DPP-4抑制劑LGT-6在不同種屬血漿中蛋白結(jié)合率的比較

廖偉科 楊華麗 王忠元 陳瑞 湯磊 崔杏 朱高峰

中圖分類號(hào) R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）14-1728-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.11

摘 要 目的：建立二肽基肽酶4抑制劑LGT-6在不同種屬血漿中蛋白結(jié)合率的測(cè)定方法并比較差異。方法：采用平衡透析法，以磷酸鹽緩沖液為透析外液，將3、30、300、3 000 nmol/L的LGT-6分別在大鼠、猴、人血漿（即透析內(nèi)液）中平衡48 h。以甲苯磺丁脲為內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定透析內(nèi)、外液中LGT-6的濃度，計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率。以ACQUITY UPLC HSS T3為色譜柱，以水（含0.01%甲酸）-乙腈（含0.01%甲酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.6 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL;離子源為電噴霧離子源，監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，采集模式為正離子模式，定量分析用離子對(duì)分別為m/z 487.0→434.3（LGT-6）、m/z 271.1→172.0（內(nèi)標(biāo)）。結(jié)果：在3、30、300、3 000 nmol/L濃度下，LGT-6在大鼠血漿中的蛋白結(jié)合率分別為（96.25±0.97）%、（84.16±1.24）%、（78.25±0.61）%、（66.63±0.95）%，在猴血漿中的蛋白結(jié)合率分別為（98.54±0.58）%、（87.27±1.01）%、（79.35±0.86）%、（66.69±0.54）%，在人血漿中的蛋白結(jié)合率分別為（99.40±1.03）%、（84.48±1.15）%、（77.62±0.77）%、（66.93±0.48）%。在相同濃度下，LGT-6在大鼠、猴和人血漿中的蛋白結(jié)合率沒有明顯差異（P>0.05）;在相同種屬血漿中，不同濃度LGT-6的血漿蛋白結(jié)合率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且有隨藥物濃度的升高而降低的趨勢(shì)。結(jié)論：成功建立了測(cè)定LGT-6血漿蛋白結(jié)合率的方法。在相同濃度下，LGT-6在大鼠、猴、人血漿中的蛋白結(jié)合率沒有明顯的種屬差異，但有明顯的濃度依賴趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞 二肽基肽酶4抑制劑;LGT-6;平衡透析法;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;血漿蛋白結(jié)合率;不同種屬血漿

Comparison of Protein Binding Rate of DPP-4 Inhibitor LGT-6 in Different Species of Plasma

LIAO Weike1，2，YANG Huali3，WANG Zhongyuan3，CHEN Rui1，2，TANG Lei1，2，CUI Xing1，2，ZHU Gaofeng1，2? ? ? ? （1. Guizhou Provincial Engineering Technology Research Center for Chemical Drug R&D， Guiyang 550004， China; 2. College of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 3. Dept. of Pharmacy， Guizhou Provincial Peoples Hospital， Guiyang 550002， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for determining protein binding rate of dipeptidyl peptidase-4 inhibitor LGT-6 in different species of plasma， and to compare their difference. METHODS： By equilibrium dialysis， LGT-6 （3， 30， 300， 3 000 nmol/L） was equilibrated in rat， monkey and human plasma （i. e. internal dialysis solution） for 48 h， using phosphate buffer as the external dialysis solution. The concentration of LGT-6 in internal and external dialysis solution was determined by UPLC-MS/MS using tolbutamide as internal standard， and the plasma protein binding rate was calculated. The determination was performed on ACQUITY UPLC HSS T3 column with water （containing 0.01% formic acid）-acetonitrile （containing 0.01% formic acid） as mobile phase at the flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was 40 ℃， and the sample size was 2 μL. The ion source was electrospray ion source， and the multiple ion monitoring mode was used to carry out positive ionization scanning. The ion pairs for quantitative analysis were m/z 487.0→434.3 （LGT-6）， m/z 271.1→172.0 （internal standard）， respectively. RESULTS： At the concentrations of 3， 30， 300， and 3 000 nmol/L， the protein binding rates of LGT-6 in rat plasma were （96.25±0.97）%， （84.16±1.24）%， （78.25±0.61）%， （66.63±0.95）%; the protein protein binding rates in monkey plasma were （98.54±0.58）%， （87.27±1.01）%， （79.35±0.86）%， （66.69±0.54）%; the protein binding rates in human plasma were （99.40±1.03）%， （84.48±1.15）%， （77.62±0.77）%， （66.93±0.48）%. At the same concentration， the protein binding rates of LGT-6 in rat， monkey and human plasma had no significant difference （P>0.05）. In the same species of plasma， there were significant differences in the plasma protein binding rates of different concentration of LGT-6 among those groups （P<0.05）， and it decreased with the increase of drug concentration. CONCLUSIONS： The method for the determination of plasma protein binding rate of LGT-6 is successfully established. The data revealed that the protein binding rate of LGT-6 is concentration-dependent， there was no obvious species difference on protein binding rates of LGT-6 in rat， monkey and human plasma under the same concentration.

