不同沖擊性負荷運動對小鼠Wnt信號通路及骨合成代謝的影響

楊念恩 王娜

摘 要：目的：尋求有利于骨量積累和提高峰值骨量的運動方式，并探討不同沖擊性負荷對骨合成代謝的影響及其分子生物學機制。方法：C57BL/6小鼠48只，分成下坡跑臺（DT）組、平坡跑臺（T）組、游泳（S）組和對照（C）組，每組12只。DT組、T組和S組小鼠每組8只，分別進行下坡跑臺訓練、平坡跑臺訓練和游泳訓練，C組小鼠不訓練。訓練8周后，取左后肢用原子吸收分光光度法測脛骨骨礦含量，取右后肢用熒光定量PCR法測Wnt信號通路相關蛋白的mRNA表達;每組4只小鼠，取間充質干細胞培養(yǎng)后誘導分化，用于成骨細胞基因表達、ALP染色和Von Kossa染色。結果：（1）8周運動后，與C組相比，DT組（P<0.01）和T組（P<0.05）小鼠脛骨無機鹽中鈣含量均顯著提高，DT組和T組脛骨無機鹽中磷的含量均顯著提高（P<005），而S組與C組相比，鈣和磷含量均無差異（P>0.05）。在3個運動組比較中，DT組鈣和磷含量提高最多。（2）8周運動后，不同方式運動對Wnt信號通路中Fz、DVL、β-catenin、Rock、JNK的mRNA表達產生顯著影響（P<0.05）;（3）4組小鼠原代間充質干細胞分化后ALP和OCN基因表達差異顯著，ALP活性及礦化結節(jié)也明顯不同。結論：高沖擊性負荷運動顯著提高生長期小鼠脛骨骨鹽中鈣和磷元素含量，提高骨強度。不同沖擊性負荷運動調節(jié)骨合成代謝的途徑不同，高沖擊性負荷運動激活Wnt/PCP信號通路，下調通路中效應蛋白ROCK和JNK的基因表達，促進骨合成代謝;低沖擊性負荷運動運動激活經(jīng)典Wnt信號通路，調節(jié)骨合成代謝。高沖擊性負荷運動對ALP和OCN基因表達影響更顯著，通過ALP活性和骨礦化調節(jié)骨的理化特性。

關鍵詞：下坡跑臺運動;骨合成代謝;骨礦含量;標志基因; 骨礦化結節(jié)

中圖分類號：G804.2 ? 文獻標識碼：A ?文章編號：1006-2076（2021）02-0088-07

Abstract：Objective：The purpose of this study is to find out the movement mode which is beneficial to bone mass accumulation and increase the peak bone mass， and to explore the influence of different impact loading on bone synthesis and metabolism and its molecular biological mechanism. Methods：48 C57BL/6 mice were divided into DT group， T group， S group and C group， 12 in each group. In DT group， T group and S group， 8 mice in each group were trained in downhill running platform， treadmill exercise and swimming， respectively. After 8 weeks of training， bone mineral content of tibial in mice was determined by atomic absorption method. The mRNA expression of wnt signaling pathway-related proteins was measured by fluorescence quantitative PCR， and the material was taken from the right hind limb. Four mice in each group were sacrificed， take mesenchymal stem cell culture and then induce differentiation， and which can be used to detect gene expression. It can also be used for ALP staining and Von kossa staining. Results：（1） The calcium content in DT group （P<0.01） and T group （P<0.05） was significantly increased after 8 weeks of exercise compared with the C group. The contents of phosphorus in tibial inorganic salt in DT and T groups were significantly increased （P<0.05）. There was no difference in calcium and phosphorus content between the S group and the C group （P>0.05）. Among the three exercise groups， the calcium and phosphorus contents of DT group increased most. （2） After 8 weeks of exercise， different modes of exercise had a significant effect on the mRNA expression of Fz， DVL、β-Catenin、Rock、JNK genes in Wnt signaling pathway （P<0.05）; （3） It was significantly different that the expression of ALP and OCN genes after differentiation of primary mesenchymal stem cells in four groups of mice. Moreover， the activity of ALP and the mineralized nodules were also significantly different. Conclusion：High impact loading exercise significantly increased the content of calcium and phosphorus in tibial bone and increased bone strength. The pathways of regulating bone synthesis metabolism by different impact loading exercise are different. High impact loading activates Wnt/PCP signaling pathway and then down-regulates gene expression of effector protein ROCK and JNK， and promotes bone synthesis metabolism. Low impact loading exercise activates classical Wnt signaling pathway and regulates bone synthesis metabolism. The effect of high impact loading exercise on ALP and OCN gene expression was more significant， and the physicochemical properties of bone were regulated by ALP activity and bone mineralization.

