 0.010 0.210 ± 0.031 0.140 ± 0.002 0.223 ± 0.036 0.641 ± 0.044 0.363 ± 0.032 0.253 ± 0.074 0.138 ± 0.041 0.239 ± 0.024 0.209 ± 0.033 0.296 ± 0.003 0.628 ± 0.014 0.412 ± 0.027 0.318 ± 0.060 0.188 ± 0.053稱名株菌號序RJ2-1-8 1 RJ1-1-8 2 TZ3-1-4 3 RM3-1-4 4 RM3-1-11 5 TG12-1-1 6 RJ2-1-9 7 RM3-1-3 8 RJ2-1-1 9 RJ2-1-4 10 RJ1-1-10 11 TG3-1-2 12 RM3-1-2 13 TZ3-1-1 14 RM1-1-1 15 RJ2-1-2 16 TG9-1-3 17 TG1-1-10 18 RJ1-1-4 19 TG1-1-11 20 RM2-1-5 21

25 0.209 ± 0.020 0.282 ± 0.021 0.349 ± 0.043 0.232 ± 0.019 0.321 ± 0.046 0.217 ± 0.021 0.210 ± 0.020 0.126 ± 0.024 0.138 ± 0.042 0.673 ± 0.030 0.222 ± 0.020 0.208 ± 0.017 0.408 ± 0.021 0.268 ± 0.039 0.253 ± 0.017 0.372 ± 0.024 0.246 ± 0.016 0.215 ± 0.038 0.270 ± 0.034 0.265 ± 0.039），n=3（images/BZ_103_1816_2946_1842_2988.png±s量成生膜物生間時同不在菌酸乳的養(yǎng)培并離分下30 ℃5表），n=3（images/BZ_103_1816_2946_1842_2988.png±s at different times Biofilm production of lactic acid bacteria isolated and cultured at 30 ℃Table 5 /h間時養(yǎng)培22 19 16 13 10 7 4 0.307 ± 0.047 0.125 ± 0.003 0.255 ± 0.051 0.262 ± 0.028 0.126 ± 0.017 0.163 ± 0.016 0.165 ± 0.036 0.291 ± 0.025 0.178 ± 0.033 0.334 ± 0.021 0.181 ± 0.009 0.227 ± 0.038 0.181 ± 0.013 0.210 ± 0.019 0.319 ± 0.020 0.351 ± 0.039 0.478 ± 0.005 0.455 ± 0.031 0.432 ± 0.013 0.423 ± 0.020 0.367 ± 0.029 0.264 ± 0.011 0.163 ± 0.036 0.258 ± 0.020 0.215 ± 0.024 0.155 ± 0.036 0.215 ± 0.020 0.195 ± 0.036 0.152 ± 0.028 0.163 ± 0.040 0.163 ± 0.026 0.218 ± 0.048 0.141 ± 0.034 0.228 ± 0.021 0.200 ± 0.066 0.216 ± 0.020 0.322 ± 0.033 0.283 ± 0.029 0.178 ± 0.007 0.184 ± 0.007 0.239 ± 0.035 0.175 ± 0.020 0.120 ± 0.005 0.260 ± 0.033 0.238 ± 0.013 0.224 ± 0.004 0.083 ± 0.010 0.208 ± 0.018 0.168 ± 0.035 0.185 ± 0.010 0.230 ± 0.035 0.203 ± 0.010 0.125 ± 0.029 0.093 ± 0.009 0.253 ± 0.022 0.208 ± 0.008 0.167 ± 0.008 0.104 ± 0.014 0.209 ± 0.012 0.124 ± 0.005 0.114 ± 0.025 0.183 ± 0.031 0.099 ± 0.017 0.700 ± 0.039 0.729 ± 0.034 0.771 ± 0.016 0.660 ± 0.029 0.563 ± 0.026 0.639 ± 0.017 0.603 ± 0.041 0.378 ± 0.023 0.177 ± 0.024 0.281 ± 0.036 0.177 ± 0.024 0.184 ± 0.013 0.205 ± 0.035 0.173 ± 0.006 0.187 ± 0.015 0.156 ± 0.035 0.237 ± 0.036 0.142 ± 0.013 0.153 ± 0.031 0.191 ± 0.016 0.164 ± 0.038 0.325 ± 0.027 0.258 ± 0.037 0.487 ± 0.032 0.272 ± 0.031 0.146 ± 0.021 0.199 ± 0.050 0.152 ± 0.020 0.229 ± 0.026 0.162 ± 0.021 0.408 ± 0.018 0.186 ± 0.037 0.118 ± 0.028 0.163 ± 0.039 0.181 ± 0.031 0.151 ± 0.032 0.144 ± 0.029 0.340 ± 0.031 0.142 ± 0.030 0.111 ± 0.016 0.146 ± 0.016 0.188 ± 0.032 0.239 ± 0.033 0.359 ± 0.033 0.704 ± 0.067 0.444 ± 0.031 0.367 ± 0.038 0.359 ± 0.042 0.411 ± 0.012 0.119 ± 0.029 0.226 ± 0.026 0.344 ± 0.027 0.157 ± 0.026 0.106 ± 0.022 0.152 ± 0.020 0.103 ± 0.014 0.226 ± 0.017 0.214 ± 0.026 0.319 ± 0.019 0.138 ± 0.026 0.127 ± 0.028 0.249 ± 0.039 0.124 ± 0.014 0.142 ± 0.032 0.107 ± 0.011 0.351 ± 0.028 0.120 ± 0.019 0.125 ± 0.026 0.209 ± 0.005 0.122 ± 0.022 0.08 ± 0.006 0.212 ± 0.020 0.443 ± 0.014 0.128 ± 0.010 0.157 ± 0.011 0.163 ± 0.027 0.108 ± 0.009稱名株菌號序TG2-1-5 1 TG5-1-6 2 TG7-1-6 3 TG7-1-4 4 RS1-1-2 5 TG12-1-6 6 RM1-1-20 7 TG12-1-5 8 RM2-1-19 9 TG7-1-1 10 TG7-1-3 11 TG3-1-19 12 TG5-1-5 13 RM3-1-7 14 RQ1-1-2 15 RM1-1-4 16 TG11-1-10 17 TG8-1-9 18 TG2-1-14 19 TZ1-1-13 20

