當(dāng)歸內(nèi)酯對雞新城疫疫苗免疫效價、免疫細胞及相關(guān)因子的影響

張余蓬，鄧華英，李前勇,2*，張德志,2，朱 瑞

(1．西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2．重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 榮昌 402460)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由ND病毒強毒引起禽類的一種急性高度接觸性傳染病，屬于OIE規(guī)定必須報告的疫病和國家農(nóng)業(yè)部規(guī)定的一類動物疫病[1]。多年來，我國一直堅持以免疫預(yù)防為主，不斷完善生物安全體系建設(shè)的防控思路，使本病的感染率總體維持在較低水平。但在我國局部地區(qū)ND污染還比較嚴重，一些雞場免疫接種后抗體效價低或抗體滴度高低不一、離散度較大，難以抵抗野毒侵襲，ND疫情呈現(xiàn)持續(xù)性地方流行或散發(fā)[2-3]。在疫苗免疫為主導(dǎo)的ND防控中，ND滅活疫苗不能有效刺激細胞免疫，弱毒疫苗長期使用可能發(fā)生疫苗毒株基因重組、抗原變異，甚至毒力返強[4]，無疑會增加ND擴散的范圍，加大防控的難度。為此，在常規(guī)疫苗免疫中使用免疫佐劑或免疫增強劑，增強ND疫苗效果、減少抗原的使用量和接種次數(shù)，十分有意義。

禽用疫苗佐劑主要有天然植物提取物、鋁鹽、油乳劑、細胞因子及其他新型佐劑幾類，其中天然植物中提取的某些組分具有免疫調(diào)節(jié)活性強、毒性低、易代謝等優(yōu)勢，格外引人關(guān)注。已有研究證實，黃芪多糖作為ND滅活苗的佐劑可減少抗原使用劑量、增強疫苗免疫水平，疫苗免疫期間飼喂可顯著提高ND弱毒苗的血清抗體水平[5-6]；以0.5～1.0 mg每只肌肉注射板藍根多糖，可顯著提高ND弱毒疫苗的免疫效價[7]，懷牛膝多糖、枸杞多糖、人參皂苷等在ND疫苗免疫中也具有提高抗體效價、延長免疫期作用[8]。但上述報道的天然植物提取物，存在藥材昂貴、大量提取使用困難，或作為佐劑使用制作工藝復(fù)雜，難以實現(xiàn)生產(chǎn)使用。當(dāng)歸內(nèi)酯(α-angelica lactone，α-AL)為當(dāng)歸根提取物，屬于當(dāng)歸揮發(fā)油中的成分，人們已實現(xiàn)對其有機合成、量產(chǎn)[9-10]。有研究資料表明[11-12]，α-AL在小鼠體內(nèi)外試驗均有增強免疫功能的作用，但尚未見該物質(zhì)對雞ND疫苗免疫作用報道。本試驗開展了α-AL對雞ND疫苗免疫作用效果及部分機制的研究，以期為該物質(zhì)作為雞ND疫苗免疫佐劑或增強劑的開發(fā)應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料健康青腳麻雞，購于榮昌區(qū)某家雞養(yǎng)殖場。當(dāng)歸內(nèi)酯(α-AL)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、1%臺盼藍染色液等均購自上海嶸泰醫(yī)藥科技有限公司，新城疫Ⅳ系(LaSota株)弱毒苗購自廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗等購自Gibco公司。二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，雞新城疫血凝抑制試驗陽性血清購自哈爾濱國生生物科技有限公司，雞淋巴細胞分離液、雞T淋巴細胞CD4+酶聯(lián)免疫分析試劑盒、雞T淋巴細胞CD8+酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海素爾生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)、實時熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa。

1.2 分組與處理第1批240只7日齡青腳麻雞隨機分為6組，Ⅰ組為空白，Ⅱ組為疫苗對照，Ⅱ～Ⅵ組在14，28日齡接種ND疫苗各1劑，Ⅲ～Ⅵ組于接種前連續(xù)皮下注射α-AL 3次，劑量分別為10，20，40，80 mg/(kg·d-1)，Ⅰ、Ⅱ組注射等量生理鹽水。各組于免疫前和免疫后7，14，21，28，35 d采心血，分離血清，檢測ND抗體效價；剖取免疫器官，測定免疫器官指數(shù)。第2批120只7日齡青腳麻雞隨機分為4組，Ⅶ組為空白，Ⅷ組為疫苗對照，Ⅷ～Ⅹ組于14，28日齡接種ND疫苗，Ⅸ組在免疫前連續(xù)3 d 皮下注射α-AL最佳劑量，Ⅹ組在免疫前連續(xù)5 d 注射α-AL最佳劑量，每日1次，Ⅶ、Ⅷ組注射等量生理鹽水。各組于免疫前和免疫后7，14，21，28，35 d采心血，分離血清，測定血液中T淋巴細胞亞群數(shù)量；無菌取脾臟，做脾淋巴細胞增殖試驗及細胞因子檢測。

