中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酶9在不同時(shí)期COPD患者外周血中的表達(dá)變化及意義

李 果， 陳小兵， 李 剛， 梁曉彤， 陶 維， 陳紹平

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見(jiàn)的、可以預(yù)防和治療的疾病，其特征是持續(xù)存在的呼吸系統(tǒng)癥狀和氣流受限，通常與顯著暴露于毒性顆粒和氣體所致的氣道和(或)肺泡異常有關(guān)[1]。COPD在全世界有著較高的患病率和病死率，所造成的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)十分沉重[2]。雖然肺功能檢查對(duì)于COPD的診斷和病情評(píng)估意義重大，但對(duì)疾病炎癥程度、病情進(jìn)展和預(yù)后判斷價(jià)值有限。因此，尋找獲取簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)和具有疾病特異性的生物標(biāo)志物，則可能揭示COPD病理特點(diǎn)、氣道炎癥類(lèi)型和程度，可以盡早預(yù)警疾病，從而達(dá)到早期干預(yù)并改善預(yù)后的目的[3]。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)具有共同的中性粒細(xì)胞來(lái)源。有研究[4]發(fā)現(xiàn)在COPD急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)患者血清中，二者水平顯著升高，且與吸煙指數(shù)有關(guān)，提示血清NGAL和MMP-9水平變化可以預(yù)警COPD的急性加重。本研究通過(guò)檢測(cè)NGAL、MMP-9基因在不同時(shí)期COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平并分析其臨床意義，從而探討NGAL和MMP-9作為COPD生物標(biāo)志物的可能性。

1 資料與方法

1.1一般資料 前瞻性選取2016年11月至2017年7月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科門(mén)診和住院部就診的COPD患者為研究對(duì)象。其中AECOPD患者25例(AECOPD組)，男18例，女7例，年齡50～86(72.08±8.32)歲；穩(wěn)定期COPD(stable chronic obstructive pulmonary disease,SCOPD)患者80例(SCOPD組)，男50例，女30例，年齡50～85(68.16±8.23)歲。并根據(jù)患者上一年的急性加重次數(shù)(或住院次數(shù))將SCOPD組分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組。其中，上一年急性加重0～1次(或者未住院)為低風(fēng)險(xiǎn)組，共39例；上一年急性加重≥2次(或住院≥1次)為高風(fēng)險(xiǎn)組，共41例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》[5]診斷COPD。急性加重期定義為COPD患者呼吸系統(tǒng)癥狀急性惡化[如呼吸困難加重、咳嗽加劇、痰量增多和(或)呈膿性痰]，導(dǎo)致需要額外的治療；穩(wěn)定期定義為COPD患者呼吸系統(tǒng)癥狀穩(wěn)定或輕微，病情基本恢復(fù)到急性加重之前的狀態(tài)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肺結(jié)核、支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、肺癌、冠心病、糖尿病、肝功能不全和腎功能不全中的任意一種疾病。選取同時(shí)期在健康體檢中心參加體檢者40名(對(duì)照組)，男25名，女15名，年齡48～84(63.70±10.18)歲。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：胸部影像學(xué)、肺功能和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查無(wú)明顯異常，無(wú)慢性呼吸系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病以及結(jié)締組織疾病等病史。本研究已獲得川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。除對(duì)照組吸煙指數(shù)(smoking index,SI)明顯低于AECOPD組和SCOPD組外(P<0.05)，三組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(Body Mass Index,BMI)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組一般資料比較

1.2實(shí)驗(yàn)方法 收集所有受試者身高、體重、吸煙史、第一秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(forced expiratory volume in one second/prediction,FEV1%pred)及吸煙指數(shù)等一般信息。住院患者于入院第二日清晨、門(mén)診患者和健康體檢者于就診當(dāng)日空腹采集外周靜脈血標(biāo)本。于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科和門(mén)診部肺功能室完成血常規(guī)和肺功能檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程質(zhì)控合格。根據(jù)Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中人NGAL、MMP-9及內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的基因序列設(shè)計(jì)并合成聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物(上海生工生物工程有限公司)。引物序列見(jiàn)表2。用人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)從外周血中分離、提取單個(gè)核細(xì)胞，用Trizol(TaKaRa公司,日本)提取總RNA，選取純度合格的RNA(OD260/OD280=1.8～2.0)，并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)說(shuō)明書(shū)分兩步合成cDNA，最后于QuantStudioTM12K Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司,美國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantiative polymerase chain reaction,RT-qPCR)[6]。總反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：(1)預(yù)變性95 ℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)；(2)PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s 60 ℃ 34 s 40個(gè)循環(huán)。本研究順利得到良好的目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線。每個(gè)樣品的復(fù)孔取其平均值，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。目的基因相對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)量用2-ΔCt表示。

