增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體、房水和血漿中VEGF表達(dá)與IL-6，IL-8和TNF-α水平的相關(guān)性研究

張 勁,明 媚

(鄂東醫(yī)療集團(tuán)中心醫(yī)院, 湖北黃石 435000)

增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR) 是高血糖介導(dǎo)的視網(wǎng)膜病理改變，是糖尿病患者視力損害的主要原因[1]。我國糖尿病患者中PDR 約占2.8%，發(fā)生視力損害的DR 占4.0%～6.0%[2]。視網(wǎng)膜新生血管形成是PDR 的主要病理特征，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是參與視網(wǎng)膜新生血管眾多促血管生成因子中與PDR 關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子之一[3]?，F(xiàn)代研究顯示PDR 是一種慢性低度炎癥反應(yīng)過程[4]，長期高血糖狀態(tài)下的視網(wǎng)膜慢性炎癥可導(dǎo)致其微血管系統(tǒng)功能失調(diào)[5]，導(dǎo)致新血管形成和纖維改變[6]。炎癥細(xì)胞因子與VEGF 在PDR 發(fā)病機(jī)制中是否存在關(guān)聯(lián)尚不明確，VEGF 在外周血漿和房水中與眼內(nèi)表達(dá)差異尚不清楚，炎性細(xì)胞因子在血漿中研究較多，在房水和眼內(nèi)表達(dá)尚不清楚。鑒于此，本研究擬通過比較PDR 患者玻璃體、房水、血漿中VEGF，白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)，白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）變化，探討VEGF與IL-6，IL-8，TNF-α 的相關(guān)性，以進(jìn)一步闡述PDR 發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016年5月～2019年6月我院眼科收治的76 例行玻璃體切割治療的PDR患者（PDR 組），納入標(biāo)準(zhǔn)：①2017年版《中國2 型糖尿病防治指南》[7]；②單側(cè)眼病變，符合2002年國際糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[8]；③無糖尿病腎病、糖尿病足等其它糖尿病并發(fā)癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①1 型糖尿病或并發(fā)糖尿病酮癥酸中毒，高滲性非酮癥性糖尿病昏迷，低血糖昏迷等嚴(yán)重并發(fā)癥；②既往眼部手術(shù)史，眼內(nèi)注射抗VEGF制劑者；③感染性角膜炎、急性虹膜睫狀體炎、前房積膿等眼部感染或全身感染；④并發(fā)白內(nèi)障，黃斑水腫、青光眼等其它眼科疾病者。其中男性51 例，51 眼，女性25 例，25 眼，年齡53～72 歲，平均年齡62.35±4.52 歲，糖尿病病程9～17年，平均13.31±2.26年；PDR 病變程度：Ⅲ期24 例，Ⅳ期38 例，Ⅴ期14 例。同期于我院眼科就診的42 例行超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)治療的白內(nèi)障患者（對(duì)照組），均排除其它眼部疾病和全身系統(tǒng)性疾病，男性29 例，29 眼，女性13 例，13 眼，年齡55～75 歲，平均年齡62.91±4.67 歲。兩組年齡、性別、患眼數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），本研究獲得我院倫理會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均知情同意簽署同意書。

1.2 儀器與試劑 TDZ4-WS 低速自動(dòng)平衡離心機(jī)購自長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，超低溫冰箱購自Thermo Fisher 公司。BIOBASE2000 意大利全自動(dòng)酶免分析儀，試劑盒購自美國Epitope Diagnostics 公司。

1.3 方法 標(biāo)本采集：PDR 患者均采集血漿、房水和玻璃體標(biāo)本，對(duì)照組均采集血漿和房水標(biāo)本。采集清晨空腹12h 以上靜脈血3ml 注入抗凝試管，4℃ 3 000r/min 離心15min( 離心半徑10cm)，取血漿-80℃保存，48h 內(nèi)完成檢測(cè)。房水采集方法：開瞼，常規(guī)消毒結(jié)膜囊，生理鹽水沖洗后無菌紗布拭干，于眼球切口前采用1ml無菌注射器抽取約0.15ml 房水，注入無菌試管中-80℃保存待檢。玻璃體標(biāo)本采集方法：玻璃體切割術(shù)中，在切割開口處采用1ml 無菌注射器抽取約0.8ml 玻璃體，注入無菌試管中-80℃保存待檢。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定VEGF，IL-6，IL-8 和TNF-α 水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Kolmogorov-Smirnov，levene 法 檢 驗(yàn)VEGF，IL-6，IL-8 和TNF-α 等計(jì)量資料符合正態(tài)分布，具備方差齊性，以(±s)表示，玻璃體、房水、血漿中變量比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，PDR 組和對(duì)照組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。性別、患眼分布以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。Pearson 相關(guān)分析PDR 患者玻璃體、房水、血漿VEGF 與L-6，IL-8，TNF-α 的相關(guān)性，所有統(tǒng)計(jì)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PDR 組和對(duì)照組血漿房水VEGF，IL-6，IL-8，TNF-α 水平比較 見表1。PDR 組血漿VEGF，IL-6，IL-8 和TNF-α 水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。PDR 組房水中VEGF，IL-6，IL-8，TNF-α 水平均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 PDR 組和對(duì)照組房水VEGF，IL-6，IL-8，TNF-α 水平比較（±s）