Key words： downhill running; bone synthesis metabolism;bone mineral content; marker gene; osteomineralized nodules

不同方式的運動對骨代謝產生不同的影響，研究較多的運動方式是有氧運動和抗阻運動，并且認為抗阻運動對骨的影響要大于有氧運動 [1]。Schipilow [2]等人探討肌肉力量與骨質之間的關系，發(fā)現(xiàn)高山滑雪運動員、足球運動員和游泳運動員之間的肌肉力量沒有差異，而高山滑雪運動員和足球運動員的骨密度、皮質骨厚度、破壞載荷（failure load）都顯著大于游泳運動員，認為沖擊性負荷（impact loading）對骨質影響更為顯著。像縱跳和下坡跑這種對骨垂直于地面作用力強的運動能夠提高骨密度，增加骨形成。運動鍛煉在骨量的積累和維持過程中起到至關重要的作用，能有效提升骨礦含量，提高幅度能夠達到9 ～17 [3]。在可承受范圍內，骨礦含量和骨所承受的壓力強度升高的幅度跟運動強度之間具有量效關系。

在調節(jié)骨代謝的信號轉導通路中，Wnt信號通路起到關鍵作用。Wnt 信號途徑有三條胞內轉導通路，分別是Wnt/β-catenin 通路、Wnt/Ca2+ 通路、Wnt / PCP 通路，其中Wnt/β-catenin 通路是經(jīng)典的信號通路，作用于成骨細胞前體，促使它們分化為成熟的成骨細胞，并且在成熟的成骨細胞中調節(jié)RANKL/OPG的比率，抑制骨吸收[4]。其他兩條非經(jīng)典的Wnt信號轉導通路通過抑制γ過氧化物酶體增生受體（PPARγ）的表達促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化，促進骨合成代謝[5]，也能夠通過RANKL誘導破骨細胞形成[6]。游泳時骨骼只受到剪切力，沒有來自于地面沖擊力;而下坡跑時骨骼受到的地面沖擊力比較大，平坡跑時骨骼受到的地面沖擊力介于下坡跑和游泳之間。針對骨骼受地面沖擊力的不同，設計該運動方案，探討不同的沖擊性負荷是否影響生長期小鼠的骨合成代謝，具體觀察不同沖擊性負荷對小鼠骨礦含量產生怎樣影響，分析不同沖擊性負荷對Wnt信號通路和骨合成標志物基因表達的影響，研究不同沖擊性負荷影響骨合成代謝的生理機制。

1 實驗動物及方法

1.1 實驗動物

5周齡雄性C57BL/6小鼠（清潔級），許可證號：使用許可SYXK（滬）2013-0062，體重（15.76±0.63）g，購回后于動物房分籠飼養(yǎng)，每籠8只。國家標準嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，自由飲食和飲水。每周更換墊料1～2次，環(huán)境溫度為23℃±2℃，相對濕度為50 ，自然晝夜照明，遵循12 h/12 h明暗周期。

1.2 實驗方案

（1）動物分組：C57BL/6小鼠48只，分為4組，下坡跑臺組（DT組）、平坡跑臺組（T組）、游泳組（S組）、安靜對照組（C組），每組12只。其中DT組、T組和S組小鼠每組8只，分別進行下坡跑臺訓練、平坡跑臺訓練和游泳訓練，C組小鼠不訓練。訓練8周后，用于檢測脛骨骨礦含量和Wnt信號通路相關蛋白的mRNA表達;另有每組余下4只小鼠，用于檢測成骨細胞基因表達、ALP染色和Von Kossa染色。

（2）訓練方案：①下坡跑組（DT組）：速度0.8 km/h，坡度-9°; ②平坡跑臺組（T組），速度0.8 km/h，坡度為0°;③游泳組（S組）：游泳訓練池大小為50 cm×50 cm×60 cm，水深45 cm，水溫30℃±2℃;當小鼠漂浮不動時用毛刷攪動驅趕。以上三種方式訓練持續(xù)時間為40 min， ④安靜對照組（C組）：與其他組小鼠一起飼養(yǎng)，無運動干預。適應性喂養(yǎng)1周后于晚6點對小鼠進行一次適應性訓練，隔兩天后，按上述運動方案訓練，18：00-19：00訓練，5天/周，共8周。

