電針“百會(huì)”“神庭”對(duì)阿爾茨海默病小鼠早期空間識(shí)別功能與腦區(qū)局部一致性的影響

何肖君，李 瓏，梁勝祥，柳維林*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)產(chǎn)業(yè)研究院，福建 福州350122）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，65歲以上人群有10%患有AD［1］。AD臨床癥狀表現(xiàn)為記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)和執(zhí)行功能障礙等認(rèn)知功能障礙［2］。普遍認(rèn)為AD主要病理改變是淀粉樣蛋白β（Aβ）沉積形成老年斑和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維tau纏結(jié)的累積［3］。針刺療法是中醫(yī)學(xué)重要組成部分，大量研究表明針刺“百會(huì)”“神庭”治療癡呆具有很好效果［4］。目前，功能磁共振成像（fMRI）已被廣泛用于揭示電針療效影響的相關(guān)腦區(qū)，局部一致性（regional homogeneity，ReHo）作為靜息態(tài)功能磁共振成像（rsfMRI）的一種分析方法，反映靜息狀態(tài)下腦自發(fā)性神經(jīng)元活動(dòng)，是研究靜息狀態(tài)下局部腦區(qū)活動(dòng)變化的重要指標(biāo)之一［5］。因此，本文利用血氧水平依賴（blood oxygen level dependent，BOLD）信號(hào)腦區(qū)局部一致性探討電針“百會(huì)”“神庭”穴對(duì)AD模型小鼠空間識(shí)別功能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2月齡雄性5×FAD小鼠和雌性野生小鼠，購(gòu)自虔碧生物科技有限公司，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：2020-0002，模擬標(biāo)準(zhǔn)日夜系統(tǒng)，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程所有動(dòng)物的處理均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南（National Academy Press）進(jìn)行（倫理編號(hào)：FJTCMIACUC 2019031）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑Biospin DNA提取試劑盒（杭州博日科技股份有限公司）；DNA鑒定引物（上海生工生物有限公司）；異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物磁共振掃描儀（德國(guó)Bruker公司）；小鼠曠場(chǎng)反應(yīng)箱（上海欣軟科技信息有限公司）；電針儀（上海華誼牌公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公 司）；0.5寸 不 銹 鋼 毫 針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

2 方 法

2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定與分組 將雄性5×FAD小鼠和雌性野生小鼠雜交后得到子代，幼鼠出生后21 d對(duì)其剪耳標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，然后取鼠尾0.5 cm進(jìn)行基因提取，DNA提取按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。將提取的DNA組織與PCR Master Mix、RNA-free水以及待測(cè)基因引物按比例配制混勻后置于PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。在瓊脂糖凝膠上上樣并進(jìn)行電泳（電壓100 V，時(shí)間60 min），最后進(jìn)行顯影成像。目標(biāo)基因APP和PS1的分子量分別為377 bp和608 bp，成像的條帶同時(shí)表達(dá)APP和PS1兩條條帶的待測(cè)小鼠為5×FAD陽(yáng)性小鼠。將陽(yáng)性小鼠分為雌雄不同性別后再按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和電針組，此外取同等數(shù)量的同窩陰性小鼠作為野生對(duì)照組。

2.2 干預(yù) 電針組：取小鼠“百會(huì)”穴（前正中線，兩耳尖連線中點(diǎn)）和“神庭”穴（前正中線，額頂骨縫交界線前方），兩穴均采用45°斜刺2 mm，電針儀參數(shù)設(shè)置為：頻率2／20 Hz，疏密波，電壓峰2 V，每次30 min，每日1次，每周5次，總共干預(yù)4周。野生組和模型組只進(jìn)行每日從飼養(yǎng)籠中抓取，不給予其它治療。

2.3觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能與探索能力。在測(cè)試前1 d將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于反應(yīng)箱（40×40×50）cm3適應(yīng)10 min，允許其自由探索。正式測(cè)試時(shí)，將小鼠置于反應(yīng)箱正中心位置，并令其在箱子自由探索10 min，箱子頂部攝像機(jī)記錄其運(yùn)動(dòng)軌跡，每只動(dòng)物測(cè)試完后用75%酒精進(jìn)行清潔。最后對(duì)小鼠活動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間和平均運(yùn)動(dòng)速度等指標(biāo)進(jìn)行分析。

2.3.2 新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn) 新位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠空間識(shí)別能力。適應(yīng)期：訓(xùn)練前1 d將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放置于反應(yīng)箱（40×40×50）cm3適應(yīng)10 min，允許其自由活動(dòng)；訓(xùn)練期：在反應(yīng)箱的西北角和西南角放置物體A和物體B，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在反應(yīng)箱中央使其頭部與兩物體的距離相同，在5 min內(nèi)記錄小鼠與兩物體接觸情況，并觀察距離物體2～3 cm的探索物體時(shí)間；測(cè)試期：將西南角的B物體移至東南角記為物體C，其他物體位置保持不變，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在反應(yīng)箱中央使其頭部與兩物體的距離相同，在反應(yīng)箱中自由活動(dòng)10 min，記錄小鼠對(duì)物體A和物體C的探索時(shí)間，記為TA和TC。