表1 PDR 組和對(duì)照組房水VEGF，IL-6，IL-8，TNF-α 水平比較（±s）

項(xiàng) 目血漿tP房水tP PDR 組（n=76） 對(duì)照組（n=42）PDR 組（n=76） 對(duì)照組（n=42）VEGF（pg/ml）53.51±10.6215.62±3.5122.4180.000332.16±26.3536.23±6.5971.4330.000 IL-6（pg/ml）125.64±15.3429.65±8.5737.4090.000295.25±21.4392.35±15.0854.3290.000 IL-8（pg/ml）102.35±11.3521.35±6.2542.7540.000261.35±25.4985.62±13.2641.6200.000 TNF-α（ng/ml）12.65±3.264.52±0.6515.9590.00021.26±4.2616.35±5.415.4350.000

2.2 PDR 患者自身玻璃體、房水和血漿VEGF，IL-6，IL-8，TNF-α 水平比較 見表2。PDR 患者自身玻璃體、房水和血漿VEGF，IL-6，IL-8，TNF-α 水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。PDR 患者玻璃體VEGF，IL-6，IL-8，TNF-α 水平高于房水和血漿，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），房水VEGF，IL-6，IL-8，TNF-α 水平高于血漿，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 PDR 患者自身玻璃體、房水和血漿中VEGF，IL-6，IL-8，TNF-α 水平比較（n=76，±s）

表2 PDR 患者自身玻璃體、房水和血漿中VEGF，IL-6，IL-8，TNF-α 水平比較（n=76，±s）

項(xiàng) 目玻璃體房水血漿FP VEGF（pg/ml）695.32±43.65332.16±26.3553.51±10.6246.3590.000 IL-6（pg/ml）362.51±25.34295.25±21.43125.64±15.3458.2650.000 IL-8（pg/ml）395.26±34.16261.35±25.49102.35±11.3547.2650.000 TNF-α（ng/ml）32.65±6.5921.26±4.2612.65±3.2639.5620.000

2.3 PDR 患者玻璃體、房水和血漿VEGF 與IL-6，IL-8，TNF-α 的相關(guān)性 PDR 患者玻璃體中VEGF水平與IL-6，IL-8，TNF-α呈正相關(guān)（r=0.841，0.800，0.787，均P=0.000），見圖1。PDR 患者房水中VEGF 水平與IL-6，IL-8，TNF-α 無明顯相關(guān)性（r=0.461，0.565，0.439，均P=0.000），見圖2。PDR 患者血漿中VEGF 水平與IL-6，IL-8，TNF-α無關(guān)（r=0.218，0.131，0.210，P=0.058，0.258，0.069），見圖3。

圖1 PDR 患者玻璃體中VEGF 水平與IL-6，IL-8，TNF-α 散點(diǎn)圖

圖2 PDR 患者房水中VEGF 水平與IL-6，IL-8，TNF-α 散點(diǎn)圖

圖3 PDR 患者血漿中VEGF 水平與IL-6，IL-8，TNF-α 散點(diǎn)圖

3 討論

PDR 是糖尿病常見的不可逆的致盲性疾病，視網(wǎng)膜微血管病變是其主要病理特征，視網(wǎng)膜病變經(jīng)歷了早期毛細(xì)血管內(nèi)皮功能破壞、基底膜增厚、微血管瘤形成、血視網(wǎng)膜屏障破壞到晚期的視網(wǎng)膜缺血水腫、纖維增生以及新生血管形成[9]。新生血管排列紊亂、血管壁不完整脆性大、易滲漏導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫、新生血管形成是PDR 視力喪失的主要原因[10]。視網(wǎng)膜新生血管的形成是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，其發(fā)生機(jī)制尚不十分明確，近年來研究發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)參與視網(wǎng)膜毛細(xì)血管損傷、炎癥因子與PDR 發(fā)生發(fā)展存在一定相關(guān)性，炎性細(xì)胞因子可能為PDR 診斷、病情評(píng)估、治療提供關(guān)鍵線索[11-12]。