（3）取材：最后一次訓練結束后靜置24 h，斷頸椎處死。取左后肢保留軟組織，用于骨礦含量檢測。取右后肢用于骨組織基因mRNA表達檢測;取骨髓間充質干細胞（ bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MSCs） 進行細胞原代培養(yǎng)并誘導其向成骨細胞（osteoblast，OB）分化，分化后堿性磷酸酶（ALP）染色測成骨細胞活性， Von Kossa染色檢測成骨細胞礦化結節(jié)能力。

1.3 指標檢測

1.3.1 運動后小鼠骨礦含量檢測

取出完整脛骨，去除附著肌肉組織，用三氯甲烷，甲醇混合液（2 ∶ 1）脫脂72 h，在環(huán)流熱空氣高熱箱中120℃烘6 h，冷卻后在萬分之一天平上稱取重量為干重（g）;置馬福爐內600℃下灰化6 h至成白色粉末狀，干燥冷卻后用天平稱取重量為灰重（g）。干骨中無機鹽含量比值=灰重/干重;灰化骨用濃硝酸消解，待測消解后樣本溶液進入原子吸收分光光度計對鈣、磷元素進行測量。

1.3.2 運動后小鼠骨組織相關基因mRNA表達檢測

利用Trizol法提取總RNA，按照PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）說明書進行逆轉錄，將反轉錄好的cDNA作為模板進行PCR擴增。PCR 擴增采用三步法擴增，擴增條件為95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，45個循環(huán)。根據(jù)PCR 擴增儀中的各反應孔的數(shù)值，以β -actin 為內參，根據(jù)公式2-△△CT 計算最后目的基因的相對表達量。引物序列利用Primer premer軟件進行設計，由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

1.3.3 MSCs成骨誘導分化后成骨標志mRNA檢測、ALP染色和Von Kossa染色

8周運動后將小鼠斷頸椎處死，75 酒精浸泡5 min，無菌條件下取股骨和脛骨，剔除附著肌肉;用緩沖液沖洗2次，剪掉兩端關節(jié)，再用無菌 20 ml 注射器及 25 號針頭，吸取配好的間充質干細胞培養(yǎng)基沖洗髓腔，收集細胞，取MSCs放入4個6 cm培養(yǎng)皿中，加3 ml培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后，在間充質干細胞培養(yǎng)基添加誘導劑（osteogenic stimuli， OS），誘導劑配方：0.1 μM地塞米松+0.2 mM維生素c+10 mMβ-甘油磷酸鈉。中間隔一天換一次液，成骨分化10天時分別提取各組成骨細胞總RNA，進行qRT-PCR檢測，每組做3個平行檢測。

將DT組、T組、S組和C組小鼠原代MSCs接入12孔板，每組3個復孔，每孔細胞數(shù)目為1×105個，干細胞培養(yǎng)基1 ml，待細胞長至85 匯合時，誘導分化，在誘導分化7天時進行染色。將12孔板中培養(yǎng)基甩掉，PBS洗一次，加入4 PFA固定15 min，加入剛配好的ALP染液（0.2M pH值9.4馬來酸加0.01 Naphthol AS-TR phosphate disodium salt 和0.06 ?FastRed Vilot。），背光20 min后棄染液，每孔加入微量雙蒸水，用相機拍照。

4組小鼠原代MSCs計數(shù)后接入6孔板，每孔細胞數(shù)目為2×105個，每組3個復孔，培養(yǎng)5～10天。細胞長至85 匯合時誘導分化，隔一天換一次培養(yǎng)基。當在顯微鏡下能看到許多細胞分泌的黑色小顆粒時，開始染色。培養(yǎng)板用PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定5分鐘，雙蒸水沖洗3次，加入2.5%硝酸銀溶液1ml，將培養(yǎng)板開蓋在紫外燈下照射1小時，倒出殘留的硝酸銀溶液，用蒸餾水沖洗3遍，入5%硫代硫酸鈉溶液1 ml，中和殘留的硝酸銀溶液，吸出殘液，將培養(yǎng)板室倒置放于吸水紙上，晾干后拍照。

