聚丙烯酰胺類油田添加劑生物毒性測試方法*

馬 躍， 宮 琦， 李術(shù)元， 賴曉晴

(1. 中國石油大學(xué) 理學(xué)院， 北京 102249； 2. 中國石油集團(tuán)工程技術(shù)研究院有限公司 鉆井液所， 北京 102206)

自1954年聚丙烯酰胺在美國實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)以來，大量丙烯酰胺類聚合物改性產(chǎn)品應(yīng)用于污水處理、石油開采和醫(yī)藥開發(fā)等領(lǐng)域，隨著聚丙烯酰胺在自然環(huán)境中的老化降解，其降解產(chǎn)物具有較高毒性，一定程度上污染了自然環(huán)境[1-3].而鉆井液中使用的包被劑、增粘劑、降濾失劑等基本都是丙烯酰胺類聚合物[4-5]，因此，丙烯酰胺類聚合物產(chǎn)品作為油田添加劑受到了質(zhì)疑.Sickles等[6]研究表明，丙烯酰胺具有生殖毒性，降低蛋白質(zhì)活性，影響細(xì)胞的有絲分裂和減數(shù)分裂，從而引起生殖損傷.也有研究[7-9]表明，油炸食品中的微量丙烯酰胺可致癌，且長期接觸丙烯酰胺類物質(zhì)還會(huì)導(dǎo)致“肌無力”等癥狀的產(chǎn)生，這是因?yàn)楸０返亩拘該p害了神經(jīng)系統(tǒng).聚丙烯酰胺類油田添加劑的“環(huán)?！迸欧懦蔀樨酱鉀Q的問題，而生物毒性是表征其環(huán)保性能的重要指標(biāo)之一.

自20世紀(jì)70年代以來，利用生物監(jiān)測器對(duì)環(huán)境中的污染物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)成為環(huán)境科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[10-13].發(fā)光菌測試方法具有快速、靈敏、簡便、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于排放樣品的生物毒性測試中[14-16].近兩年，用于《水溶性油田化學(xué)劑環(huán)境保護(hù)技術(shù)評(píng)價(jià)方法》(SY6788-2010)中的明亮發(fā)光桿菌T3小種凍干粉價(jià)格暴漲，且供貨不穩(wěn)定.本文以費(fèi)氏弧菌替代國標(biāo)菌種并將其作為測試對(duì)象，以發(fā)光強(qiáng)度和抑制率為考核指標(biāo)，通過一系列實(shí)驗(yàn)考察費(fèi)氏弧菌的穩(wěn)定性，研究不同濃度的參比毒物對(duì)菌種發(fā)光強(qiáng)度和抑制率的影響，進(jìn)而評(píng)價(jià)聚丙烯酰胺類油田添加劑的生物毒性.本文測試方法簡單方便，所用原料價(jià)格低廉，有效解決了發(fā)光桿菌T3小種價(jià)格昂貴、供貨不穩(wěn)定的問題.此外，與國標(biāo)中的氯化汞相比，參比毒物ZnSO4·7H2O能夠顯著降低毒性，并有助于開展油田添加劑的生物毒性機(jī)理研究.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

所用實(shí)驗(yàn)儀器包括產(chǎn)自湖南碧霄環(huán)境科技有限公司的BX-ATA-P型生物毒性測試儀、產(chǎn)自Thermo公司的不同量程精密移液器、產(chǎn)自凌拓(北京)化工玻璃儀器有限公司的不同量程容量瓶、燒杯、塑料瓶等.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料包括產(chǎn)自湖南碧霄環(huán)境科技有限公司的發(fā)光菌試劑盒(費(fèi)氏弧菌)以及產(chǎn)自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的ZnSO4·7H2O(分析純)和NaCl(分析純).聚合物包被劑在鉆井過程中可以起到有效分散鉆屑的作用，聚合物降濾失劑則可以起到防止濾失過大的作用.本實(shí)驗(yàn)所用的包被劑和降濾失劑均為聚丙烯酰胺類聚合物，由新疆瑪湖和黑龍江大慶油田某些原料配制而成.高粘甲基纖維素CMC-Hv與聚陰離子纖維素PAC-Hv均為天然產(chǎn)品，分別購自廊坊市新興化工有限公司和宜興市通達(dá)化學(xué)有限公司，聚合物XC為生物合成聚合物.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)類別