通過比較不同菌株生物膜的最大生成量，篩選高產(chǎn)生物膜的乳酸菌用于后續(xù)試驗，結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 21 株乳酸菌在13 h 生物膜生成量Fig.1 Biofilm production of 21 strains of LAB 13 hours

圖2 20 株乳酸菌在16 h 生物膜生成量Fig.2 Biofilm production of 20 strains of LAB 16 hours

由圖1可知，將菌株在37 ℃培養(yǎng)13 h 后采用結(jié)晶紫染色法測定生物膜生成量，其中RM3-1-4、RJ2-1-4、TG1-1-10、RJ1-1-4、TG1-1-11、RM2-1-5 共6 株乳酸菌的成膜量顯著高于其它菌株；由圖2可知，將菌株在30 ℃培養(yǎng)16 h 后采用結(jié)晶紫染色法測定生物膜生成量，其中TG7-1-1、RM1-1-4、TG5-1-5、TG7-1-6 4 株乳酸菌的成膜量顯著高于其它菌株。因此，選取以上10 株高產(chǎn)生物膜的乳酸菌進(jìn)行后續(xù)益生特性研究。

2.2 高產(chǎn)生物膜乳酸菌的鑒定

2.2.1 乳酸菌16S rDNA 擴(kuò)增結(jié)果 對高產(chǎn)生物膜的10 株乳酸菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。10 株菌的DNA 經(jīng)16S rDNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳見圖3。10 株高產(chǎn)生物膜的乳酸菌在1 500 bp 處條帶清晰明亮，無非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，符合測序要求。

圖3 乳酸菌16S rDNA 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA gene fragments from LAB

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹及同源性分析 將10 株高產(chǎn)生物膜乳酸菌的基因序列與Gene Bank 中菌株16S rRNA 基因序列相比較，同源性分析結(jié)果見圖4。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

圖5 試驗菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogentic tree of test strains

由圖4、5 可知，乳酸菌RM1-1-4、TG1-1-10、RJ2-1-4、TG1-1-11 和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）NGRI 0510Q 同源性分別為99.5%，98.1%，99.7%，98.4%且屬于同一分支，乳酸菌RJ1-1-4 和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JCM 1149 同源性為99.6%且屬于同一分支，乳酸菌TG7-1-1 和乳酸乳球菌（Lactococcus lictis）NBRC100933 同源性為99.5%且屬于同一分支，乳酸菌TG7-1-6 和乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp.cremoris）NBRC 100676 同源性為97.6%且屬于同一分支，乳酸菌RM3-1-4、RM2-1-5 和堅韌腸球菌（Enterococcus durans）NBRC 100479 同源性分別為98.6%和99.1%且屬于同一分支，乳酸菌TG5-1-5 和腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）JCM 6124 同源性為99.5%且屬于同一分支。

圖4 試驗菌株與其它乳酸菌的同源性分析Fig.4 The homology analysis between the test strain and knowns LABs

綜上所述，乳酸菌RM1-1-4、TG1-1-10、RJ2-1-4、TG1-1-11 為乳酸片球菌，RJ1-1-4 為植物乳桿菌，TG7-1-1 為乳酸乳球菌，TG7-1-6 為乳酸乳球菌乳脂亞種，RM3-1-4、RM2-1-5 為堅韌腸球菌，TG5-1-5 為腸膜明串珠菌。

