非洲豬瘟病毒Pig/HLJ/2018株CP2475L編碼蛋白pp220的生物信息學(xué)分析

曹乾大 ，戴碧紅 ，曹雪蓮 ，楊 旸

（1.富順縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 自貢 643200；2.內(nèi)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 內(nèi)江 641200；3.雁江區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 資陽(yáng) 641300）

非洲豬瘟自2018年傳入中國(guó)以來，以極快的速度在國(guó)內(nèi)傳播，給中國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了數(shù)千億元的經(jīng)濟(jì)損失，并且這一數(shù)字隨著疫情形勢(shì)在進(jìn)一步擴(kuò)大，對(duì)整個(gè)養(yǎng)殖環(huán)境的沖擊和經(jīng)濟(jì)的深遠(yuǎn)影響非常之大。非洲豬瘟病毒的生存能力很強(qiáng)，一旦在一個(gè)區(qū)域出現(xiàn)，將會(huì)形成定植，所以如何防止、凈化、根除非洲豬瘟是我國(guó)動(dòng)物疫情防控的重中之重。非洲豬瘟的病原是非洲豬瘟病毒（Africa Swine Fever virus，ASFV），CP2475L 基 因 是非洲豬瘟病毒基因組中最大的一個(gè)基因，它是參與病毒核衣殼形成的重要基因，其編碼蛋白為pp220蛋白（polyprotein 220，多聚蛋白），經(jīng)裂解加工后形成病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋 白 p150、p37、p34和 p14， 抑制CP2475L基因的表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致病毒核衣殼和DNA的部分缺失，推測(cè)CP2475L基因可能具有銜接病毒核衣殼和囊膜的功能，pp220可能作為一個(gè)蛋白支架的作用，連接核衣殼和外部包膜[1-2]。pp220對(duì)ASFV另一個(gè)多聚蛋白前體pp62的加工有重要作用，pp62的加工需要pp220表達(dá)的核心產(chǎn)物參與才能進(jìn)行，而pp220和pp62這兩個(gè)前體的加工又依賴于ASFV主要衣殼蛋白p72的表達(dá)，當(dāng)p72的表達(dá)被敲除后，pp62和pp220會(huì)形成一個(gè)拉鏈狀細(xì)長(zhǎng)的膜結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)，而pp220和pp62經(jīng)加工之后的成熟產(chǎn)物共占ASFV粒子蛋白質(zhì)量的30%左右，是核衣殼的重要組成部分，因此，多聚蛋白pp220和pp62對(duì)ASFV組裝成熟有重要作用[3-4]。目前對(duì)CP2475L基因編碼蛋白pp220的研究數(shù)據(jù)較少，文章以非洲豬瘟病毒Pig/HLJ/2018中國(guó)分離株為對(duì)象，從生物信息學(xué)角度對(duì)CP2475L基因編碼的pp220多聚蛋白進(jìn)行分析，為非洲豬瘟病毒的研究補(bǔ)充一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因獲取

Pig/HLJ/2018株非洲豬瘟病毒CP2475L基因位于病毒基因組117 290 bp~124 720 bp，其編碼蛋白為pp220，蛋白序列獲取于NCBI，GB ID為QBH90580.1。

1.2 分析方法

1.2.1 pp220蛋白理化性質(zhì)分析

利用ExPASy在線分析工具ProtParam[5]（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)pp220的蛋白分子量、等電點(diǎn)、氨基酸結(jié)構(gòu)、原子數(shù)、疏水性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2.2 蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽分析

通 過 TMHMM-2.0[6]（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）在線服務(wù)器分析蛋白跨膜區(qū)，SignalP-5.0[7]（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）在線服務(wù)器分析蛋白信號(hào)肽。

1.2.3 蛋白抗原指數(shù)、親水性、表面可及性、滴定曲線分析

采用Lasergene7.0 Protean模塊對(duì)蛋白抗原指數(shù)、親水性、表面可及性、滴定曲線進(jìn)行分析。

1.2.4 pp220優(yōu)勢(shì)B、T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

采用NetSurfP-2.0在線服務(wù)器[8]（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-2.0）、PSRSM在 線 服 務(wù) 器[9-10]（http://210.44.144.20:82/protein_PSRSM/default.aspx）分析蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)2種方法分析結(jié)果進(jìn)行綜合，去除α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等不易形成抗原表位的區(qū)域，篩選出易形成抗原表位的區(qū)域即為潛在優(yōu)勢(shì)表位區(qū)域。采用在線分析工具BepiPred1.0[11]（http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0）、IEDB[12]（ http://tools.iedb.org/bcell/）分析序列B細(xì)胞抗原表位區(qū)域，兩種方法分析結(jié)果綜合得出B細(xì)胞抗原表位區(qū)域。采用NetMHC 4.0 在線服務(wù)器[13-14]（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）、NetMHCpan-4.1 在線服務(wù) 器[15]（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCpan-4.1）分析序列T細(xì)胞抗原表位區(qū)域，物種選擇豬，MHC種類的SLA-10401、SLA-20401和 SLA-30401，肽段長(zhǎng)度選擇9aa，其他參數(shù)為默認(rèn)，Rank%值越低表示肽段親和力越強(qiáng)，綜合結(jié)果得到T細(xì)胞抗原表位區(qū)域。綜合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)易形成抗原表位區(qū)域和B、T細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果，篩選出優(yōu)勢(shì)B、T細(xì)胞抗原表位。