1.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)使用平均數(shù)±標準差（±SD）表示。以C組作為無運動干預的對照組，對S組、T組和DT組的訓練效果進行分析。對骨礦含量和Wnt信號通路蛋白mRNA表達指標進行以訓練方案作為主因子的單因素方差分析，用多重比較LSD法分析不同訓練方案所產生的差異。統(tǒng)計軟件為SPSS18.0，取P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01具有非常顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 不同方式運動后小鼠骨礦含量

8周不同方式運動后小鼠脛骨骨礦含量通過灰化和原子吸收分光光度法檢測，該法測定骨磷、鈣含量，精密度和準確度都很高。將數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，4組小鼠脛骨灰重/干重組間不存在顯著性差異;但是與C組相比，DT組（P<0.01）和T組（P<0.05）脛骨無機鹽中鈣含量均顯著提高，DT組和T組脛骨無機鹽中磷的含量均顯著提高（P<0.05），而S組與C組相比，鈣和磷含量均無差異（P>0.05）。在3個運動組比較中，DT組鈣和磷含量提高最多（見表2）。

2.2 不同方式運動后小鼠脛骨Wnt信號通路mRNA表達

8周訓練后取各組小鼠脛骨，抽提mRNA，通過qRT-PCR測基因表達，對脛骨中提取出Wnt信號通路蛋白的mRNA的表達進行相對定量，并對結果進行單因素方差分析和多重比較（如表3所示），結果顯示：8周運動后，不同方式運動對Wnt信號通路中Fz、DVL、β-Catenin、Rock、JNK的mRNA表達產生顯著影響（P<0.05）。

2.3 MSCs誘導分化后成骨活性及礦化結節(jié)染色結果

8周運動后小鼠原代MSCs誘導分化，檢測成骨細胞基因表達，用單因素方差分析和多重比較對檢測結果進行統(tǒng)計分析，不同組別小鼠成骨細胞特異性表達的基因ALP呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），OCN表達呈現(xiàn)非常顯著性差異（P<0.01）（見表4）。ALP表達差異主要表現(xiàn)在DT組，DT組ALP基因表達顯著下調;相對于C組，3個運動組OCN基因表達都顯著下調（P<0.01）。

由圖1可知DT組小鼠ALP活性要低于另外3組;由圖2可知，DT組和T組的礦化結節(jié)情況要好于S組和C組。

3 分析與討論

3.1 不同方式運動對脛骨骨礦含量的影響

骨鈣、磷含量的測定是綜合評價骨質疏松的重要指標之一，與骨密度的檢測結果具有較高的一致性，并且反映出骨礦含量的具體變化，能夠更細致地反映骨狀況。脛骨是主要的承重骨，密度較大，故脛骨骨鈣、磷含量的多少對骨強度的評價具有代表性意義。從骨無機鹽含量（灰重/干重）看，DT組和T組略高于C組和S組，組間差異不顯著。DT組和T組骨無機鹽中鈣、磷含量顯著高于C組，DT組鈣、磷含量也顯著高于S組，表明平坡跑臺和下坡跑臺這兩種有地面反作用力的沖擊性運動能夠顯著提高骨礦中鈣含量。究其原因，這與不同方式運動的運動強度不一致有關。有關運動強度與骨的研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)研究肯定運動強度與骨密度正相關[7-8]，部分研究認為運動強度對骨密度沒有顯著影響[9-10]。也有研究表明高強度運動抑制骨吸收和骨形成，即降低骨轉換;低強度運動抑制骨吸收，不影響骨形成，提高骨礦含量，增強骨強度，更有利于骨健康;另外，高沖擊力運動對骨轉換影響較顯著[11]。這些研究結果的不一致可能和實驗對象及其干預時間有關。

本研究表明，和游泳運動相比，跑臺運動促進骨礦含量增加的效果更顯著，這與所受地面沖擊性負荷的大小有關。游泳時，骨骼肌牽拉骨骼產生剪切力的作用，但是類似于失重狀態(tài)，沒有地面沖擊力負荷的作用，再者檢測骨礦所選取的骨骼是承重的下肢骨。

3.2 不同方式運動對Wnt信號通路mRNA表達影響

Wnt信號通路骨重建過程中起到?jīng)Q定性作用。Wnt配體是一種分泌型糖蛋白，與細胞膜表面受體Fz、LRP5/6結合，激活Wnt信號通路。在經(jīng)典Wnt信號通路中，F(xiàn)z和LRP5/6組成Wnt共受體，在受到Wnt配體激活后，F(xiàn)z受體募集DVL，LRP5/6募集Axin，致使GSK3β-Ck1-Axin-APC這一4聚體結構解聚，該4聚體能夠促進β-catenin磷酸化，磷酸化的β-catenin會被進一步泛素化降解。因此經(jīng)典Wnt信號通路的激活能夠抑制β-catenin降解，導致胞漿內β-catenin增多，更多的β-catenin跨膜轉運與Lef1/Tcf結合，活化Lef1/Tcf，激活Wnt靶基因轉錄[12]。