KEYWORDS? ?Dipeptidyl peptidase-4 inhibitor; LGT-6; Balanced dialysis; UPLC-MS/MS; Plasma protein binding rate; Different species of plasma

隨著發(fā)病率和致死率的逐年上升，糖尿病已成為全球最大的公共衛(wèi)生事件之一[1]。相比于傳統(tǒng)的雙胍類、磺酰脲類、噻唑烷酮類、美脲類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素（易引起體質(zhì)量增加、胃腸道不適、低血糖風(fēng)險(xiǎn)升高等）和新型治療藥物胰高血糖素樣肽1受體激動(dòng)劑（需皮下注射給藥）、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑（存在潛在的降低血壓及引起生殖感染的風(fēng)險(xiǎn)）等，二肽基肽酶4（DPP-4）抑制劑以其獨(dú)特的降糖機(jī)制以及較高的安全性引起了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注[2-8]。經(jīng)典的DPP-4抑制劑如沙格列汀、阿格列汀等均為每天給藥1次。然而，2型糖尿病是需要終身服藥的慢性代謝性疾病，患者對(duì)該病的治療需求已經(jīng)逐漸從每天給藥1次向每周給藥1次轉(zhuǎn)變[9-10]。盡管長(zhǎng)效抑制劑曲格列汀和奧格列汀已于2015年在日本獲批上市[1-2]，然而其原研企業(yè)均表示不會(huì)再尋求每周給藥1次的糖尿病藥物在除日本以外的國(guó)家上市[11-12]。因此，研發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的長(zhǎng)效DPP-4抑制劑對(duì)于提高患者用藥依從性、降低長(zhǎng)期給藥可能帶來的嚴(yán)重副反應(yīng)等具有重要研究意義。

LGT-6的化學(xué)名為8-[（3R）-3-氨基-1-哌啶基]-7-（2-丁炔-1-基）-3，7-二氫-3-甲基-1-[1-（4-甲基喹唑啉-2-基）乙基]-1H-嘌呤-2，6-酮（結(jié)構(gòu)式見圖1），是本課題組前期以利格列汀為先導(dǎo)化合物，經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾而獲得的DPP-4抑制劑，其降糖活性、藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)均優(yōu)于利格列汀[13]。藥物的血漿蛋白結(jié)合率是指藥物入血后與血漿中所有蛋白結(jié)合的量占藥物總量的百分比，是反映藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄過程的重要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)之一。藥物被吸收后，只有沒有與血漿蛋白結(jié)合的游離藥物才能通過生物膜并作用于靶器官而發(fā)揮藥理作用，故測(cè)定藥物與血漿蛋白的結(jié)合率在新藥研發(fā)及臨床研究中非常重要[14-15]。血漿蛋白結(jié)合會(huì)影響藥物在組織和血液中的藥動(dòng)學(xué)特征以及后期相關(guān)制劑的給藥方案;此外，血漿蛋白結(jié)合率也是設(shè)置人體暴露安全范圍和臨床試驗(yàn)劑量的重要依據(jù)。為此，本研究采用平衡透析法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS法）測(cè)定LGT-6在不同種屬血漿中的蛋白結(jié)合率，為該化合物后期的藥效學(xué)、藥理學(xué)和臨床研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-30AD型UPLC儀（日本Shimadzu公司）、TQ-6500+型質(zhì)譜檢測(cè)儀（美國(guó)AB Sciex公司）、Thermo型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器有限公司）、JN300-2型氮?dú)獯祾邇x（蘇州吉米諾儀器有限公司）、X1型高速離心機(jī)（香港基因有限公司）、FA805N型十萬(wàn)分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（邦西儀器科技有限公司）、HC-100型制冷型恒溫混勻儀（北京昊諾斯科技有限公司）、DW-86L486型-80 ℃立式超低溫保存箱和BCD- 248WDPM型-20 ℃冰箱（青島海爾集團(tuán)）等。

