治療牙周炎的乳桿菌篩選及口腔益生特性評(píng)價(jià)

徐晚晴,張秋香*,鄭彥懿,趙建新,馬方勵(lì)*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122) 2(無(wú)限極(中國(guó))有限公司,廣東 江門,519000)

牙周炎是一種發(fā)生在口腔支持組織的感染性炎癥疾病,通常伴隨口臭、牙齦腫痛出血、牙齒松動(dòng)、咀嚼功能紊亂等癥狀,同時(shí)也是成人牙齒缺失的首要原因[1]。越來(lái)越多的研究表明,牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)、中間普氏菌(Prevotellaintermedia)等牙周炎致病菌與多種全身疾病密切相關(guān),如糖尿病、阿爾茲海默癥、結(jié)腸癌等[2-3]。

牙周炎是多因素疾病,其中牙菌斑微生物及其產(chǎn)物是必不可少的始動(dòng)因子,除此以外,牙周炎的發(fā)生還受其他局部刺激因素的影響和全身因素的調(diào)控[4]。宿主與牙周炎致病菌之間的相互作用很大程度上決定了牙周炎的發(fā)展與嚴(yán)重程度。牙齦卟啉單胞菌和中間普氏菌是目前公認(rèn)的主要牙周炎致病菌。牙齦卟啉單胞菌可以侵入宿主細(xì)胞,釋放多種毒力因子,從而促進(jìn)骨質(zhì)的吸收和破壞,影響病變牙槽骨重建[5-6]。而中間普氏菌通過(guò)直接侵襲口腔細(xì)胞、干擾宿主的免疫反應(yīng)等方式造成牙周組織的破壞。除牙齦卟啉單胞菌和中間普氏菌外,在牙周炎患者病灶位點(diǎn)中也經(jīng)常檢測(cè)到具核梭桿菌[7]。具核梭桿菌能分泌多種凝集素,主導(dǎo)屬內(nèi)和屬間的細(xì)菌黏附共聚,其在牙菌斑生物膜的形成和成熟過(guò)程中,起到了“橋梁”作用[8]。

除牙菌斑微生物的作用外,牙齦組織的損傷更多由機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)引起[4]。雖然牙周組織被破壞的機(jī)制仍不完全明確,但隨著對(duì)牙周炎發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步了解發(fā)現(xiàn),牙菌斑微生物及其代謝產(chǎn)物可以刺激宿主引發(fā)炎癥反應(yīng),釋放白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種炎癥因子,引起牙周組織炎性損傷,最終導(dǎo)致牙槽骨喪失[8-9]。

目前治療牙周炎的方法主要為機(jī)械療法和藥物療法,但以牙周潔治術(shù)為主的機(jī)械療法無(wú)法預(yù)防牙周炎的發(fā)生,且容易產(chǎn)生牙齒酸痛、張口疲勞等癥狀[10];而藥物療法治療時(shí)間長(zhǎng),效果不明顯,長(zhǎng)期使用還容易破壞口腔微生態(tài)平衡[11]。因此,以乳酸菌為主的細(xì)菌替代療法受到了越來(lái)越多的關(guān)注。乳酸菌通過(guò)代謝抑菌產(chǎn)物、競(jìng)爭(zhēng)黏附致病菌所在位點(diǎn)、抑制致病菌的增殖和調(diào)節(jié)機(jī)體口腔免疫等,維持口腔微生態(tài)的平衡[12-13]。已有研究報(bào)道發(fā)酵乳桿菌、羅伊氏乳桿菌等益生菌在抑制口腔致病菌、降低生物膜量方面顯示出的良好效果[14-16]。但乳桿菌對(duì)牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌和中間普氏菌的混菌生物膜的抑制作用研究則鮮有報(bào)道。

本研究利用混菌生物膜模型和牙周炎細(xì)胞模型篩得2株具有抑制牙周炎生物膜形成,緩解口腔炎癥,調(diào)控緊密連接蛋白表達(dá)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM1137和發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)CCFM1139,并對(duì)其口腔益生特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

牙齦卟啉單胞菌ATCC33277；具核梭桿菌ATCC25586；中間普氏菌ATCC25611；實(shí)驗(yàn)所用204株乳桿菌均來(lái)自于江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)中心菌種保藏中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人源口腔上皮癌細(xì)胞Ca9-22,北納生物有限公司。