1.3 血清ND抗體效價測定Ⅰ～Ⅵ組分別于免疫前和免疫后7，14，21，28，35 d無菌采心血2 mL，靜置4 h，分離血清，4℃保存。用血凝抑制試驗測定各組ND抗體水平[13]。

1.4 免疫器官指數(shù)測定Ⅰ～Ⅵ組分別于免疫后7，14，21，28，35 d隨機抽取5只雞測體質(zhì)量，取胸腺、脾臟、法氏囊，并去除脂肪，用濾紙吸去表面液體，稱量鮮重，計算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官鮮質(zhì)量(mg)/宰前空腹體質(zhì)量(g).

1.5 脾臟T、B淋巴細胞增值測定二免后14 d Ⅶ～Ⅹ 每組取5只雞解剖，無菌取脾臟，按試劑盒方法測定。 刺激指數(shù)(SI)=D刺激管/D對照管。

1.6 血液T淋巴細胞亞群測定將Ⅶ～Ⅹ組分離的血清用ELISA試劑盒檢測CD4+、CD8+淋巴細胞數(shù)量，并計算其比值。

1.7 細胞因子mRNA相對表達量的測定免疫后7，14，21，28 d，Ⅷ～Ⅹ各組取5只雞，無菌取脾臟，按試劑盒方法提取總RNA。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。參照GenBank中雞GAPDH保守序列設(shè)計上、下游引物，參考文獻[14]設(shè)計IL-2、IL-4引物(表1)。引物由上海生工合成。用PCR檢測cDNA第1鏈質(zhì)量，總反應(yīng)體系為25.0 μL，其中GAPDH上游引物1.0 μL，GAPDH下游引物1.0 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個循環(huán)，再72℃總延伸5 min， 4℃保存，擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。以cDNA為模板，進行qPCR，反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBR Premix EX Taq Mix 10 μL，QF(10 μmol/L) 0.5 μL，QR(10 μmol/L) 0.5 μL，Template cDNA 2.0 μL，RNase Free ddH2O 7.0 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性，94℃變性5 s，61℃退火35 s，40個循環(huán)。采用2-△△Ct計算相對表達量。

表1 雞細胞因子qPCR擴增引物

1.8 統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行單因素方差分析和LSD多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 血清抗體效價變化表2可知，免疫前各組差異不顯著(P>0.05)；試驗期間，試驗組抗體效價均高于空白對照組。接種后7，21 d，與疫苗對照組比較α-AL試驗各組均呈上升趨勢，其中，Ⅳ組顯著高于空白對照、疫苗對照和α-AL其他試驗組(P<0.05)。28，35 d后，疫苗組及α-AL試驗各組顯著高于空白對照組(P<0.05)，但疫苗組與α-AL試驗各組間無顯著性差異。結(jié)果表明，α-AL注射可提高雞ND抗體的效價，以20 mg/kg劑量效果最佳。

表2 免疫后不同時間α-AL對雞ND抗體效價的影響

2.2 免疫器官指數(shù)變化如圖1所示，免疫后7 d，Ⅵ組胸腺指數(shù)最高，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組均低于Ⅰ、Ⅱ組；免疫后14，21，28，35 d試驗組胸腺指數(shù)均高于空白對照組，免疫后14，21，35 d，Ⅵ組高于Ⅱ組；免疫后14，21，28 d，Ⅳ組高于Ⅱ組；但所有參試組間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 α-AL對雞胸腺指數(shù)的影響

如圖2所示，免疫后14，21，28 d，各組脾臟指數(shù)呈上升趨勢，28 d達到最高峰，試驗組比對照組上升趨勢更明顯。免疫后14，21，28，35 d，Ⅵ組脾指數(shù)穩(wěn)定。免疫后21，28，35 d，Ⅳ組脾臟指數(shù)高于其余組；免疫后28，35 d，Ⅲ～Ⅴ組脾臟指數(shù)高于Ⅵ組，Ⅳ組的脾指數(shù)增加最明顯。α-AL試驗組脾臟指數(shù)均高于空白及疫苗組，但差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 α-AL對雞脾臟指數(shù)的影響

