中藥復(fù)合小肽對(duì)于肉雞小腸形態(tài)、盲腸腸道菌群和生產(chǎn)性能的影響

崔宇擎，盧春雨，劉依山，靳國(guó)忠，郭藝偉，史萬(wàn)玉,2*，包永占,2*，張曉東

( 1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000;2.河北省中獸藥工程技術(shù)研究中心,河北 保定 071000；3.河北肽豐生物科技有限公司，河北 邯鄲 056000)

過(guò)去10年里，人們對(duì)功能性食品的興趣不斷增長(zhǎng)，詳細(xì)介紹食品衍生的生物活性肽有益作用的知識(shí)也越來(lái)越多[1]。從植物和動(dòng)物蛋白中都發(fā)現(xiàn)了生物活性肽，據(jù)研究表明，生物活性肽具有廣泛的藥理活性作用，如抗菌活性、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、降血壓降血脂、免疫調(diào)節(jié)作用以及腸道調(diào)節(jié)作用等[2]。已有研究報(bào)道，攝入大豆肽比攝入蛋白質(zhì)或氨基酸混合物更容易被機(jī)體吸收，并能促進(jìn)雞嗉囊、空腸、盲腸與直腸內(nèi)乳酸菌的增殖，抑制大腸桿菌和需氧菌增殖[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適度比例黃芪，可通過(guò)影響乳酸菌和大腸桿菌的豐度，提高斷乳仔豬生長(zhǎng)性能[4]。劉衛(wèi)東等[5]試驗(yàn)表明，在肉雞日糧中適當(dāng)添加復(fù)合小肽制劑，有利于雛雞免疫器官的發(fā)育，降低死亡率和發(fā)病率。李巨民等[6]試驗(yàn)表明，在日糧中添加中藥復(fù)合小肽能提高飼料消化利用率，防治高血脂癥和炎癥的發(fā)生。

腸道微生物群是其宿主不可分割的組成部分。微生物群在宿主的健康上起著關(guān)鍵作用，包括腸上皮細(xì)胞的增殖、對(duì)病原體的防御、次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和復(fù)雜碳水化合物的消化。這個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)可以執(zhí)行許多代謝功能，這些功能會(huì)隨著腸道內(nèi)微生物組成的變化而變化[7]。腸道微生物是人類和動(dòng)物健康的重要指標(biāo)。本研究探討了在肉雞飼料中添加不同劑量中藥復(fù)合小肽對(duì)肉雞腸道發(fā)育的影響。通過(guò)高通量測(cè)序分析探究中藥復(fù)合小肽對(duì)肉雞腸道菌群的影響，進(jìn)而促進(jìn)中藥復(fù)合小肽在肉雞健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料中藥復(fù)合小肽成分為大豆肽64.8%、小麥胚芽粉25.0%、黃芪酶解物10.0%、維生素C 0.2%，由河北肽豐生物科技有限公司提供；酶制劑為50 000 U/g木聚糖酶，由河北肽豐生物科技有限公司提供；微生態(tài)制劑為枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌，由河北肽豐生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組選用1日齡健康A(chǔ)A肉仔雞60只，由河北大午有限公司提供。隨機(jī)分為6組，每組10只。MC組為空白對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；MD、MZ、MG組，分別在基礎(chǔ)日糧中添加低(250 g/t)、中(500 g/t)、高(750 g/t)劑量的中藥復(fù)合小肽；MS組為微生態(tài)制劑組(100 g/t微生態(tài)制劑)；MM組為酶制劑組(100 g/t酶制劑)。試驗(yàn)期為42 d。