1.3 材料和試劑

MRS、BHI培養(yǎng)基,青島海博；溶菌酶,上海生物工程；氯化血紅素、結(jié)晶紫、乙醇等化學(xué)試劑,國(guó)藥集團(tuán)；維生素K1,阿拉丁；牙齦卟啉單胞菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),法國(guó)Invivogen公司；Trizol、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶,美國(guó)Gibco公司；PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒,美國(guó)Thermo Fisher公司；SYBR Green預(yù)混液,伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；人源TNF-α、IL-1β和IL-8 ELISA試劑盒,上海酶聯(lián)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,上海桑尼生物科技有限公司。

1.4 儀器設(shè)備

MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋,日本SANYO公司；SW-CJ-1CV型微生物操作超凈工作臺(tái),安泰空氣技術(shù)有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司；Multiscan Go 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo Fisher公司；DG250厭氧培養(yǎng)箱,華粵行儀器；PCR擴(kuò)增儀T100、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 菌懸液和上清液的制備

將活化3代后的牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌和中間普氏菌以2%的接種量接種至含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%氯化血紅素-維生素K1的BHI液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,調(diào)節(jié)3種菌懸液濃度至107CFU/mL。

乳桿菌活化3代后接種至MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,于4 ℃、12 000 r/min離心10 min,上清液經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾后于-20 ℃保存。

1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將Ca9-22細(xì)胞接種于含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、95%飽和大氣濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng),用2.5 g/L的胰酶進(jìn)行消化傳代,每隔2 d傳代1次,實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.5.3 生物膜量測(cè)定

在96孔板每孔中分別加入牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌和中間普氏菌菌懸液各40 μL,而后加入過(guò)濾后的乳桿菌上清液80 μL,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。陰性對(duì)照組以同體積的MRS代替乳桿菌上清液。

待培養(yǎng)結(jié)束后以PBS清洗生物膜2遍,用體積分?jǐn)?shù)為99%的甲醇固定15 min,室溫干燥10 min,室溫靜置晾干生物膜后向每孔中加入100 μL的1 g/L結(jié)晶紫溶液,將生物膜染色30 min,染色結(jié)束后以PBS清洗2遍。加入100 μL的95%乙醇溶解,置于搖床上振搖30 min,波長(zhǎng)600 nm下讀取吸光度值。按公式(1)計(jì)算生物膜減少量：

(1)

1.5.4 細(xì)胞炎癥因子測(cè)定

將已活化的Ca9-22細(xì)胞均勻鋪于6孔板中,每孔加入2 mL,調(diào)整濃度至2×105個(gè)/mL。培養(yǎng)2 h后,向每孔加入60 μL的乳桿菌上清液,并加入牙齦卟啉單胞菌LPS至終濃度為1 μg/mL,繼續(xù)孵育4 h。收集細(xì)胞上清液,使用商業(yè)ELISA試劑盒,參照說(shuō)明書(shū)測(cè)量細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-8的量。空白組未添加LPS和乳桿菌上清液；模型組只添加LPS不添加乳桿菌上清液。

1.5.5 細(xì)胞總RNA提取,cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將已活化的Ca9-22細(xì)胞均勻鋪于6孔板中,每孔加入2 mL,調(diào)整濃度至2×105個(gè)/mL。培養(yǎng)2 h后,向每孔加入60 μL的乳桿菌上清液,并加入牙齦卟啉單胞菌LPS至終濃度為1 μg/mL,繼續(xù)孵育12 h?？瞻捉M未添加牙齦卟啉單胞菌LPS和乳桿菌上清液；模型組只添加牙齦卟啉單胞菌LPS不添加乳桿菌上清液。而后,利用Trizol提取法提取細(xì)胞總RNA[17]。根據(jù)PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：cDNA模板 2 μL,上下游引物各1 μL,SYBR Green預(yù)混液10 μL,雙蒸水6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)熱2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)。上下游引物序列見(jiàn)表1。以內(nèi)參基因β-actin對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5.6 乳桿菌溶菌酶耐受能力評(píng)價(jià)

采用分光光度法考察乳桿菌對(duì)溶菌酶的耐受能力[18]。將乳桿菌菌懸液接種至96孔板中,分別加入不同濃度的溶菌酶溶液使得各孔終質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0 mg/mL。空白組以無(wú)菌水替代。37 ℃培養(yǎng)24 h后在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定吸光度。

1.5.7 乳桿菌自成膜能力評(píng)價(jià)

在96孔板中加入乳桿菌菌懸液各100 μL,37 ℃培養(yǎng)24 h后用結(jié)晶紫法測(cè)定生物膜量,用成膜能力強(qiáng)的具核梭桿菌作為對(duì)照菌[19]。

1.5.8 乳桿菌自聚、共聚能力評(píng)價(jià)