如圖3所示，α-AL各組法氏囊指數(shù)均高于空白及疫苗對照組；其中免疫后7 d，Ⅳ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05)，其余免疫后采樣時間點α-AL各組與空白及疫苗對照組間均無顯著性差異(P>0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 脾臟T、B淋巴細胞增值變化如圖4所示，二免后2周，Ⅸ、Ⅹ組T淋巴細胞刺激指數(shù)極顯著高于Ⅶ、Ⅷ組(P<0.01)，Ⅹ組T淋巴細胞刺激指數(shù)顯著高于Ⅸ組(P<0.05)，Ⅶ、Ⅷ組差異不顯著(P>0.05)。Ⅹ組B淋巴細胞刺激指數(shù)高于Ⅶ、Ⅷ組且差異極顯著(P<0.01)，Ⅹ組與Ⅸ組差異不顯著(P>0.05)，Ⅸ與Ⅷ組差異不顯著(P>0.05)，而與Ⅶ組差異極顯著(P<0.01)，Ⅶ、Ⅷ組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，免疫前連續(xù)注射α-AL 5 d，對雞T、B淋巴細胞增殖效果最好。

圖4 T、B淋巴細胞增殖動態(tài)變化

2.4 T淋巴細胞亞群變化

2.4.1CD4+T淋巴細胞亞群含量變化 由表3可知，免疫后各組均呈上升趨勢。免疫后7 d，Ⅸ、Ⅹ組顯著高于Ⅶ、Ⅷ組(P<0.05)；免疫后14，21 d，Ⅸ、Ⅹ組與Ⅶ、Ⅷ組差異極顯著(P<0.01)，且Ⅹ組極顯著高于Ⅸ組(P<0.01)；免疫后28 d，Ⅹ組極顯著高于Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ組(P<0.01)，Ⅸ組顯著高于Ⅶ、Ⅷ組(P<0.05)；第35 天，Ⅹ組高于Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ組，差異極顯著(P<0.01)，Ⅸ與Ⅶ組差異顯著(P<0.05)，Ⅸ與Ⅷ組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明,α-AL注射可提高雞CD4+T細胞含量，以連續(xù)注射5次效果最好。

表3 α-AL對雞血液中CD4+ T淋巴細胞亞群含量的變化

2.4.2CD8+T淋巴細胞亞群含量變化 由表4可知，各組均呈上升趨勢。免疫后28 d，Ⅹ組顯著高于對照組(P<0.05)，Ⅹ與Ⅸ組差異不顯著(P>0.05)；其余時間點，試驗組均高于對照組，Ⅹ組高于Ⅸ組，但差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，α-AL注射有提高雞CD8+T細胞含量趨勢，連續(xù)注射5次組免疫后28 d效果最明顯。

表4 α-AL對雞血液中CD8+ T淋巴細胞亞群含量的變化

2.4.3CD4+/ CD8+T淋巴細胞亞群比值變化 由表5可知，免疫后7，14 d，各組差異均不顯著(P>0.05)；免疫后21 d，Ⅹ組極顯著高于Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ組(P<0.01)；免疫后28 d，Ⅹ組顯著高于Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ組(P<0.05)；免疫后35 d，Ⅹ組極顯著高于Ⅶ、Ⅷ組(P<0.01)，顯著高于Ⅸ組(P<0.05)。結(jié)果表明，α-AL注射有提高雞CD4+/CD8+T細胞亞群比值的作用，以連續(xù)注射5次的效果最好。

表5 α-AL對雞血液中CD4+/ CD8+ T淋巴細胞亞群含量的變化

2.5 IL-2和IL-4 mRNA相對表達量變化經(jīng)脾臟提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，上、下游引物為GAPDH擴增，預(yù)期產(chǎn)物長度為82 bp，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，得到與預(yù)期相符的特異性條帶(圖5)。說明cDNA第1鏈符合要求。

M.DL2000 DNA Marker;1.GAPDH基因擴增結(jié)果

如圖6所示，免疫后7 d，Ⅸ組IL-2 mRNA相對表達量顯著低于Ⅷ組(P<0.01)；Ⅹ與Ⅷ、Ⅸ組差異不顯著(P>0.05)。免疫后14 d，Ⅹ組極顯著低于Ⅷ組(P<0.01)；Ⅸ與Ⅷ、Ⅹ組差異不顯著(P>0.05)。免疫后21 d，Ⅸ組極顯著高于Ⅷ、Ⅹ組(P<0.01)；Ⅹ與Ⅷ組差異不顯著(P>0.05)。免疫后28 d，Ⅸ顯著高于Ⅷ、Ⅹ組，Ⅹ組顯著高于Ⅷ組，且差異極顯著(P<0.01)。說明α-AL注射可提高雞脾臟細胞IL-2的表達量，以連續(xù)注射3次最佳。