1.3 樣品采集肉雞42日齡時(shí)，處死后剖檢，取十二指腸、空腸和回腸，生理鹽水沖洗后固定于10%福爾馬林溶液中。收集盲腸內(nèi)容物，置于凍存管內(nèi)，立即放置于液氮中，用于腸道微生物16S rRNA測(cè)序。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1腸絨毛形態(tài)觀察及測(cè)量 各組肉雞解剖后分離腸道，取十二指腸中段、空腸中段和回腸中段各1 cm，用生理鹽水沖洗干凈，放置于10%福爾馬林溶液中固定，按常規(guī)方法制備石蠟切片，經(jīng)H&E染色后，光鏡下觀察石蠟切片。使用Image J軟件對(duì)腸絨毛高度和隱窩深度進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2腸道微生物多樣性檢測(cè) 使用DNeasy PowerSoil試劑盒(QIAGEN,Inc.,Netherlands)提取盲腸內(nèi)容物中總微生物基因組DNA樣本，用正向引物515F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物907R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Illlumina MiSeq平臺(tái)和MiSeq試劑Kit v3進(jìn)行測(cè)序。獲得的序列通過(guò) Mothur軟件平臺(tái)，剔除低質(zhì)量DNA序列后,計(jì)算序列之間的距離。每一個(gè)運(yùn)算分類單元OTU代表序列相似度大于97%的DNA序列，對(duì)各試驗(yàn)處理組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行菌群多樣性分析和聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 小腸組織形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1十二指腸組織形態(tài)學(xué)觀察 結(jié)果見(jiàn)圖1，十二指腸絨毛為寬的葉片狀，與MC、MS和MM組相比，MZ、MG組十二指腸的絨毛長(zhǎng)度明顯變長(zhǎng)。

A.MC組；B.MS組；C.MM組；D.MD組；E.MZ組； F.MG組

2.1.2空腸組織形態(tài)學(xué)觀察 結(jié)果見(jiàn)圖2，空腸絨毛以指狀為主，與MC、MS和MM組相比，MZ、MG組空腸絨毛長(zhǎng)度明顯增加。

2.1.3回腸組織形態(tài)學(xué)觀察 結(jié)果見(jiàn)圖3，回腸絨毛為短錐狀，排列疏松，與MC、MS和MM組相比，試驗(yàn)組眼觀均無(wú)明顯變化。

A.MC組；B.MS組；C.MM組；D.MD組；E.MZ組； F.MG組。

2.2 各組肉雞小腸絨毛長(zhǎng)度和絨毛與隱窩深度的比值(V/C)

2.2.1各組肉雞小腸絨毛長(zhǎng)度 結(jié)果見(jiàn)圖4， MD組的十二指腸絨毛長(zhǎng)度顯著高于MS和MM組(P<0.05)；MZ組的十二指腸絨毛長(zhǎng)度顯著高于MM組(P<0.05)，空腸絨毛長(zhǎng)度顯著高于MC組(P<0.05)；MG組的十二指腸絨毛長(zhǎng)度顯著高于MC、MS和MM組(P<0.05)。各組回腸絨毛長(zhǎng)度無(wú)顯著性差異。

注：相同小寫(xiě)字母表示無(wú)顯著性差異(P>0.05),不同小寫(xiě)字母表示顯著性差異(P<0.05)，下同

2.2.2各組肉雞絨毛與隱窩深度的比值(V/C) 結(jié)果見(jiàn)圖5，MZ、MG組的十二指腸V/R顯著高于MC、MS和MM組(P<0.05)，MZ和MG組的空腸V/C顯著高于MC和MS組(P<0.05)，各組回腸V/C無(wú)顯著性差異。

圖5 中藥復(fù)合小肽對(duì)于肉雞絨毛與隱窩深度比值的影響

2.3 盲腸菌群OTU分析結(jié)果見(jiàn)圖6，MG組的屬水平OTU顯著高于MC組(P<0.05)，其他組屬水平OTU無(wú)顯著性差異。

圖6 屬水平OTU分析

2.4 盲腸菌群Alpha多樣性分析如圖7所示，物種積累曲線隨著測(cè)試樣本的增加逐漸變得平緩，說(shuō)明樣本量已經(jīng)足以反應(yīng)群落的豐富度。豐度等級(jí)曲線的平緩程度反應(yīng)群落的均勻度，盲腸腸道菌群的豐度等級(jí)曲線比較平緩，說(shuō)明群落的均勻度比較高。