參考文獻(xiàn)[20-21]的方法測(cè)定乳桿菌的自聚能力,以及它們分別與牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌的共聚能力。測(cè)定時(shí)間分別為2、4、6、8 h。自聚集率按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中：Ac,自聚集率,%；A0,初始OD600值；Ax,靜止孵育xh后細(xì)菌懸液上清液的OD600值。

共聚集率按公式(3)計(jì)算:

(3)

式中：CC,共聚集率,%；Amix,混合物培養(yǎng)xh后的OD600值；Astrain,乳桿菌的初始OD600值；Apathogen,致病菌的初始OD600值。

1.5.9 統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)處理

本文中的所有圖形均采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行繪制。所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組間的顯著性差異采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析；實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表明數(shù)據(jù)分析結(jié)果呈顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于抑制生物膜形成量的菌株篩選

牙菌斑生物膜是牙周炎發(fā)病的起始因素。利用結(jié)晶紫染色法測(cè)定204株乳桿菌對(duì)混菌生物膜的抑制作用。結(jié)果顯示204株乳桿菌對(duì)生物膜的抑制率在0%～60%。按照生物膜減少量高于40%為效果好、20%～40%為效果一般、低于20%為效果差的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,共篩得抑制混菌生物膜效果好的乳桿菌20株用于繼續(xù)研究乳桿菌對(duì)牙周炎癥的緩解情況。20株乳桿菌對(duì)混菌生物膜的抑制作用見(jiàn)表2。

表2 乳桿菌對(duì)混菌生物膜的抑制作用

2.2 基于LPS誘導(dǎo)Ca9-22細(xì)胞分泌炎癥因子的篩選

除了牙菌斑對(duì)牙周組織造成的破壞外,宿主因細(xì)菌及其毒力因子刺激所產(chǎn)生的過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)是造成牙周炎的關(guān)鍵因素。當(dāng)牙齦卟啉單胞菌與上皮細(xì)胞接觸,牙齦卟啉單胞菌LPS刺激細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-8等促炎細(xì)胞因子,從而加速炎癥反應(yīng)和機(jī)體損傷。利用LPS刺激Ca9-22細(xì)胞所形成的牙周炎細(xì)胞模型對(duì)20株乳桿菌進(jìn)一步篩選。由圖1可知,空白組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-8的含量較少。經(jīng)LPS刺激4 h后的模型組TNF-α、IL-1β、IL-8的含量顯著增加(P<0.05)。相比較模型組,實(shí)驗(yàn)組對(duì)TNF-α的分泌均具有抑制的作用,其中CCFM1139、HN23、CCFM1137、VSCDJY12L1和FSCDJY69L1能夠極顯著降低TNF-α的分泌(P<0.001)。對(duì)于IL-1β、IL-8,CCFM1137可以顯著減少IL-1β的分泌(P<0.05)；NT753、CCFM1139、HN286可極顯著減少IL-8的分泌(P<0.001)。因此選取NT753、CCFM1139、HN286、HN23、CCFM1137、VSCDJY12L1和FSCDJY69L1共7株乳桿菌研究其對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)量的影響。

a-TNF-α;b-IL-1β;c-ILF-8

2.3 基于LPS誘導(dǎo)Ca9-22細(xì)胞表達(dá)緊密連接蛋白的篩選

細(xì)胞間的緊密連接是結(jié)合上皮細(xì)胞中最重要的結(jié)構(gòu),通常由細(xì)胞間跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和支架蛋白組成。當(dāng)牙周炎進(jìn)一步惡化時(shí),便會(huì)破壞細(xì)胞間的緊密連接。Claudin、Occludin作為常見(jiàn)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,控制著細(xì)胞旁路和各個(gè)細(xì)胞之間的半滲透壓[22]。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)Claudin-1和Occludin的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析,比較7株乳桿菌對(duì)緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量的影響。由圖2可知,與空白組相比,模型組緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。與模型組相比,植物乳桿菌CCFM1137和發(fā)酵乳桿菌CCFM1139可同時(shí)顯著提高Ca9-22細(xì)胞中Occludin和Claudin-1的mRNA表達(dá)量(P<0.05),且為種內(nèi)效果最佳。因此,CCFM1137和CCFM1139可作為潛在口腔益生乳桿菌,對(duì)其進(jìn)行益生特性評(píng)價(jià)分析。

圖2 乳桿菌對(duì)LPS刺激Ca9-22細(xì)胞表達(dá)Occludin (a)和Claudin-1 (b)基因的影響

2.4 溶菌酶耐受能力評(píng)價(jià)