表2 人NGAL、MMP-9及β-actin基因RT-qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1三組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 AECOPD組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量高于SCOPD組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，SCOPD組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 三組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較[M(Q1,Q3)，2-ΔCt]

2.2SCOPD組內(nèi)兩亞組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 高風(fēng)險(xiǎn)組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量均高于低風(fēng)險(xiǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 SCOPD組內(nèi)兩亞組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較[M(Q1,Q3)，2-ΔCt]

2.3AECOPD組和SCOPD組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量間的相關(guān)性 AECOPD組和SCOPD組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量間均呈顯著正相關(guān)(r=0.831,P<0.01;r=0.764,P<0.01)。

2.4SCOPD組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量與FEV1%pred的相關(guān)性 SCOPD組NGAL mRNA、MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量與FEV1%pred均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.416,P<0.01;r=-0.312,P<0.05)。見(jiàn)表5。

2.5SCOPD組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量與其他臨床指標(biāo)間的相關(guān)性 SCOPD組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量與外周血白細(xì)胞(white blood cells,WBC)總數(shù)、中性粒細(xì)胞(neutrophils,NEUT)總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比(percentage of neutrophils,NEUT%)均呈正相關(guān)，相關(guān)性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與BMI、SI、第一秒用力呼氣容積/用力肺活量(forced expiratory volume in one second/forced vital capacity,FEV1/FVC)等臨床指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān)性(P均>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 SCOPD組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量與臨床指標(biāo)間的相關(guān)性

3 討論

3.1明確病因和發(fā)病機(jī)制是預(yù)防和早期診治COPD的關(guān)鍵。目前對(duì)于COPD發(fā)病機(jī)制的研究仍然主要集中于炎癥反應(yīng)、蛋白酶/抗蛋白酶失衡和氧化應(yīng)激這三個(gè)方面。中性粒細(xì)胞的活化和聚集作為這三種機(jī)制相互聯(lián)系和相互作用的中間環(huán)節(jié)，在COPD發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[7]。NGAL屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白超家族的一員，主要由中性粒細(xì)胞分泌，通常在組織損傷尤其腎臟損傷后合成增加，目前認(rèn)為血清NGAL水平有望作為急性腎損傷的生物標(biāo)志物[8]。既往的一些研究表明，在吸煙者肺泡灌洗液[9]、COPD患者誘導(dǎo)痰[10]以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)在損傷性通氣策略組的肺組織[11]中，NGAL表達(dá)水平明顯升高。MMP-9是一種金屬蛋白酶，由活化的中性粒細(xì)胞分泌，具有降解基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)的功能。已有研究證實(shí)，NGAL在與MMP-9共價(jià)結(jié)合后，能抑制后者的水解及失活，從而延長(zhǎng)其在膠原降解方面的作用[12]，導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生。對(duì)NGAL和MMP-9基因表達(dá)水平進(jìn)行聯(lián)合測(cè)定，有助于深入了解二者的相互關(guān)系及其在COPD發(fā)病過(guò)程中所起的作用，對(duì)于明確COPD的發(fā)病機(jī)制有著重要指導(dǎo)意義。