對篩選出的10 株高產(chǎn)生物膜菌株進(jìn)行潛在益生特性的測定，最終選擇具有良好潛在益生特性的乳酸片球菌RJ2-1-4 進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3 不同培養(yǎng)基成分對乳酸菌EPS 產(chǎn)量的影響

2.3.1 碳源種類及濃度對乳酸菌EPS 產(chǎn)量的影響碳源是菌株生長繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，能為細(xì)胞合成產(chǎn)物提供碳架[19]。不同菌株的碳水化合物代謝酶系統(tǒng)不同，所以不同的碳源種類及濃度對菌株的生長及代謝有很大的影響，本試驗旨在提高乳酸菌EPS 的產(chǎn)量進(jìn)而提高生物膜產(chǎn)量，因此要對碳源進(jìn)行篩選，以找到最佳碳源，不同碳源種類見圖6。

圖6 不同碳源種類對菌株RJ 2-1-4 EPS 的影響Fig.6 Effects of different carbon sources on the EPS of RJ 2-1-4

在MRS 培養(yǎng)基中添加不同種類的碳源，37℃靜置培養(yǎng)24 h，用苯酚硫酸法測定菌株EPS 的產(chǎn)量。由圖6可知，菌株RJ2-1-4 在以葡萄糖為碳源時，EPS 的產(chǎn)量最大，其次是乳糖、蔗糖、麥芽糖，以半乳糖為碳源時EPS 的產(chǎn)量最低。綜上所述，葡萄糖為菌株RJ2-1-4 高產(chǎn)EPS 的最佳碳源，不同葡萄糖濃度對菌株RJ2-1-4 的EPS 合成量的影響結(jié)果見圖7。

由圖7可知，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，菌株RJ2-1-4 EPS 的產(chǎn)量逐漸升高，與對照組（葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L） 相比較，質(zhì)量濃度為30 g/L 時，菌株RJ2-1-4 EPS 產(chǎn)量顯著增加，且產(chǎn)量達(dá)到最大值。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時，EPS產(chǎn)量有所減少，可能是由于高質(zhì)量濃度的葡萄糖會導(dǎo)致菌株RJ2-1-4 細(xì)胞滲透壓過大，對菌株產(chǎn)EPS 有抑制作用。同時隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，菌株生長量也逐漸增加，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到50 g/L 時，菌株生長量明顯下降，可能由于高質(zhì)量濃度的碳源會抑制菌株生長，這與陳媛等[20]的研究結(jié)果一致。因此選擇30 g/L 作為乳酸片球菌RJ2-1-4 高產(chǎn)EPS 的最佳碳源質(zhì)量濃度。

圖7 不同葡萄糖質(zhì)量濃度對菌株RJ2-1-4 EPS 的影響Fig.7 Effect of different glucose mass concentration on EPS of RJ2-1-4

2.3.2 氮源種類及濃度對乳酸菌EPS 產(chǎn)量的影響氮源能夠為菌體生長繁殖提供氮素，組成菌體蛋白質(zhì)、核酸及其它含氮代謝物[21]。本試驗選用大豆蛋白胨、普通蛋白胨、胰蛋白胨和硫酸銨作為氮源，考察不同氮源對菌株RJ2-1-4 EPS 合成量的影響，以篩選出最佳氮源種類，將最佳氮源以不同濃度添加到MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h測定乳酸菌RJ2-1-4 EPS 的產(chǎn)量，進(jìn)一步確定最佳氮源濃度，具體結(jié)果見圖8、9。

由圖8可知，以大豆蛋白胨為主要氮源時，菌株RJ2-1-4 EPS 的合成量最高，其次是普通蛋白胨和胰蛋白胨，以硫酸銨作為主要氮源時產(chǎn)生EPS 最少，因此選擇大豆蛋白胨作為最佳氮源。不同大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對菌株RJ2-1-4 EPS 合成量的影響結(jié)果見圖9。

圖8 不同氮源種類對菌株RJ2-1-4 EPS 的影響Fig.8 Effects of different nitrogen sources on the EPS of RJ2-1-4

以大豆蛋白胨作為主要氮源，添加質(zhì)量濃度為0，5，10，15，20 g/L 的大豆蛋白胨于MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置24 h 測定菌株EPS 的產(chǎn)量。由圖9可知，在大豆蛋白胨的質(zhì)量濃度為0～15 g/L 時，菌株生長量無明顯變化，而EPS 產(chǎn)量隨著大豆蛋白胨質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)大豆蛋白胨的質(zhì)量濃度為15 g/L 時，菌株RJ2-1-4 EPS 的合成量達(dá)到最大。隨著質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大，EPS 的合成量略有降低，可能是由于高質(zhì)量濃度的大豆蛋白胨對菌體產(chǎn)生滲透脅迫，從而抑制EPS 的合成量。綜上所述，乳酸片球菌RJ2-1-4 高產(chǎn)EPS 的最佳氮源質(zhì)量濃度為15 g/L。