1.2.5 基于HLJ/2018株非洲豬瘟病毒pp220蛋白的進(jìn)化樹構(gòu)建

通過NCBI BlastP程序獲取序列。使用Clustal X 1.83對(duì)選取的序列進(jìn)行比對(duì)。使用MEGA 5.05（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）繪制進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)置為1 000次，選擇泊松模型驗(yàn)證。

2 分析結(jié)果

2.1 pp220理化性質(zhì)

根據(jù)ProtParam分析結(jié)果，pp220蛋白共2 476 aa，分子質(zhì)量為28.121 905 kDa，其中亮氨酸（10.7%）、天冬氨酸（7.7%）、谷氨酸（6.6%）的占比最高，其他的組分氨基酸占比為0.3%~6.3%不等。理論等電點(diǎn)為6.13，分子式為C12548H19910N3458O3741S67，總共有39 724個(gè)原子組成。帶負(fù)電荷的氨基酸（酸性）總數(shù)為282，帶正電荷的氨基酸（堿性）總數(shù)為262。預(yù)測(cè)280 nm消光系數(shù)為235 050~235 550 M-1cm-1之間（取決于半胱氨酸形成胱氨酸的程度）。在哺乳動(dòng)物體外網(wǎng)狀細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母中的半衰期大于20 h，在大腸桿菌中半衰期大于10 h。不穩(wěn)定指數(shù)為43.30。脂肪族氨基酸指數(shù)為97.02，總平均親水性為-0.296，屬于親水穩(wěn)定蛋白。

2.2 蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽分析結(jié)果

經(jīng)分析，pp220蛋白不存在跨膜區(qū)（圖1），信號(hào)肽分析結(jié)果的可能性為0.002 1，即不存在信號(hào)肽（圖2）。

圖1 pp220跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖2 信號(hào)肽分析結(jié)果

2.3 蛋白抗原指數(shù)、親水性、表面可及性、滴定曲線分析結(jié)果

抗原指數(shù)、親水性、表面可及性分析結(jié)果見圖3，由圖3可見pp220蛋白抗原指數(shù)分布較寬，區(qū)域相對(duì)集中、連續(xù)，并且大部分區(qū)域顯示為親水區(qū)域，疏水氨基酸占比35.54%，這與ProtParam蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。蛋白表面可及性分析結(jié)果顯示，露出表面的序列位置主要集中在4-14、27-34、44-49、84-89、96-106、113-116、204-207、223-230、245-256、308-327、350-358、366-387、394-408、454-463、476-487、504-513、549-554、561-576、591-600、632-640、681-686、740-745、824-829、845-850、874-881、925-928、962-967、984-992、1011-1017、1023-1027、1034-1037、1043-1050、1062-1071、1088-1092、1098-1103、1106-1113、1131-1138、1184-1188、1205-1209、1250-1255、1261-1267、1288-1294、1298-1303、1326-1331、1352-1355、1371-1379、1392-1400、1420-1429、1437-1442、1449-1461、1473-1478、1498-1509、1517-1520、1527-1536、1539-1544、1560-1567、1592-1600、1606-1611、1626-1635、1649-1656、1705-1709、1741-1745、1795-1803、1815-1824、1868-1871、1878-1888、1911-1914、1924-1928、1943-1948、1957-1963、1973-1988、2014-2020、2034-2047、2054-2065、2108-2113、2127-2136、2145-2151、2182-2186、2195-2206、2213-2220、2230-2237、2281-2291、2326-2335、2359-2366、2373-2381、2394-2397、2402-2410、2431-2435、2460-2471，共89個(gè)區(qū)域。蛋白滴定曲線分析結(jié)果見圖4。

圖3 蛋白抗原指數(shù)、親水性、表面可及性分析結(jié)果

圖4 pp220蛋白滴定曲線

2.4 pp220優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果

綜合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果及B細(xì)胞表位分析結(jié)果，選取二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果中去除α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等不易形成抗原表位的區(qū)域之外與B細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果重合區(qū)域的肽段，作為備選的優(yōu)勢(shì)抗原，通過整合結(jié)果，得到53條優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原序列，詳見表1。