2.3.3 靜息態(tài)腦功能觀察 將小鼠置于3%的異氟烷中誘導(dǎo)麻醉，然后以1.5%異氟烷維持，將小鼠頭部置于小鼠表面線圈內(nèi)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠的呼吸和心率，同時(shí)打開(kāi)水溫箱保持水溫維持恒定。T2WI參數(shù)：回波時(shí)間（TE）／重復(fù)時(shí)間（TR）＝4 200 ms／35 ms，視野大?。‵OV）＝20 mm×20 mm，層數(shù)（Slices）＝35，層厚（Slices Thickness）＝0.5 mm，矩陣（matrix）＝256×256。隨后采用BOLD-fMRI掃描，參數(shù)為TE＝10 279 ms，TR＝2 000 ms，F(xiàn)OV＝20 mm×20 mm，Averages＝4，Image size＝64×64，Slices Thickness＝0.5 mm。ReHo分析采用統(tǒng)計(jì)參數(shù)圖工具包（SPM）和靜息態(tài)功能磁共振數(shù)據(jù)處理助手（DPARSF）軟件包進(jìn)行分析。

2.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用（±s）表示，方差呈齊性，兩兩比較采用LSD分析，方差不齊，兩兩比較采用Dunnett's檢驗(yàn)。行為學(xué)統(tǒng)計(jì)分析以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ReHo圖像統(tǒng)計(jì)分析以P＜0.005，簇（Cluster）＞10個(gè)體素認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組小鼠探索能力與自發(fā)活動(dòng)水平觀察 干預(yù)前和干預(yù)后曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)各組小鼠在總路程、平均速度和中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間等指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明電針“百會(huì)”“神庭”對(duì)5×FAD小鼠探索能力和自發(fā)活動(dòng)水平無(wú)影響，見(jiàn)表1。

表1 干預(yù)前后3組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表1 干預(yù)前后3組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

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3.2 空間識(shí)別記憶檢測(cè) 在干預(yù)前，模型組和電針組較野生組新位置識(shí)別辨別指數(shù)下降（P＜0.01），在干預(yù)后電針組較模型組新位置識(shí)別辨別指數(shù)上升（P＜0.01），因此，電針“百會(huì)”“神庭”對(duì)5×FAD小鼠空間識(shí)別記憶有改善作用，見(jiàn)表2。

表2 3組小鼠新位置識(shí)別辨別指數(shù)比較（±s）%

表2 3組小鼠新位置識(shí)別辨別指數(shù)比較（±s）%

注：與野生組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

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3.3 各組小鼠腦區(qū)BOLD信號(hào)分析 干預(yù)后野生組、模型組和電針組各組小鼠用一時(shí)間序列不同腦區(qū)的BOLD信號(hào)局部一致性比較，為了便于觀察，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果疊加在一個(gè)Paxinos和Franklin空間的T2WI小鼠腦模板上，彩色區(qū)域表示2組組間比較的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的腦區(qū)（P＜0.005，Clusters＞10）（圖1）。與野生組相比，模型組BOLD信號(hào)局部一致性降低的腦區(qū)包括雙側(cè)海馬腦區(qū)、右側(cè)尾狀核；與模型組相比，電針組BOLD信號(hào)局部一致性升高的腦區(qū)包括右側(cè)海馬腦區(qū)、右側(cè)尾狀核和左側(cè)感覺(jué)皮層，見(jiàn)表3。

表3 干預(yù)后各組小鼠局部一致性比較

圖1 干預(yù)后各組小鼠局部一致性比較結(jié)果圖

4 討 論

在我國(guó)古代文獻(xiàn)中，AD屬于“呆病”“神志疾病”和“郁證”等。李時(shí)珍云：“腦為元神之府”，即癡呆病位在腦，其病機(jī)多為髓海不足、神機(jī)失用。督為陽(yáng)脈之海，六陽(yáng)經(jīng)氣均匯集于此，“百會(huì)”屬督脈，頂骨正中，稱“三陽(yáng)五會(huì)”，故能通達(dá)陰陽(yáng)脈絡(luò)，調(diào)節(jié)人體內(nèi)部陰陽(yáng)之氣；“神庭”是督脈、陽(yáng)明經(jīng)和足太陽(yáng)交匯之穴，《淮南子》曰：“是故神者，智之淵也，淵清則智明矣”?！吧裢ァ毖ň哂虚_(kāi)竅、寧神作用。臨床實(shí)踐已證明針刺療法是防治認(rèn)知功能障礙的有效方法，一項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)納入1 421名腦卒中后認(rèn)知功能障礙患者，針刺“百會(huì)”“神庭”4周后認(rèn)知功能改善［6］。并且有臨床實(shí)驗(yàn)研究比較針刺與藥物治療AD的臨床療效差異，發(fā)現(xiàn)針刺組與藥物治療組均改善認(rèn)知功能，且針刺“百會(huì)”“神庭”等穴療效優(yōu)于藥物治療組［7］。同時(shí)，動(dòng)物研究也表明針刺可改善AD模型動(dòng)物空間學(xué)習(xí)與記憶障礙［8］。本研究也發(fā)現(xiàn)電針“百會(huì)”“神庭”可提高AD小鼠的新位置識(shí)別辨別指數(shù)，改善早期空間識(shí)別功能。