1.2 主要藥品與試劑

LGT-6對(duì)照品（批號(hào)20200804）由貴州醫(yī)科大學(xué)高等藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成，經(jīng)高效液相色譜和核磁共振結(jié)構(gòu)鑒定純度>99.0%;甲苯磺丁脲對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)HY-B0401-46070，純度>99.0%）購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司;透析袋（截留分子量8～14 kDa）購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司;磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，12周齡，體質(zhì)量為200～230 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2019- 0014。

1.4 血漿

健康人血漿（貨號(hào)PL030320T）由北京四正柏生物科技有限公司提供;猴血漿由美迪西普亞醫(yī)藥科技上海有限公司提供;大鼠血漿取自“1.3”項(xiàng)下SD大鼠。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

以ACQUITY UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱，以水（含0.01%甲酸）為流動(dòng)相A、乙腈（含0.01%甲酸）為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～2 min，10%B;2～7 min，10%B→95%B;7～9 min，95%B;9～11 min，95%B→10%B，11～14 min，10%B）;流速為0.6 mL/min;柱溫為40 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃;進(jìn)樣量為2 μL。

離子源為電噴霧離子源，離子源電壓為5 500 V，離子源溫度為500 ℃;采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，采集模式為正離子模式;氣簾氣壓力為20 psi，霧化氣壓力為50 psi，輔助加熱氣壓力為60 psi;LGT-6的去簇電壓為134 V，碰撞電壓為34 V，入口電壓為10 V，碰撞室出口電壓為10 V，定量分析用離子對(duì)為m/z 487.0→434.3;內(nèi)標(biāo)的去簇電壓為70 V，碰撞電壓為18 V，入口電壓為10 V，碰撞室出口電壓為10 V，定量分析用離子對(duì)為m/z 271.1→172.0。

2.2 溶液的制備

精密稱取LGT-6對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品各適量，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇0.2 mL使其溶解，再以PBS定容，搖勻，制成濃度均為100 μmol/L的LGT-6、內(nèi)標(biāo)貯備液。

2.3 大鼠血漿的采集

取SD大鼠12只，雌雄各半，于股動(dòng)脈取血2 mL，置于裝有肝素鈉溶液的EP管中，于4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，分離上層血漿，于-80 ℃冷凍貯存，備用。