溶菌酶作為唾液中重要的抗菌成分,能夠選擇性分解革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁,從而導(dǎo)致微生物死亡[23]。通過(guò)測(cè)定乳桿菌對(duì)溶菌酶的耐受能力可評(píng)判當(dāng)乳桿菌應(yīng)用于口腔時(shí)是否具有一定存活能力。由圖3可知,植物乳桿菌CCFM1137和發(fā)酵乳桿菌CCFM1139在溶菌酶0～1.6 mg/mL時(shí),生長(zhǎng)基本不受影響。而當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL時(shí),2株乳桿菌的吸光度值都出現(xiàn)驟減。由此推測(cè),CCFM1137和CCFM1139對(duì)溶菌酶的耐受臨界值在1.6～2.0 mg/mL,遠(yuǎn)大于人口腔溶菌酶質(zhì)量濃度1～57 μg/mL[24]。這表明,CCFM1137和CCFM1139不僅能夠緩解牙周炎,同時(shí)在口腔中具有很好的存活能力。

圖3 CCFM1137和CCFM1139在不同濃度溶菌酶下的生長(zhǎng)密度

2.5 自成膜能力評(píng)價(jià)

牙菌斑生物膜是產(chǎn)酸細(xì)菌共同作用的結(jié)果。因此篩選得到的乳桿菌應(yīng)當(dāng)具有較低的自成膜能力。按照OD600<1為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)CCFM1137和CCFM1139的自成膜能力進(jìn)行評(píng)判[25]。結(jié)果見(jiàn)圖4,2株乳桿菌的自成膜能力遠(yuǎn)小于具核梭桿菌(P<0.05)。

圖4 CCFM1137和CCFM1139自成膜能力

2.6 自聚共聚能力評(píng)價(jià)

乳桿菌自聚并利用其生產(chǎn)的胞外物質(zhì)形成保護(hù)膜,保護(hù)菌株對(duì)抗環(huán)境變化,有助于定植,并且有研究表明自聚能力強(qiáng)的乳桿菌通常具有較強(qiáng)的黏附上皮細(xì)胞的能力[26]。而乳桿菌與致病菌的共聚能力是乳桿菌發(fā)揮口腔益生特性的關(guān)鍵。研究報(bào)道乳桿菌與致病菌的共聚能力與其抑制病原菌生物膜形成的能力有關(guān)[27]。

由圖5可知,CCFM1137在2 h時(shí)自聚能力為9%,而在4 h測(cè)定時(shí)自聚能力突躍至43%,后期則趨于穩(wěn)定。CCFM1139在2 h測(cè)定時(shí)自聚能力為12%,優(yōu)于CCFM1137。之后CCFM1139的自聚能力逐步上升,至8 h時(shí)達(dá)到60%。

a-植物乳桿菌CCFM1137；b-發(fā)酵乳桿菌CCFM1139

CCFM1137和CCFM1139都顯示出了與具核梭桿菌良好的共聚能力。2株菌在2 h時(shí)均超過(guò)了30%,而在8 h時(shí),CCFM1137與具核梭桿菌的共聚能力為66%,CCFM1139為68%。而CCFM1137在2 h時(shí)與牙齦卟啉單胞菌并未發(fā)生共聚,在6 h時(shí)共聚能力為25%,在8 h時(shí)突破40%。CCFM1139在2 h時(shí)與牙齦卟啉單胞菌的共聚能力為19%,在6 h時(shí)突破44%,后穩(wěn)步上升至50%。

3 結(jié) 論

牙周炎是一種由微生物引發(fā)的口腔炎癥疾病,高發(fā)于35歲以上人群。乳桿菌作為益生菌,近年來(lái)在口腔疾病方面的應(yīng)用受到研究者越來(lái)越多的關(guān)注。本研究篩得的植物乳桿菌CCFM1137和發(fā)酵乳桿菌CCFM1139不僅可以減少由牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和具核梭桿菌所形成的混菌生物膜量,抑制牙菌斑的形成,還可以調(diào)節(jié)牙周炎細(xì)胞模型分泌TNF-α、IL-1β、IL-8以及緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin的表達(dá)量,達(dá)到緩解炎癥的效果。同時(shí),CCFM1137和CCFM1139對(duì)溶菌酶都表現(xiàn)出較高的耐受能力,并具有弱自成膜能力和較強(qiáng)的自聚和共聚能力,不僅不會(huì)代替牙周炎致病菌形成新的生物膜,反而可以和牙周炎致病菌共聚,抑制具核梭桿菌等微生物形成生物膜。綜上,植物乳桿菌CCFM1137和發(fā)酵乳桿菌CCFM1139在體外實(shí)驗(yàn)中能夠減少混菌生物膜量,降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8的分泌,調(diào)節(jié)緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的表達(dá)量,具有較好的口腔益生特性,為CCFM1137和CCFM1139的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了參考,同時(shí)為益生菌在防治牙周炎上的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。