以往研究表明，AD疾病中神經(jīng)原纖維tau蛋白病理改變首先出現(xiàn)在內(nèi)嗅皮層，其次是海馬的CA1區(qū)，最后延伸到CA4區(qū)，并且這些區(qū)域的神經(jīng)原纖維病理改變最終會(huì)引發(fā)神經(jīng)元功能障礙和死亡，從而導(dǎo)致記憶功能受損，因此這是早期認(rèn)知功能障礙的診斷標(biāo)記物［9］。海馬損傷在AD病理過(guò)程中具有區(qū)域特異性，一項(xiàng)研究納入大約200名認(rèn)知正常的老年人、400名輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）患者和200名早期AD患者進(jìn)行隨訪2～3年，基于MRI的海馬局部成分分析（LoCA）顯示海馬體積與腦脊液中β淀粉樣蛋白和tau蛋白以及認(rèn)知功能測(cè)量值之間的關(guān)聯(lián)非常顯著［10］。海馬作為學(xué)習(xí)與記憶核心腦區(qū)，海馬體的損傷通常會(huì)產(chǎn)生時(shí)間分級(jí)的逆行性遺忘癥，即最近獲得的記憶比遠(yuǎn)期獲得的記憶受損更嚴(yán)重，并表現(xiàn)出相應(yīng)空間學(xué)習(xí)記憶障礙［11］。對(duì)AD模型APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠電針“百會(huì)”穴治療4周，通過(guò)減少海馬和皮層Aβ沉積、提高BDNF表達(dá)和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生來(lái)改善學(xué)習(xí)記憶功能［12］。對(duì)血管性認(rèn)知障礙大鼠針刺“百會(huì)”“足三里”2周可以通過(guò)上調(diào)海馬腦區(qū)谷氨酸受體的表達(dá)以及增加神經(jīng)元的存活來(lái)改善空間記憶功能［13］。

以往研究對(duì)MCI和AD患者的腦容積分析主要集中于皮質(zhì)、海馬、顳葉等認(rèn)知功能相關(guān)的腦區(qū)，而尾狀核等與認(rèn)知功能無(wú)直接聯(lián)系的腦區(qū)則鮮有報(bào)道。近年來(lái)對(duì)路易體癡呆和帕金森病癡呆患者的神經(jīng)影像學(xué)研究顯示，患者尾狀核出現(xiàn)明顯萎縮［14］。有研究顯示，與同年齡段正常人比較，AD患者和MCI患者的尾狀核等腦深部核團(tuán)的磁共振成像體積明顯 縮 小［15］，并 且 可 能 與 患 者 認(rèn) 知 功 能 下 降 有 關(guān)［16］。有研究基于rs-fMRI分析AD患者海馬與全腦功能連接的動(dòng)態(tài)變化情況，發(fā)現(xiàn)AD患者左側(cè)海馬與右側(cè)尾狀核的功能連接具有增強(qiáng)的時(shí)間變異性［17］。記憶和認(rèn)知過(guò)程需要腦網(wǎng)絡(luò)的整合，海馬記憶環(huán)路（Papez環(huán)路）是參與情景記憶編碼、形成和鞏固的重要節(jié)點(diǎn)。有研究以海馬為種子，rs－fMRI發(fā)現(xiàn)丘腦、尾狀核、扣帶回皮層區(qū)域參與了Papez環(huán)路，并且在涉及學(xué)習(xí)和記憶功能的大腦區(qū)域功能連接明顯下降，與情景記憶表現(xiàn)有顯著相關(guān)性［18］。

rs-BLOD-fMRI是基于檢測(cè)氧與血紅蛋白結(jié)合來(lái)反應(yīng)神經(jīng)元活動(dòng)狀態(tài)，目前基于rs-BLOD-fMRI對(duì)AD研究眾多［19］。ReHo是用于分析腦局部活動(dòng)，以往研究發(fā)現(xiàn)患MCI與AD人群較正常老年人楔形皮質(zhì)、雙側(cè)后扣帶回和內(nèi)側(cè)前額葉的ReHo均降低，并且情景記憶功能與ReHo呈正相關(guān)，因此ReHo可以作為AD認(rèn)知功能障礙的預(yù)測(cè)指標(biāo)［20］。本研究ReHo分析發(fā)現(xiàn)，AD小鼠早期雙側(cè)海馬和右側(cè)尾狀核BOLD信號(hào)局部一致性下降，而電針“百會(huì)”“神庭”提高AD小鼠的右側(cè)海馬和尾狀核BOLD信號(hào)局部一致性。

本研究結(jié)果顯示，AD早期出現(xiàn)空間識(shí)別功能障礙，電針“百會(huì)”“神庭”可能通過(guò)提高海馬和尾狀核BOLD信號(hào)局部一致性活動(dòng)，從而改善空間識(shí)別功能。未來(lái)研究應(yīng)更進(jìn)一步觀察海馬-尾狀核功能連接變化，為理解AD病理機(jī)制提供更可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。