2.4 樣品處理

取透析內(nèi)液（血漿樣品）與透析外液（PBS）各100 μL，分別置于EP管中，依次加入甲醇600 μL、內(nèi)標(biāo)貯備液100 μL，渦旋混勻后，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，于37 ℃下用氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)铀?00 μL、乙酸乙酯600 μL復(fù)溶，渦旋混勻，靜置分層后，取乙酸乙酯層，于37 ℃下用氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)儆眉状?00 μL復(fù)溶，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 分別取空白透析外液（PBS）和大鼠、猴、人空白血漿各適量，以甲醇替代內(nèi)標(biāo)，其余按“2.4”項(xiàng)下方法處理，制成空白透析外液樣品和大鼠、猴、人的空白血漿樣品（下同）。取LGT-6對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品各適量，以甲醇溶解稀釋制成LGT-6濃度為10 mmol/L、內(nèi)標(biāo)濃度為1 mmol/L的混合對(duì)照品溶液。將LGT-6濃度為300 nmol/L的PBS與人、猴和大鼠的空白血漿平衡48 h后，取透析內(nèi)液按“2.4”項(xiàng)下方法處理，制成血漿樣品。將空白透析外液樣品、空白血漿樣品、混合對(duì)照品溶液、血漿樣品按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2（因?yàn)槿?、猴與大鼠的空白血漿樣品、血漿樣品色譜圖基本一致，所以省略人和猴的血漿樣品色譜圖，以大鼠血漿樣品的色譜圖作為代表）。由圖2可見，LGT-6和內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰形良好，保留時(shí)間分別約為7.5、8.7 min，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和空白透析外液均不干擾LGT-6的分析測(cè)定，表明方法專屬性良好。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取“2.2”項(xiàng)下LGT-6貯備液，用PBS逐級(jí)稀釋制成濃度分別為18 000、6 000、2 000、600、200、60、20 nmol/L的系列樣品溶液。取上述系列樣品溶液各50 μL，分別加入大鼠、猴和人空白血漿950 μL，渦旋混勻。各取上述血漿樣品100 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以LGT-6的濃度為橫坐標(biāo)（c，nmol/L）、LGT-6與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），采用加權(quán)最小二乘法（加權(quán)系數(shù)為1/c）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，LGT-6在大鼠、猴、人血漿中的回歸方程分別為y=1.28c+0.36（R 2=0.998 9）、y=1.09c+0.27（R 2=0.999 1）、y=1.32c+0.45（R 2=0.998 5），其檢測(cè)濃度的線性范圍均為1～900 nmol/L，定量下限均為1 nmol/L。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備LGT-6定量下限濃度（1 nmol/L）和低、中、高濃度（3、50、720 nmol/L）的質(zhì)控樣品各6份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)測(cè)定5 d，考察日間精密度。以實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的百分比考察準(zhǔn)確度。結(jié)果，LGT-6定量下限濃度和低、中、高濃度質(zhì)控樣品在大鼠、猴和人血漿中的日內(nèi)、日間RSD均小于10%，準(zhǔn)確度為90.46%～105.77%，符合生物樣品定量分析方法的相關(guān)要求[16]，詳見表1。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 取大鼠、猴、人空白血漿各適量，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，加入相應(yīng)濃度的LGT-6樣品溶液100 μL，制成LGT-6低、中、高濃度（3、50、720 nmol/L）的質(zhì)控樣品各6份，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積（A1）。以甲醇為溶劑，配制與前者濃度對(duì)應(yīng)的LGT-6對(duì)照品溶液各6份，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積（A2），按如下公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)：基質(zhì)效應(yīng)=A1/A2×100%。結(jié)果，LGT-6低、中、高濃度質(zhì)控樣品的基質(zhì)效應(yīng)均符合生物樣品定量分析方法的相關(guān)要求[16]，詳見表2。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備LGT-6低、中、高濃度（3、50、720 nmol/L）的質(zhì)控樣品，分別置于4 ℃下冷藏12 h、室溫（約20 ℃）下靜置12 h、反復(fù)凍融（4～37 ℃）3次后，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。每樣品平行6份，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果，各質(zhì)控樣品中LGT-6含量的RSD均小于10%，表明其在上述條件下穩(wěn)定性良好，詳見表3。

2.5.6 稀釋可靠性考察 按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備LGT-6濃度為3 600 nmol/L的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，用PBS稀釋5倍至質(zhì)控樣品濃度（720 nmol/L），每濃度平行6份。按“2.4”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算LGT-6濃度，再計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果，準(zhǔn)確度為103.77%～105.27%，精密度RSD均小于10%，表明用PBS稀釋血漿樣品不影響血漿樣品的定量準(zhǔn)確性，詳見表4。

2.6 平衡滲透實(shí)驗(yàn)

2.6.1 透析袋吸附能力的測(cè)定 透析袋先用水浸泡1 h，再用20%乙醇浸泡20 min，結(jié)束后用水沖洗3次，于4 ℃保存，備用（透析袋處理方法下同）。參照文獻(xiàn)[17]方法確證透析袋的吸附能力：取空白血漿1.0 mL（V1）加入透析袋內(nèi)，放入LGT-6濃度分別為3、30、300、3 000 nmol/L（c1）的PBS溶液（配制方法同“2.5.2”項(xiàng)）30 mL（V2）中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中平衡，每濃度平行6份。取上述透析外液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算藥物濃度（c2），并按如下公式計(jì)算吸附率：吸附率（%）=[c1×V1-c2×（V1+V2）]/（c1×V2）×100%。結(jié)果，透析袋對(duì)LGT-6的吸附率均不超過4%，表明該透析袋對(duì)LGT-6只有微量吸附，不會(huì)對(duì)測(cè)試造成顯著影響[16]，詳見表5。