此外還有兩條非經(jīng)典的Wnt信號通路，Wnt/Ca2+和Wnt/PCP信號通路，在這兩條信號通路中，Wnt配體只和Fz受體結合激活下游細胞因子。在Wnt/PCP信號通路中，依賴于DVL激活Rho和Rac這兩種GTP 酶，隨后通過JNK （ c-Jun NH2-terminal kinase ）途徑激活下游靶基因的轉錄。Wnt/PCP信號通路主要調節(jié)軟骨細胞的生長增殖，調控骨的三維形狀[13-14]。

DVL作為Fz受體的下游蛋白，在經(jīng)典Wnt信號通路和Wnt/PCP信號通路中起到不同的作用。在經(jīng)典Wnt信號通路中， DVL通過磷酸化LRP6，促進了Wnt-LRP6/5-Fz聚合體的行程，激活下游通路，最終通過β-catenin轉運到核內促進靶基因的轉錄;在Wnt/PCP信號通路中， DVL通過和下游效應器結合，通過多條信號通路作用于肌動蛋白細胞骨架，調節(jié)骨的三維形狀。DVL的下游細胞因子中，JNK和ROCK起到重要作用，被作為該信號通路下游標志性蛋白。利用ROCK抑制劑條件性阻斷Wnt/PCP信號通路后，發(fā)現(xiàn)成骨細胞粘附性發(fā)生改變，成骨細胞分化能力和礦化能力增強，促進了骨合成代謝[15]，這表明了ROCK對骨形成起到負調節(jié)作用。

NLK（Nemo-like kinase）在體內調節(jié)多條信號通路，主要有Mapk信號通路和Wnt/Ca2+信號通路[16-17] 。NLK基因敲除小鼠在妊娠末期死亡，在NLK缺乏的情況下，在骨髓間充質肝細胞中會缺失骨襯細胞[18]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt配體Wnt1和Wnt5a通過MAPKKK TAK1活化NLK，NLK磷酸化一些特異性底物，其中包括TCF/Lef1，抑制了β-catenin和TCF/Lef1相結合，進而抑制Wnt信號通路靶蛋白的轉錄[19-20]。NLK過表達的成骨細胞ALP活性和礦化結節(jié)都變弱，NLK低表達的成骨細胞表現(xiàn)出相反的生理特性，這些證據(jù)表明，NLK對骨形成也是負向調節(jié)作用[21]。

NFAT（nuclear factor of activated T cells）表達下調的小鼠骨量和礦物沉積率都顯著增加，小梁骨厚度顯著變薄;這種小鼠骨髓間充質干細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，向成骨細胞分化明顯減少，向B淋巴細胞分化明顯增多[22]。也有研究發(fā)現(xiàn)NFAT也調節(jié)破骨細胞骨吸收代謝，注射NFAT抑制劑后，由手術引起的骨質溶解明顯降低[23]，該機制是通過調節(jié)TNF-α運行的[24]?？梢?，NFAT對骨形成的負向調節(jié)是通過骨形成和骨吸收兩個方面發(fā)揮作用的。

本研究發(fā)現(xiàn)，和C組相比，8周運動后S組小鼠脛骨Fz、LRP5/6、DVL、β-catenin、JNK、ROCK、NLK和NFAT基因表達都沒有顯著變化;DT組和T組小鼠脛骨Fz、DVL、ROCK和JNK基因表達與C組和S組相比都有顯著變化。8周跑臺運動和游泳運動后，小鼠骨密度顯著升高，不同方式運動對骨形成影響機制不同。跑臺運動過程中，除肌肉牽拉產生的剪切力外，地面反作用力會給小鼠骨骼一個縱向的沖擊力;游泳運動過程中，骨主要受到肌肉橫向剪切力作用。從Wnt信號通路來看，跑臺運動引起了Wnt 信號通路受體Fz和下游蛋白DVL基因表達的上調，F(xiàn)z受體在經(jīng)典Wnt信號通路、Wnt/PCP和Wnt/Ca2+信號通路這3條信號通路中都是作為Wnt配體的受體而發(fā)揮作用，DVL參與經(jīng)典Wnt信號通路和Wnt/PCP信號通路，至于跑臺運動具體激活的是哪一條信號通路，還要看Wnt信號通路下游效應蛋白的表達。8周跑臺運動引起脛骨ROCK和JNK基因表達的顯著下調，而β-catenin、NLK和NFAT基因表達沒有顯著變化，β-catenin是經(jīng)典Wnt信號通路中標志性效應蛋白，ROCK和JNK是Wnt/PCP信號通路中效應蛋白，NLK和NFAT是Wnt/Ca2+信號通路中的效應蛋白，這些結果顯示，8周跑臺運動激活Wnt信號通路，誘導Wnt/PCP信號通路中ROCK和JNK基因表達下調，促進骨合成代謝。