VEGF 是最強(qiáng)的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成因子，正常人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞低度表達(dá)VEGF，VEGF 對(duì)維持視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)穩(wěn)定性和正常功能具有重要作用。在高血糖刺激下VEGF 可通過與其它細(xì)胞因子相互作用、破壞血-視網(wǎng)膜屏障、促使新生血管形成等多種途徑參與視網(wǎng)膜病變[13]。本研究PDR 組玻璃體、房水、血漿中VEGF 水平明顯高于對(duì)照組，在血漿、房水和玻璃體中VEGF 水平呈增高趨勢(shì)，與何香蓮[14]報(bào)道結(jié)果一致，說明PDR 患者存在血-視網(wǎng)膜屏障破壞，血漿VEGF 不能作為PDR 眼內(nèi)新生血管形成的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。VEGF 在血漿、房水、玻璃體水平差異原因?yàn)椴Ａw是PDR 視網(wǎng)膜病理事件的主要部位，玻璃體中VEGF 由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在缺血缺氧刺激下直接分泌，VEGF 通過與受體結(jié)合破壞血-視網(wǎng)膜屏障，釋放入玻璃體。玻璃體中VEGF 通過房水?dāng)U散進(jìn)入房水，導(dǎo)致房水VEGF 增高。血漿中VEGF 增高可能與高血糖刺激下機(jī)體廣泛組織缺氧導(dǎo)致VEGF 產(chǎn)生增多有關(guān)。

本研究觀察PDR 組玻璃體、血漿和房水中IL-6，IL-8，TNF-α 水平均高于對(duì)照組，說明炎性細(xì)胞因子參與PDR 發(fā)病過程。IL-6 是前炎性細(xì)胞因子，高血糖刺激下IL-6 水平明顯升高，通過誘導(dǎo)T細(xì)胞、PDR 免疫調(diào)節(jié)過程[15]。臨床報(bào)道同樣顯示糖尿病視網(wǎng)膜病變患者IL-6 表達(dá)普遍偏高，而PDR患者IL-6 表達(dá)與非PDR 患者相比更高[16]。IL-8 參與糖尿病視網(wǎng)膜毛細(xì)血管損傷，PDR 患者血清IL-8水平明顯升高，PDR 患者玻璃體IL-8 水平高于視網(wǎng)膜前膜、黃斑裂孔、葡萄膜炎患者[17]。TNF-α 可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞連接，破壞血-視網(wǎng)膜屏障，促使視網(wǎng)膜從非增殖狀態(tài)向新生血管轉(zhuǎn)變、加重視力損害[18]。本研究相關(guān)性分析PDR 患者玻璃體中IL-6，IL-8，TNF-α 水平均與VEGF 水平呈正相關(guān)性，提示IL-6，IL-8 和TNF-α可能在PDR 視網(wǎng)膜新生血管形成方面發(fā)揮促進(jìn)作用。IL-6 在缺血刺激下由視網(wǎng)膜、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，并促使其它炎性因子如IL-8 生成，IL-6 也可直接誘導(dǎo)VEGF 產(chǎn)生，通過VEGF 促使新生血管形成。VEGF 表達(dá)降低時(shí)可誘發(fā)IL-6 表達(dá)，進(jìn)而加重炎性反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，加劇PDR 病情[2]。IL-8 能刺激成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，且可不依賴VEGF 促進(jìn)脈絡(luò)膜新生血管形成[19]。TNF-α 表達(dá)增加可引起視網(wǎng)膜通透性增高，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，誘導(dǎo)血管外基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，形成新生血管[20]?？梢娧仔约?xì)胞因子與VEGF 在PDR 發(fā)病、發(fā)展過程中起到重要作用，視網(wǎng)膜局部炎性反應(yīng)刺激VEGF 產(chǎn)生，促使視網(wǎng)膜新生血管形成是PDR 的主要發(fā)病機(jī)制之一。本研究相關(guān)性分析顯示房水中、血漿中IL-6，IL-8 和TNF-α 水平與VEGF 水平無關(guān)，說明患眼局部炎性反應(yīng)和視網(wǎng)膜新生血管形成是PDR 的主要病理事件發(fā)生場(chǎng)所，檢測(cè)血漿和房水中IL-6，IL-8，TNF-α 和VEGF 水平尚不能有效反映PDR 病變情況。

綜上，VEGF，IL-6，IL-8 和TNF-α 均參與PDR視網(wǎng)膜新生血管形成過程，IL-6，IL-8 和TNF-α 可能誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞VEGF 表達(dá)，發(fā)揮刺激視網(wǎng)膜新生血管生成作用。VEGF，IL-6，IL-8 和TNF-α 相互作用促進(jìn)新生血管形成可能主要局限于眼部，僅檢測(cè)外周血漿和房水不能有效評(píng)估PDR 病情。鑒于IL-6，IL-8 和TNF-α 在PDR 病情發(fā)展中的作用，抑制IL-6，IL-8 和TNF-α 水平可能有助于抑制VEGF 表達(dá)，為PDR 治療提供新靶點(diǎn)和方向。