3.2本研究顯示，AECOPD組NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量高于SCOPD組和對(duì)照組，且SCOPD組高于對(duì)照組(P均<0.01)。說(shuō)明與對(duì)照組相比，COPD患者NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量升高；在COPD急性加重階段，NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量升高則更為明顯。這與Eagan等[13]和Wang等[14]在COPD患者血漿中檢測(cè)NGAL蛋白變化水平，以及許小毛等[15]在COPD患者中檢測(cè)MMP-9基因和蛋白表達(dá)水平的隊(duì)列研究結(jié)論一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，SCOPD組內(nèi)綜合評(píng)估為高風(fēng)險(xiǎn)組的患者NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量均較低風(fēng)險(xiǎn)組患者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。說(shuō)明NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因表達(dá)水平會(huì)隨著COPD急性加重風(fēng)險(xiǎn)和頻率的增加而上升。戈艷蕾等[16]的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，有認(rèn)知功能障礙的COPD患者血漿NGAL水平升高(P<0.01)。于冰和孫艷華[17]報(bào)道COPD患者血漿NGAL水平越高，其認(rèn)知功能障礙程度越重。在張子洲[18]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，COPD大鼠血清及支氣管肺泡灌洗液中MMP-9的水平均顯著高于正常對(duì)照組。翟梅等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)，COPD合并重度和中度肺動(dòng)脈高壓組患者血清MMP-9水平顯著高于單純COPD組患者。上述研究結(jié)果表明，NGAL和MMP-9的基因和蛋白水平會(huì)隨著COPD病情加重而升高。結(jié)合SCOPD組患者的肺功能檢測(cè)結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量與肺功能FEV1%pred呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因表達(dá)水平可以反映COPD病情的嚴(yán)重程度，提示NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量或可用來(lái)彌補(bǔ)肺功能檢查對(duì)于AECOPD患者因不能配合和不能反映真實(shí)肺功能水平的缺陷。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量與外周WBC、NEUT和NEUT%均呈正相關(guān)，考慮與NGAL和MMP-9的中性粒細(xì)胞來(lái)源有關(guān)。

3.3有研究[20]報(bào)道COPD可以通過(guò)核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)等信號(hào)通路產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等炎癥介質(zhì)，而TNF-α和IL-1β又都能誘導(dǎo)NGAL的表達(dá)，后者可能具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、調(diào)控炎癥反應(yīng)和抵御氧化應(yīng)激等生物學(xué)功能。再結(jié)合NGAL和MMP-9之間能形成特異性的復(fù)合物，促進(jìn)膠原降解，從而影響肺氣腫的進(jìn)程。故認(rèn)為NGAL和MMP-9很有可能位于同一信號(hào)通路，并相互作用共同促進(jìn)COPD的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是AECOPD組還是SCOPD組，NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量間均呈顯著正相關(guān)，這再一次印證NGAL和MMP-9的共同中性粒細(xì)胞來(lái)源和其生物學(xué)功能關(guān)聯(lián)的緊密性，同時(shí)也對(duì)COPD發(fā)病機(jī)制中的蛋白酶/抗蛋白酶失衡學(xué)說(shuō)提供了佐證。課題組前期的配對(duì)研究結(jié)果表明AECOPD患者NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量會(huì)因并發(fā)呼吸衰竭而增加，在治療后隨著病情的改善而下降[6]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著COPD患者病情的急性加重和上一年的急性加重次數(shù)(或住院次數(shù))增加，NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相對(duì)表達(dá)量也隨之升高。提示NGAL和MMP-9可以作為COPD急性加重的生物標(biāo)志物，其基因相對(duì)表達(dá)量可以反映COPD病情嚴(yán)重程度，評(píng)估患者對(duì)治療的反應(yīng)以及預(yù)測(cè)再發(fā)急性加重的風(fēng)險(xiǎn)。

3.4本研究的局限性在于僅進(jìn)行了基因表達(dá)水平的研究，而未能與蛋白表達(dá)的研究相結(jié)合；且AECOPD患者樣本量偏少，可能存在選擇偏倚，在未來(lái)的研究中應(yīng)注意擴(kuò)大樣本量和探究基因與蛋白表達(dá)的一致性問(wèn)題。關(guān)于NGAL和MMP-9在COPD病程中的變化及意義尚需更多大規(guī)模、多中心的研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，NGAL和MMP-9基因可能相互作用共同促進(jìn)了COPD的發(fā)生與發(fā)展，NGAL和MMP-9在未來(lái)可能成為COPD的生物標(biāo)志物，抑制NGAL和MMP-9的過(guò)表達(dá)可能為COPD的防治提供新的方法學(xué)參考。