2.6.2 平衡時(shí)間的確定 將處理后的透析袋一端結(jié)扎，朝袋中加入空白血漿1 mL，排除空氣后將另一端也結(jié)扎。將透析袋懸浮于裝有PBS溶液（其中LGT-6的濃度分別為3、30、300、3 000 nmol/L）30 mL 的廣口瓶中，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行透析，分別于4、8、12、24、48、72 h時(shí)取透析內(nèi)液和透析外液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算其中LGT-6濃度，并按如下公式計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率：蛋白結(jié)合率（%）=（Dt-Df）/Dt×100%（式中，Dt為透析內(nèi)液的藥物濃度;Df為透析外液的藥物濃度，即游離藥物濃度）。結(jié)果，平衡48 h時(shí)，LGT-6的血漿蛋白結(jié)合率與72 h時(shí)比較無明顯差異，說明48 h時(shí)透析已經(jīng)達(dá)到平衡狀態(tài)，因此將平衡時(shí)間定為48 h，詳見表6。

2.6.3 藥物血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定 將處理后的透析袋一端結(jié)扎，朝袋中精密加入空白血漿1 mL，固定透析袋的另一端，使透析袋保持垂直且內(nèi)有一定的空氣，再將透析袋懸浮于裝有PBS（其中LGT-6的濃度分別為3、30、300、3 000 nmol/L） 10 mL的平底玻璃管中，調(diào)節(jié)透析袋內(nèi)、外液面，使兩者保持在同一平面上，并且確保透析袋不接觸管壁，最后將管口密封，在4 ℃下平衡靜置48 h。在透析結(jié)束后，精密量取透析內(nèi)液和透析外液（先用10%的高氯酸溶液檢測(cè)是否有蛋白外漏，有外漏的樣品舍棄）各100 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算其中LGT-6濃度。同時(shí)，考慮到LGT-6濃度為3 000 nmol/L的樣品濃度超出方法學(xué)線性濃度范圍，取3 000 nmol/L的樣品時(shí)，先用空白血漿或PBS稀釋5倍后，再同法處理、分析。各樣品中LGT-6蛋白結(jié)合率的計(jì)算同“2.6.2”項(xiàng)，結(jié)果見表7。

使用GraphPad Prism v 7.0軟件，對(duì)相同濃度下不同種屬和相同種屬下不同濃度LGT-6的血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果，在相同濃度下，LGT-6在大鼠、猴、人血漿中的蛋白結(jié)合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在相同種屬血漿中，不同濃度LGT-6的血漿蛋白結(jié)合率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且有隨著藥物濃度的升高而降低的趨勢(shì)。

3 討論

藥物由于受各種復(fù)雜多變的環(huán)境（例如酶、酸堿等條件）所影響，其血漿蛋白結(jié)合率會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致藥物在體內(nèi)的分布及消除發(fā)生改變，隨之影響靶組織中游離藥物的濃度，從而使藥物藥效及毒性發(fā)生變化[18]。因此，在新藥的開發(fā)階段進(jìn)行血漿蛋白結(jié)合率的研究具有重要意義。目前，用于測(cè)定藥物血漿蛋白結(jié)合率的方法有很多，包括平衡透析法、超濾法、凝膠過濾法、超速離心法和白蛋白微球測(cè)定法等，其中平衡透析法是較為經(jīng)典、常用的方法[19]。該法操作簡(jiǎn)單、吸附作用較小、干擾因素較少[19]，因此本研究選擇了平衡透析法。

本研究采用平衡透析法結(jié)合UPLC-MS/MS法測(cè)定4種不同濃度LGT-6在大鼠、猴和人血漿中的蛋白結(jié)合率。結(jié)果顯示，在相同濃度下，LGT-6在大鼠、猴和人血漿中的蛋白結(jié)合率沒有明顯差異，表明LGT-6與上述血漿蛋白的結(jié)合沒有明顯的種屬差異。在相同種屬血漿中，LGT-6與血漿蛋白的結(jié)合有隨濃度升高而降低的趨勢(shì)。其中，在低濃度時(shí)，其血漿蛋白結(jié)合率較高，表明低濃度LGT-6與DPP-4的結(jié)合呈現(xiàn)高親和性;隨著LGT-6濃度的升高，LGT-6與DPP-4的結(jié)合逐漸達(dá)到飽和，血漿中游離的LGT-6濃度隨著藥物濃度的增加而進(jìn)一步增加，導(dǎo)致其在各種屬血漿中的蛋白結(jié)合率有所下降。此外，由于LGT-6在低濃度下有很強(qiáng)的血漿蛋白結(jié)合能力，因此，筆者在接下來的研究中需選擇在臨床有可能聯(lián)合應(yīng)用的高血漿蛋白結(jié)合率藥物進(jìn)行體外藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，以考察其對(duì)LGT-6蛋白結(jié)合率的影響，保證臨床用藥安全。