A.物種積累曲線；B.豐度等級(jí)曲線

2.5 盲腸菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)圖8，門水平上，有2個(gè)菌門占比90%以上，分別是厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。其中最多的是擬桿菌門(Bacteroidetes)，其次是厚壁菌門(Firmicutes)。MD組的盲腸擬桿菌門(Bacteroidetes)含量顯著高于MC和MS組(P<0.05)。屬水平上，MD組的盲腸糞桿菌屬(Faecalibacterium)含量顯著低于MC組(P<0.05);MD、MZ、MG、MS和MM組的盲腸乳酸桿菌屬(Lactobacillus)含量高于MC組(P>0.05)。

A.門水平分類學(xué)組成分析;B.屬水平分類學(xué)組成分析;橫坐標(biāo)為該分組方案各樣本/各分組/整體的名稱；縱坐標(biāo)為特定分類水平下各分類單元的相對(duì)豐度

2.6 盲腸菌群Lefse(LDA effect size)分析在MG組中具有豐度差異的微生物類群是β-變形菌門(Betaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)、伯克霍爾德菌目(Burkholderiales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)。在MM組中具有豐度差異的微生物類群是艱難桿菌科(Mogibacteriaceae)，結(jié)果見(jiàn)圖9A。

MG組中具有豐度差異的微生物類群是β-變形菌門(Betaproteobacteria)和黃桿菌綱(Flavobacteriia)。β-變形菌門(Betaproteobacteria)向外映射到伯克霍爾德菌目(Burkholderiales)； 黃桿菌綱(Flavobacteriia)向外映射到黃桿菌目(Flavobacteriales)，最后到黃桿菌科(Flavobacteriaceae)，結(jié)果見(jiàn)圖9B。

A.基于LDA值的分布直方圖；B.分類學(xué)分支圖;LDA臨界值為2

2.7 中藥復(fù)合小肽對(duì)于肉雞生產(chǎn)性能的影響

2.7.1中藥復(fù)合小肽對(duì)于肉雞體質(zhì)量的影響 21日齡各組體質(zhì)量無(wú)顯著性差異。42日齡MD組的體質(zhì)量顯著高于MC和MS組(P<0.05)；MZ和MG組的體質(zhì)量顯著高于MC、MM和MS組(P<0.05)(圖10)。

圖10 中藥復(fù)合小肽對(duì)21和42 d肉雞體質(zhì)量的影響

2.7.2中藥復(fù)合小肽對(duì)于肉雞料肉比的影響 0～21日齡,肉雞料肉比隨著CSPCM的添加劑量的上升而減少，添加酶制劑和微生態(tài)制劑也可以降低料肉比。22～42日齡肉雞料肉比隨著CSPCM的添加而大幅減少，添加酶制劑和微生態(tài)制劑也可以降低料肉比(表1)。

表1 中藥復(fù)合小肽對(duì)肉雞料肉比的影響

3 討論

小腸是化學(xué)性消化吸收的主要器官，是蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉、麥芽糖和葡萄糖的主要吸收部位，小腸消化功能的增強(qiáng)將有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充分吸收[8]。小腸作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的重要位置，小腸絨毛高度增加可以提高小腸與腸道內(nèi)容物的接觸面積，從而增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的沉積，對(duì)于提高肉雞的生產(chǎn)性能具有重要意義[9]。隱窩深度反映了隱窩細(xì)胞的増殖率和成熟度，隱窩變淺則分泌功能增強(qiáng)，絨毛上皮細(xì)胞再生能力強(qiáng)，更有利于維持腸道的吸收功能[10]。絨毛高度越高，與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸就越充分，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)沉積的效率就越高[11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與MC組相比，添加CSPCM的MZ、MG組能夠提高十二指腸和空腸的絨毛長(zhǎng)度和V/C值，而MM組和MS組的絨毛長(zhǎng)度和V/C值都無(wú)顯著性提高。可以初步判斷，中、高劑量的CSPCM能夠促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，增強(qiáng)腸道功能，提高肉雞生產(chǎn)性能。