1) 陰性質(zhì)控實(shí)驗(yàn)：相當(dāng)于空白實(shí)驗(yàn)，以2%NaCl溶液為測試樣品，理想狀態(tài)下其抑制率為0%.

2) 陽性質(zhì)控實(shí)驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)品為陽極參比毒物(ZnSO4·7H2O)，理想條件下其抑制率為100%.

3) 樣品測定實(shí)驗(yàn)：共對(duì)8種物質(zhì)進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌毒性測定，每一個(gè)樣品需要一根試管(需按順序標(biāo)號(hào)).

1.3.2 凍干菌復(fù)蘇液配置

吸取1 mL凍干菌復(fù)蘇液(冷NaCl溶液)，滴加到裝有凍干菌的小試管中搖勻(約1 min)，進(jìn)行生物細(xì)菌凍干菌的復(fù)蘇，復(fù)蘇溫度穩(wěn)定在2～4 ℃.靜置3～5 min后，在暗室內(nèi)可以肉眼觀測到藍(lán)綠色熒光，再利用滲透壓調(diào)液配置出20 mL凍干菌復(fù)蘇液(稀釋菌液).

1.3.3 發(fā)光強(qiáng)度測試與抑制率計(jì)算

準(zhǔn)備若干支透明測試管并按順序編號(hào).首先向每一只空測試管中各加入0.5 mL稀釋菌液，平衡靜置3～5 min后，再測試其初始發(fā)光強(qiáng)度.在上述已經(jīng)加入稀釋菌液的測試管中，繼續(xù)加入0.5 mL待測樣品，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間，按照加樣的順序依次測定各測試管的發(fā)光強(qiáng)度.利用發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算凍干菌的抑制率，相應(yīng)計(jì)算表達(dá)式為

IR=(P0-P1)/P1×100%

式中：P0為初始發(fā)光強(qiáng)度；P1為檢測發(fā)光強(qiáng)度.

2 結(jié)果與討論

2.1 費(fèi)式弧菌發(fā)光穩(wěn)定性測試

為了驗(yàn)證費(fèi)式弧菌具有穩(wěn)定的發(fā)光能力，同時(shí)考慮到室溫不穩(wěn)定會(huì)影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，在恒溫20 ℃下測量費(fèi)式弧菌在陰性質(zhì)控實(shí)驗(yàn)中的發(fā)光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)中每2.5 min取一個(gè)測試點(diǎn)，直到30 min后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行三組實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果如圖1所示.圖1中RLU為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度單位，其數(shù)值隨著測試設(shè)備的型號(hào)變化而改變.

圖1 不同暴露時(shí)間對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of different exposure time on luminous intensity of vibrio fischeri

由圖1可見，在30 min內(nèi)隨著暴露時(shí)間的增加，費(fèi)式弧菌的生物活性逐漸降低，但降低趨勢很平緩，仍然具有較好的生物活性.可見，在20 ℃下費(fèi)式弧菌存活狀態(tài)較好，未過多受到溫度的干擾.圖1中三組凍干菌復(fù)蘇時(shí)的初始發(fā)光強(qiáng)度分別為14.4×105、12.9×105、11.6×105RLU，即均具有很好的初始發(fā)光強(qiáng)度，這證明了費(fèi)式弧菌無論是在運(yùn)輸途中還是在冰箱保存過程中，都不易失去生物活性，因而具有較好的穩(wěn)定性.觀察圖1可以發(fā)現(xiàn)，在30 min測量時(shí)間內(nèi)，費(fèi)式弧菌的發(fā)光強(qiáng)度未出現(xiàn)明顯下降，表明費(fèi)式弧菌在測量過程中自然死亡率不高，且所測數(shù)據(jù)處于生物體實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi).

