高效液相色譜法測(cè)定烏發(fā)護(hù)理液中二苯乙烯苷與特女貞苷的含量

何怡靜，李孝棟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

烏發(fā)護(hù)理液由何首烏、女貞子等組成，可用于須發(fā)早白等癥［1］。其中君藥何首烏所含的二苯乙烯苷，可誘導(dǎo)酪氨酸酶（TYR）重要轉(zhuǎn)錄因子的激活，而TYR是黑素形成過(guò)程中的主要限速酶，其表達(dá)和活性決定著黑素合成的速度和產(chǎn)量［2-8］。因此，二苯乙烯苷是發(fā)揮烏發(fā)補(bǔ)益作用的主要藥效成分。特女貞苷是女貞子中的特征成分，有研究顯示女貞子提取物對(duì)體外培養(yǎng)毛囊的黑素細(xì)胞有促進(jìn)作用［9-10］。黃丹等［11］建立了烏發(fā)生發(fā)液中二苯乙烯苷的含量測(cè)定方法，然而方中所含成分復(fù)雜，質(zhì)量控制指標(biāo)卻很單一。本研究參考既往文獻(xiàn)［9，12-13］，增加質(zhì)量控制指標(biāo)，優(yōu)化含量測(cè)定方法，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定二苯乙烯苷和特女貞苷含量，以控制烏發(fā)護(hù)理液的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器AR2140電子天平（梅特勒-托利多儀器）；DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；LC-20AT型高效液相色譜儀（島津公司）。

1.2 試藥 二苯乙烯苷（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；特女貞苷（成都普思生物科技股份有限公司）；乙腈（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；藥材飲片何首烏、女貞子等均購(gòu)自福州閩侯上街致誠(chéng)藥店，由福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃澤豪副教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱定二苯乙烯苷、特女貞苷對(duì)照品適量，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，制成每1 mL含二苯乙烯苷500 μg、特女貞苷1 000 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，低溫避光保存?zhèn)溆?。精密吸? mL對(duì)照品儲(chǔ)備液至10 mL棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取處方量的何首烏、女貞子等藥材，粉碎，加入稀乙醇30 mL，浸泡30 min，加熱回流45 min，放冷，過(guò)濾，稀乙醇定容至50 mL，微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得。

2.1.3 缺何首烏陰性樣品溶液 取除何首烏之外的處方量藥材，粉碎，精密加入稀乙醇25 mL，浸泡30 min，加熱回流45 min，放冷，補(bǔ)足重量，微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得。

2.1.4 缺女貞子陰性樣品溶液 取除女貞子之外的處方量的藥材，粉碎，參照“2.1.3”項(xiàng)下缺何首烏陰性樣品溶液的制備同法操作。

2.2 色譜條件Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（17∶83）；檢測(cè)波長(zhǎng)：224 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃；流速：1.0 mL／min。

2.3 專屬性考察 在上述色譜條件下，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果如圖1所示，供試品和對(duì)照品溶液的色譜圖在相同的保留時(shí)間有一相同的色譜峰，而陰性樣品無(wú)干擾。

圖1 專屬性考察色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、4.0 mL，分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（Y）對(duì)濃度（X，μg／mL）作圖。二苯乙烯苷峰面積在5～200 μg／mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y＝17 539X－18 827（r＝0.999 8）。特女貞苷峰面積在10～400 μg／mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y＝11 563X－31 141（r＝0.999 9）。

2.5 精密度考察 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其二苯乙烯苷峰面積RSD為0.80%，特女貞苷峰面積RSD為1.28%，結(jié)果表明儀器精密度好。

2.6 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，二苯乙烯苷峰面積RSD為1.80%，特女貞苷峰面積RSD為1.06%，表明供試品溶液在24 h以內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性考察 取同一批樣品6份，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得峰面積，并計(jì)算得二苯乙烯苷含量RSD為2.30%，特女貞苷含量RSD為3.59%，結(jié)果表明方法重復(fù)性好。

2.8 加樣回收率考察 精密吸取已知含量的樣品溶液6份，分別精密加入二苯乙烯苷、特女貞苷混合對(duì)照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加稀乙醇溶解定容至刻度，微孔濾膜濾過(guò)，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果如表1、表2所示，二苯乙烯苷的平均加樣回收率為102.74%，RSD為0.94%，特女貞苷的平均加樣回收率為104.82%，RSD為0.63%，表明本法準(zhǔn)確性好。

表1 二苯乙烯苷加樣回收率考察結(jié)果

表2 特女貞苷加樣回收率考察結(jié)果

2.9 烏發(fā)護(hù)理液樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定二苯乙烯苷及特女貞苷峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 烏發(fā)護(hù)理液樣品含量測(cè)定mg／g

3 討 論

特女貞苷在224 nm處有最大吸收，二苯乙烯苷在224 nm和320 nm處均與較強(qiáng)吸收，因此，選擇224 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)［9］。

本方法采用C18色譜柱，流動(dòng)相選為乙腈-水（17∶83），檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30℃，流速為1.0 mL／min，可以快速測(cè)定烏發(fā)護(hù)理液中二苯乙烯苷和特女貞苷的含量，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可以控制烏發(fā)護(hù)理液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，還可為含有何首烏和女貞子的制劑建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。