表1 pp220優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.5 pp220優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果

綜合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果及T細(xì)胞表位分析結(jié)果，選取二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果中去除α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等不易形成抗原表位的區(qū)域之外與T細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果重合區(qū)域的肽段，作為備選的優(yōu)勢(shì)抗原，再篩選強(qiáng)親和力（strong binding，SB）的肽段，得到23條優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原序列，詳見表2。

表2 pp220優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.6 基于HLJ/2018株非洲豬瘟病毒pp220的進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果

通過NCBI BlastP程序搜索pp220蛋白序列，選取與pp220蛋白長(zhǎng)度相近的豬源非洲豬瘟病毒pp220蛋白序列作為分析序列，篩選出其余14條序列進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析。結(jié)果顯示， HLJ株pp220蛋白與格魯吉亞2007/1、2008/1株同屬一個(gè)分支，為基因Ⅱ型。從進(jìn)化樹上也可以看出，贊比亞主要流行基因Ⅰ型，肯尼亞流行IX、X型，并且烏干達(dá)2015年分離的病毒也屬基因IX型，剛果2019年分離的病毒屬于基因X型。

3 討論

CP2475L基因是非洲豬瘟病毒基因組中的一個(gè)大基因，其編碼pp220多聚蛋白前體，共含有2 476個(gè)氨基酸，pp220蛋白前體經(jīng)酶解后加工形成病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白p150、p37、p34和 p14，對(duì)病毒的組裝成熟有重要作用[3]。

文章通過生物信息學(xué)手段分析了CP2475L基因編碼蛋白pp220的基礎(chǔ)信息，結(jié)果表明pp220為帶負(fù)電的酸性親水穩(wěn)定蛋白，抗原指數(shù)分布較寬，不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽。Andres G.等[1]的研究推測(cè)pp220可能作為一個(gè)蛋白支架作用，連接核衣殼和外部包膜，但生物信息學(xué)分析結(jié)果表明pp220蛋白不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽，由此推測(cè)pp220可能更多地作為蛋白支架作用，維持病毒粒子完整，而CP2475L基因的抑制表達(dá)導(dǎo)致的病毒DNA的部分缺失可能是由于pp220蛋白經(jīng)酶解加工后的產(chǎn)物與其他基因的編碼蛋白相互作用導(dǎo)致的。

文章分別通過兩種分析方法對(duì)pp220蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和B、T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行綜合分析，避免了單種分析方法的缺陷和不準(zhǔn)確性，經(jīng)過篩選，pp220蛋白有53條優(yōu)勢(shì)的B細(xì)胞抗原表位序列，并篩選到了23條強(qiáng)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位區(qū)域。優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位區(qū)域相對(duì)較少，由此推測(cè)單獨(dú)通過pp220構(gòu)建表位疫苗能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體，但是通過細(xì)胞免疫殺死病毒的能力相對(duì)較弱。通過Protean模塊分析的蛋白表面可及性表明，蛋白有89個(gè)區(qū)域有連續(xù)暴露在外的氨基酸序列，與篩選出來的優(yōu)勢(shì)B、T細(xì)胞抗原表位結(jié)果一致，這些區(qū)域可作為靶向藥物、表位疫苗篩選的對(duì)象。

圖5 pp220進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果

基于HLJ/2018株非洲豬瘟病毒pp220蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，HLJ株與格魯吉亞流行株同屬一個(gè)分支，均為基因Ⅱ型，目前報(bào)道的非洲豬瘟病毒至少有24個(gè)基因型，歐洲主要流行基因Ⅰ型和Ⅱ型，亞洲流行主要基因Ⅱ型。但中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所對(duì)2020年國(guó)內(nèi)采集的樣品分析結(jié)果顯示，中國(guó)已經(jīng)有自然變異的毒株出現(xiàn)，分離到的22株病毒均有不同程度的變異，包括核苷酸突變、缺失、插入或短片段替換等，其中11株病毒存在核苷酸突變或缺失：HLJ/HRB1/20病毒在EP402R基因的第43-67位缺失25個(gè)核苷酸；9株病毒存在G131A突變；3株湖北分離株還存在G178A和G242A突變；HeB/Q3/20存在C301T突變，變異毒株表現(xiàn)趨勢(shì)為低致死率、低毒力，臨床癥狀進(jìn)一步弱化，水平傳播能力增強(qiáng)，這對(duì)我國(guó)非洲豬瘟的防控是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[16]。

文章對(duì)HLJ/2018豬非洲豬瘟病毒pp220蛋白進(jìn)行了一系列的基礎(chǔ)生物信息學(xué)分析，分析結(jié)果進(jìn)一步充實(shí)了非洲豬瘟病毒的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，以期能夠?yàn)榉侵挢i瘟的防控提供基礎(chǔ)信息和方向。