2.2 參比毒物濃度的影響

依據(jù)ISO 11348-3標(biāo)準(zhǔn)方法要求，選擇易溶、穩(wěn)定、常見、價(jià)廉、對(duì)人和環(huán)境危害小的ZnSO4·7H2O為毒性參照物，考察了不同濃度ZnSO4·7H2O對(duì)費(fèi)式弧菌發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同濃度ZnSO4·7H2O對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of ZnSO4·7H2O at different concentrations on luminous intensity of vibrio fischeri

由圖2可見，不同暴露時(shí)間下不同濃度ZnSO4·7H2O對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度具有較大影響.當(dāng)ZnSO4·7H2O濃度達(dá)到5 mg/L時(shí)，費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度開始明顯下降；當(dāng)ZnSO4·7H2O濃度達(dá)到15～20 mg/L時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度顯著下降，表明毒性參照物ZnSO4·7H2O的濃度越大，其對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度影響越大，也就是其抑制率越高.這是因?yàn)閆n2+濃度越大，對(duì)費(fèi)氏弧菌產(chǎn)生細(xì)菌熒光素酶的影響越大，因而測得的發(fā)光強(qiáng)度越小.當(dāng)Zn2+濃度超過4.55 mg/L、暴露時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，費(fèi)氏弧菌抑制率達(dá)到了96.0%，幾乎接近于100%的致死濃度.

2.3 20 mg/L ZnSO4·7H2O的影響

ISO 11348-3標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的ZnSO4·7H2O參考濃度為19.34 mg/L，因此，有必要研究發(fā)光菌在20 mg/L ZnSO4·7H2O中發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化規(guī)律.配置20 mg/L ZnSO4·7H2O作為參比毒物，研究該濃度ZnSO4·7H2O作用下費(fèi)氏弧菌的發(fā)光強(qiáng)度和抑制率，結(jié)果如圖3所示.

圖3 ZnSO4·7H2O對(duì)費(fèi)式弧菌發(fā)光強(qiáng)度和抑制率的影響Fig.3 Effect of ZnSO4·7H2O on luminous intensity and inhibition rate of vibrio fischeri

《水溶性油田化學(xué)劑環(huán)境保護(hù)技術(shù)評(píng)價(jià)方法》(SY6788-2010)標(biāo)準(zhǔn)要求：相同濃度毒性參照物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差需要控制在10%以內(nèi).由圖3可見，濃度為20 mg/L的ZnSO4·7H2O溶液的5 min發(fā)光抑制率為60%，15 min發(fā)光抑制率為91%，30 min發(fā)光抑制率為95%.由此可見，5 min和15 min發(fā)光抑制率測試結(jié)果差異較大，而15 min發(fā)光抑制率為生物活性趨于平緩的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，表明利用ZnSO4·7H2O進(jìn)行陽性質(zhì)控實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)該在測試過程中選擇15～30 min作為測試時(shí)間，從而縮小誤差.

2.4 油田添加劑生物毒性測試

在20 ℃下對(duì)油田添加劑的生物毒性進(jìn)行測試，結(jié)果如表1所示.表1中的添加量均為現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)中在保證實(shí)驗(yàn)效果的前提下所需的最小添加量.