圖9 不同大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對菌株RJ2-1-4 EPS 的影響Fig.9 Effect of different soybean peptone mass concentration on the EPS of RJ2-1-4

2.3.3 磷酸鹽濃度對乳酸菌EPS 產(chǎn)量的影響 無機(jī)鹽是微生物生長繁殖過程中必不可少的物質(zhì)，對構(gòu)成菌體細(xì)胞成分，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的酸度，保持pH 值的穩(wěn)定，促進(jìn)菌株生長代謝有重要的作用。本試驗以MRS 培養(yǎng)基中的磷酸氫二鉀為基礎(chǔ)磷酸鹽，通過改變磷酸氫二鉀的質(zhì)量濃度，考察乳酸片球菌RJ2-1-4 高產(chǎn)EPS 的最佳磷酸鹽質(zhì)量濃度。試驗結(jié)果見圖10。

由圖10可知，菌株RJ2-1-4 EPS 的合成量隨著磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度為6 g/L 和8 g/L 時，EPS 生成量明顯高于對照組（2 g/L），當(dāng)質(zhì)量濃度大于8 g/L 時，EPS 的合成量減少，而菌體生長量隨著磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度的增大而緩慢增加，這與EPS 產(chǎn)量的變化無相關(guān)性。綜上所述，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，菌株EPS 的合成量隨著磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢。

圖10 不同磷酸氫二鉀濃度對菌株RJ2-1-4 EPS 的影響Fig.10 Effects of different concentrations of dipotassium hydrogen phosphate on the EPS of RJ2-1-4

2.3.4 正交試驗結(jié)果 以上述單因素研究結(jié)果為基礎(chǔ)，以葡萄糖、大豆蛋白胨以及磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度為參考因素進(jìn)行3 因素3 水平的正交試驗，以確定菌株RJ2-1-4 合成EPS 的最佳培養(yǎng)基成分。利用酶標(biāo)儀測定OD595nm值，通過標(biāo)曲計算EPS產(chǎn)量。正交試驗因素及水平編碼表見表3。正交試驗結(jié)果見表6。

表6 乳酸菌RJ2-1-4 產(chǎn)EPS 最佳培養(yǎng)基成分正交試驗結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental results of optimal medium composition of EPS produced by LAB RJ2-1-4

由表6可知，菌株RJ2-1-4 EPS 產(chǎn)量最大的組合為A1B3C3（A 為葡萄糖，B 為大豆蛋白胨，C 為磷酸氫二鉀），最大值為（427.83±18.40） mg/L，相比于未優(yōu)化前EPS 產(chǎn)量（299.08±23.20）mg/L 提高了約30%。根據(jù)極差分析得出各因素對結(jié)果的主次順序為：B>A>C。大豆蛋白胨的質(zhì)量濃度對其影響最大，其次是葡萄糖，而磷酸鹽的添加量對試驗結(jié)果影響最小。根據(jù)均值分析得出最優(yōu)組合為A1B3C3，綜上所述，乳酸片球菌RJ2-1-4 產(chǎn)EPS 的最佳培養(yǎng)基組合為葡萄糖為20 g/L，大豆蛋白胨為20 g/L，磷酸氫二鉀為8 g/L。

3 結(jié)論

1）對課題組前期分離出的41 株乳酸菌以高產(chǎn)生物膜為指標(biāo)進(jìn)行篩選，最終得到10 株生物膜產(chǎn)量較高的菌株。經(jīng)16S rDNA 基因組序列分析得出，乳酸菌RM1-1-4、TG1-1-10、RJ2-1-4、TG1-1-11 為乳酸片球菌，RJ1-1-4 為植物乳桿菌，TG7-1-1 為乳酸乳球菌，TG7-1-6 為乳酸乳球菌乳脂亞種，RM3-1-4、RM2-1-5 為堅韌腸球菌，TG5-1-5 為腸膜明串珠菌。

2）通過單因素試驗和正交試驗，探究不同培養(yǎng)基成分對乳酸片球菌RJ2-1-4 EPS 產(chǎn)量的影響。最佳培養(yǎng)基組合為：葡萄糖為20 g/L，大豆蛋白胨為20 g/L，磷酸氫二鉀為8 g/L。優(yōu)化后EPS產(chǎn)量為 （427.83±18.40） mg/L，較優(yōu)化前提高約30%，為后續(xù)胞外多糖的深入研究奠定基礎(chǔ)。