相對于平坡跑臺運動，游泳運動引起脛骨LRP6和β-catenin基因表達顯著上調;相對于下坡跑臺運動，游泳運動誘使脛骨β-catenin基因表達顯著上調。LRP5是經(jīng)典Wnt信號通路中的共受體，β-catenin是經(jīng)典Wnt信號通路中的標志性效應蛋白，結果表明游泳運動激活經(jīng)典Wnt信號通路，通過經(jīng)典Wnt信號通路調節(jié)下游蛋白轉錄合成進而調節(jié)骨合成代謝。

3.3 不同方式運動對小鼠OB成骨活性和礦化結節(jié)的影響

ALP和OCN被認為是成骨細胞特異性表達的標志物，一般用ALP活性和OCN表達來評價成骨細胞的成骨能力。本實驗研究結果顯示，各組原代MSCs誘導分化后ALP活性不同，T組和S組ALP活性更強。Kaspar[25]等人的研究顯示，機械負荷刺激能夠促進成骨細胞前體的增殖及其羧基端膠原蛋白1的合成，而ALP活性及其OCN的表達顯著降低。經(jīng)典Wnt信號通路的激活并不一定和成骨細胞的分化直接關聯(lián)，Boland[26]等人就報道了用Wnt3a激活經(jīng)典Wnt信號通路促進MSCs的增殖，卻抑制了成骨細胞的分化;Eijken[27]研究表明經(jīng)典Wnt信號通路激活抑制了ALP的活性。

OCN作為成骨能力指示劑，在成骨分化過程中其基因表達都顯著性下調。OCN在骨礦化峰期之后才出現(xiàn)積聚，是一種高度特異性的晚期成骨細胞標志物。OCN基因敲除小鼠出生時骨沒有出現(xiàn)異常，6個月后，骨密度和骨厚度都比野生型小鼠要高，表明OCN對骨形成是負向調節(jié)作用[28]。 本實驗基因檢測在誘導分化10天左右，此時骨礦化結節(jié)還沒有形成，此時OCN的表達量還較少，若在骨礦化峰期出現(xiàn)后，各組成骨細胞OCN基因表達量可能會有所改變。

骨礦化能力是成骨細胞成骨能力的主要標志，骨礦化決定了骨密度和骨強度。Von Kossa染色檢測細胞外機制礦化情況，反映骨礦化能力，由圖2可見，DT組和T組成骨細胞分化后礦化能力要優(yōu)于S組和C組，C組礦化能力最弱。運動對體內骨礦化具有非常重要的作用，運動后原代MSCs成骨分化后還保留著像體內類似的礦化能力，成骨細胞的礦化能力和OCN的表達密切相關[29-30]。實驗結果顯示，3個運動組OCN基因表達都顯著下調，而骨礦化能力都強于C組，提示分化中期OCN的低表達能夠促進成骨細胞礦化能力。

4 結 論

高沖擊性負荷運動顯著提高生長期小鼠脛骨骨鹽中鈣和磷元素含量，提高骨強度。不同沖擊性負荷運動調節(jié)骨合成代謝的途徑不同，下坡和平坡跑臺運動通過激活Wnt/PCP信號通路，下調通路中效應蛋白ROCK和JNK的基因表達，促進骨合成代謝;游泳運動通過激活經(jīng)典Wnt信號通路，調節(jié)下游靶蛋白轉錄合成進而調節(jié)骨合成代謝。高沖擊性負荷運動對ALP和OCN基因表達影響更顯著，通過ALP活性和骨礦化調節(jié)骨的理化特性。

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