表1 油田添加劑的生物毒性測試結(jié)果Tab.1 Test results of biological toxicity of oil field additives

由于受到合成與自然降解條件的影響，表1中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在較小偏差.聚合物包被劑和降濾失劑均為聚丙烯酰胺類產(chǎn)品，皆由實(shí)驗(yàn)室配置(具體成分涉密).理想狀態(tài)下樣品發(fā)光抑制率不受暴露時(shí)間的影響，且處于相同環(huán)境下的實(shí)驗(yàn)樣品受到自然死亡的影響也相同.由表1可見，實(shí)際上油田添加劑生物毒性隨暴露時(shí)間的延長而增大.相同暴露時(shí)間內(nèi)，樣品包被劑-2毒性最大，包被劑-3毒性最小，而樣品降濾失劑-1和降濾失劑-4均為劇毒，降濾失劑-3毒性最小.當(dāng)暴露時(shí)間為15 min時(shí)，復(fù)蘇過程導(dǎo)致發(fā)光抑制率還不穩(wěn)定，因而具有較大誤差.當(dāng)暴露時(shí)間由15 min延長到45 min時(shí)，發(fā)光菌抑制率均有所提高，但提高幅度相對(duì)較小.當(dāng)暴露時(shí)間由45 min延長到180 min時(shí)，發(fā)光菌抑制率顯著提高.由于費(fèi)氏弧菌在室溫下存在自然死亡現(xiàn)象，因而難以進(jìn)行長時(shí)間測定.根據(jù)不同濃度ZnSO4·7H2O對(duì)費(fèi)式弧菌發(fā)光強(qiáng)度的影響結(jié)果可知，15～30 min暴露時(shí)間段內(nèi)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度曲線走勢趨于平穩(wěn)，因而15～30 min為較合適的測定時(shí)間.觀察表1可以發(fā)現(xiàn)，聚合物包被劑毒性較小，這是因?yàn)榘粍楸┧岷捅０肪酆衔铮肿恿客ǔ８哂?00萬，在鉆井液中添加范圍為0.2%～0.5%，由于添加量較小，因而其對(duì)毒性影響相對(duì)較小.聚合物降濾失劑由丙烯酰胺、丙烯酸和2-甲基丙磺酸單體聚合組成且毒性較大，這是因?yàn)槠湓阢@井液中添加量較大，需要引入更多基團(tuán)或其他成分達(dá)到抗溫、抗鹽的目的，因此，其在生物毒性評(píng)價(jià)過程中的整體發(fā)光抑制率偏高.聚合物降濾失劑-3是一種低毒型產(chǎn)品，其余三種產(chǎn)品均為重毒或劇毒產(chǎn)品，此類型聚合物降濾失劑應(yīng)用于鉆采過程中會(huì)嚴(yán)重威脅土壤土質(zhì)和地下水的清潔，過多使用會(huì)破壞生態(tài)平衡.CMC-Hv、PAC-Hv和XC皆為大分子纖維素或天然產(chǎn)品合成產(chǎn)物，毒性較弱，比較環(huán)保.綜上所述，費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率可用于油田添加劑生物毒性的評(píng)價(jià)，同時(shí)也可用于土壤和水質(zhì)的快速檢測.

3 結(jié) 論

費(fèi)式弧菌在測量過程中存活率高、穩(wěn)定性好，本文采用費(fèi)氏弧菌替代GB/T15441-1995中明亮發(fā)光菌T3小種測定油田添加劑的生物毒性，其測試結(jié)果在誤差允許范圍內(nèi)，解決了明亮發(fā)光菌T3小種價(jià)格昂貴、市場供貨不穩(wěn)定等問題.與國標(biāo)中的氯化汞相比，該測試方法選取的參比毒物ZnSO4·7H2O更加環(huán)保，且ZnSO4·7H2O濃度越大，發(fā)光強(qiáng)度越低，抑制率越高.費(fèi)式弧菌檢測方法可以有效檢測丙烯酰胺單體的毒性，不僅可以評(píng)價(jià)油田添加劑的環(huán)保性能，還可推廣應(yīng)用于土壤和水質(zhì)的快速檢測，因此，可替代國標(biāo)中的明亮發(fā)光菌T3小種，快速、便捷地進(jìn)行生產(chǎn)現(xiàn)場的生物毒性測試.