圖6 IL-2 mRNA相對表達量變化結(jié)果

圖7可知，免疫后7 d，Ⅸ、Ⅹ組IL-4 mRNA相對表達量顯著高于Ⅷ組(P<0.01)；Ⅹ組顯著高于Ⅸ組(P<0.05)。免疫后14 d，各組差異不顯著(P>0.05)。首免后21 d，Ⅹ組顯著低于Ⅷ組(P<0.05)；Ⅸ組表達量低于Ⅷ組，與Ⅷ、Ⅹ組差異不顯著(P>0.05)。免疫后28 d，Ⅸ組極顯著高于Ⅹ組(P<0.01)，與Ⅷ組差異不顯著(P>0.05)；Ⅹ組表達量與Ⅷ組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果說明，α-AL注射后7 d有上調(diào)IL-4 mRNA效果，但以后呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢。

圖7 IL-4 mRNA相對表達量變化結(jié)果

3 討論

3.1 α-AL對雞ND疫苗抗體效價的影響體液免疫是動物機體抵擋外界病原體侵入的重要因素之一，而抗體效價是權(quán)衡機體體液免疫功能的最直接指標(biāo)之一。本研究各試驗組抗體水平均高于對照組，其中Ⅳ組(20 mg/kg組)在免疫后7，21 d，與Ⅱ組(疫苗對照組)差異顯著(P<0.05)，表明α-AL能提高雞ND抗體水平，這與相關(guān)報道一致[9，15-18]。

3.2 α-AL對雞免疫器官指數(shù)的影響動物機體免疫狀態(tài)直接受免疫器官的發(fā)育狀態(tài)、機能強弱影響，免疫器官指數(shù)是衡量免疫器官發(fā)育水平的一個基本指標(biāo)，免疫器官指數(shù)與免疫器官發(fā)育水平呈正相關(guān)。已有的資料顯示，當(dāng)歸運用于肉雞、小鼠，對其免疫器官指數(shù)有顯著提高作用[9]。本試驗結(jié)果，α-AL注射對雞胸腺、法氏囊和脾臟指數(shù)均呈正向作用，其中以20 mg/kg對雞法氏囊指數(shù)效果最好。與前人相關(guān)報道基本一致。

3.3 α-AL對脾臟T、B淋巴細胞的影響T、 B淋巴細胞分別調(diào)節(jié)動物機體的細胞免疫和體液免疫，是構(gòu)成動物機體免疫系統(tǒng)的重要細胞群體。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率是評價細胞免疫的一個重要指標(biāo)。本試驗用α-AL注射雞只可使其T、B淋巴細胞刺激指數(shù)高于疫苗組雞，說明α-AL能促進淋巴細胞增殖，使雞的細胞免疫增強，這與龍銳、馮景奇等[9-11]報道的一致。

3.4 α-AL對T淋巴細胞亞群的影響CD4+、CD8+是T淋巴細胞重要的2個細胞亞群，也是機體免疫調(diào)節(jié)的樞紐。CD4+/CD8+比值在正常范圍時，表明機體處于高免疫狀態(tài)，若比例失調(diào)或缺陷，各種免疫疾病極易發(fā)生。本試驗結(jié)果表明，注射α-AL組CD4+及CD4+/CD8+的值顯著高于單純疫苗組，說明α-AL能提高T淋巴細胞亞群活性，這與邱妍[19]和李淑芳等[20]報道的一致。

3.5 α-AL對細胞因子mRNA表達量的影響細胞因子具有調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫和固有免疫等作用，其動態(tài)變化及含量可反映機體免疫功能狀態(tài)。雞細胞因子主要由Th細胞分泌，IL-2和IL-4分別屬于Th1、Th2細胞因子，IL-2主要由Th1型CD4+T淋巴細胞分泌，可誘導(dǎo)多種免疫細胞增殖、分化、抗體分泌，以及誘生多種細胞因子，主要參與細胞免疫[21-23]；Th2細胞能輔助B淋巴細胞分化為分泌抗體的細胞，參與體液免疫。試驗結(jié)果顯示，α-AL能上調(diào)IL-2 mRNA表達水平，以連續(xù)注射3 d效果最佳，但對IL-4 mRNA表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，故α-AL主要表現(xiàn)為Th1型免疫。張宇暉[24]報道，α-AL作用于小鼠，對IL-2的分泌有顯著促進作用，在高濃度時才對IL-4有顯著抑制作用。本試驗選擇α-AL最佳給藥濃度，對IL-2、IL-4結(jié)果與張宇暉[24]報道的基本一致。