研究表明，肉雞腸道菌群門水平上豐度較高的菌群是擬桿菌門和厚壁菌門(>90%)，其他研究對(duì)雞盲腸菌群的研究結(jié)果類似[12-14]。本試驗(yàn)中門水平豐度最高的是擬桿菌門。已有研究表明，屬水平上，瘤胃球菌、乳桿菌、梭狀芽孢桿菌和擬桿菌屬在雞腸道中豐度在70%以上[12,15]，是主要菌屬。在本試驗(yàn)中豐度最高的是另枝菌屬(Alistipes),然后是糞桿菌屬(Faecalibacterium),其次是乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)，與前人研究結(jié)果不同。在試驗(yàn)中出現(xiàn)這些差異的原因可能主要與飼料成分有關(guān)。已有研究表明，在飼料中添加中藥、酶制劑和微生態(tài)制劑都能夠增加腸道內(nèi)乳酸菌等有益菌的占比[16-18]，本研究對(duì)中藥復(fù)合小肽、酶制劑和微生態(tài)制劑改善腸道菌群的效果進(jìn)行了對(duì)比。發(fā)現(xiàn)在飼料中添加中藥復(fù)合小肽、酶制劑和微生態(tài)制劑能夠提高腸道內(nèi)乳酸桿菌的含量，與飼料轉(zhuǎn)化率值較高的肉雞品系相比，飼料轉(zhuǎn)化率值較低的雞在糞便樣品中顯示出了較高的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)豐度[19]，說(shuō)明在飼料中添加CSPCM、微生態(tài)制劑和酶制劑均能不同程度促進(jìn)肉雞的消化吸收。

Lefse(LDA effect size)用于分析各組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異的生物標(biāo)志物，來(lái)分析組間有顯著性差異的物種。本試驗(yàn)結(jié)果顯示在MG組具有豐度差異的物種是伯克霍爾德菌目(Burkholderiales)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)。伯克霍爾德菌(Burkholderiales)能產(chǎn)生多種具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物如鐵載體(pyochenlin、pyoverdine)和單萜生物堿等[20]，而黃桿菌科(Flavobacteriaceae)可發(fā)酵葡萄糖、果糖和麥芽糖，能夠幫助宿主消化吸收，從而促進(jìn)生長(zhǎng)[21]。

肉雞作為一種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，飼料添加劑對(duì)于生產(chǎn)性能的改善是尤為重要的。隨著在飼料中CSPCM添加劑量的上升，對(duì)于肉雞體質(zhì)量和料肉比的改善越發(fā)明顯，結(jié)合小腸絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度的比值發(fā)現(xiàn)其趨勢(shì)一致，說(shuō)明CSPCM的添加可能是通過(guò)增加絨毛長(zhǎng)度和降低隱窩深度進(jìn)行作用的。CSPCM對(duì)于肉雞生產(chǎn)性能的改善也讓其更具有了實(shí)際應(yīng)用的意義。在飼料中添加中、高劑量的CSPCM可以通過(guò)增加十二指腸和空腸的絨毛長(zhǎng)度、V/C值、盲腸內(nèi)有益菌含量和降低料肉比來(lái)促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)。低劑量的CSPCM可以通過(guò)增加盲腸內(nèi)擬桿菌門菌群豐度來(lái)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收。

綜上所述，在飼料中添加CSPCM能夠改善盲腸菌群。在飼料中添加高劑量CSPCM有利于肉雞小腸發(fā)育從而達(dá)到促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)的效果是最好的，并且其促生長(zhǎng)效果優(yōu)于微生態(tài)制劑和酶制劑。