綜上所述，本研究成功建立了測(cè)定LGT-6血漿蛋白結(jié)合率的方法。在相同的濃度下，LGT-6在大鼠、猴、人血漿中的蛋白結(jié)合率沒有明顯的種屬差異，但有明顯的濃度依賴趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] GUARIGUATA L，WHITING D R，HAMBLETON I，et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035[J]. Diabetes Res Clin Pract，2014，103（2）：137-149.

[ 2 ] TAHRANI A A，BAILEY C J，DEL P S，et al. Management of type 2 diabetes：new and future developments in treatment[J]. Lancet，2011，378（9786）：182-197.

[ 3 ] REUSCH J E，MANSON J E，JOANN E M. Management of type 2 diabetes in 2017：getting to goal[J]. JAMA，2017，317（10）：1015-1016.

[ 4 ] DEACON C F，LEBOVITZ H E. Comparative review of dipeptidyl peptidase-4 inhibitors and sulphonylureas[J]. Diabetes Obes Metab，2016，18（4）：333-347.

[ 5 ] ANTZA C，NIRANTHARAKUMAR K，DOUNDOULAKIS I. The development of an oral GLP-1 receptor agonist for the management of type 2 diabetes：evidence to date[J].Drug Des Devel Ther，2019，22（13）：2985-2996.

[ 6 ] KELLY M S，LEWIS J，HUNTSBERRY A M，et al. Efficacy and renal outcomes of SGLT2 inhibitors in patients with type 2 diabetes and chronic kidney disease[J]. Postgrad Med，2019，131（1）：31-42.

[ 7 ] SINGH M，ANOOOP K. Risks associated with SGLT2 inhibitors：an overview[J]. Curr Drug Saf，2018，13（2）：84- 91.

[ 8 ] LI N，WANG L J，JIANG B，et al. Recent progress of the development of dipeptidyl peptidase-4 inhibitors for the treatment of type 2 diabetes mellitus[J]. Eur J Med Chem，2018，151：145-157.

[ 9 ] SUZUKI K，HASEGAW K，WATANABE M. Efficacy and patient satisfaction of dipeptidyl peptidase-4 inhibitor after switching from once-daily DPP-4 inhibitor to once- weekly regimen[J]. J Clin Med Res，2018，10（8）：641- 647.

[10] STOIMENIS D，KARAGIANNIS T，KATSOULA A，et al.Once-weekly dipeptidyl peptidase-4 inhibitors for type 2 diabetes：a systematic review and meta-analysis[J]. Expert Opin Pharmacother，2017，18（9）：843-851.

[11] BURNESS C B. Omarigliptin：first global approval[J].Drugs，2015，75（16）：1947-1952.

[12] MCKEAGE K. Trelagliptin：first global approval[J].Drugs，2015，75（10）：1161-1164.

[13] 廖偉科，湯磊，鄭萍，等.黃嘌呤類化合物及藥物組合物和應(yīng)用，中國(guó)：ZL201810134311.5[P]. 2020-01-17.

[14] 張倫會(huì)，曾敏，杜美容，等.抗腫瘤新化合物L(fēng)S-177在不同種屬中血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定[J].中國(guó)新藥雜志，2019，28（2）：221-228.

[15] 陳茂林，周世文.超濾法結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定人血漿中伏立康唑蛋白結(jié)合率[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017，37（8）：727-731.

[16] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：466-472.

[17] 鞏泉泉，劉萍，徐華雷，等.去鐵酮大鼠血漿蛋白結(jié)合率的實(shí)驗(yàn)研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，47（12）：130-132.

[18] KRATOCHWIL N A，HUBER W，M?LLER F，et al. Predicting plasma protein binding of drugs：revisited[J]. Curr Opin Drug Disc，2004，7（4）：507-512.

[19] 馬智宇.新劑型藥物血漿中游離藥物濃度研究方法概述[J].上海醫(yī)藥，2019，40（7）：74-77.

（收稿日期：2021-02-04 修回日期：2021-05-26）

（編輯：鄒麗娟）