單齒螺腸道產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選、鑒別及酶學(xué)性質(zhì)分析

劉耀天,席茂盛,趙陽(yáng),李月嬋,羅學(xué)剛*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457) 2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué)),天津,300457)

我國(guó)海域遼闊，總面積達(dá)473 km2，海洋生物資源極為豐富。其中，我國(guó)的藻類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模目前已是全球第一，其中尤以經(jīng)濟(jì)藻類(lèi)養(yǎng)殖最為典型[1]。據(jù)《2019中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》記錄，2018年我國(guó)海水藻類(lèi)總產(chǎn)量達(dá)234.4萬(wàn)t。因此，對(duì)藻類(lèi)資源的深度開(kāi)發(fā)利用對(duì)我國(guó)海洋經(jīng)濟(jì)的發(fā)展有著至關(guān)重要的意義。

褐藻膠是從海帶、昆布、馬尾藻等褐藻綱植物的細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中提取得到的一種線性多糖,由β-D-甘露糖醛酸及其C5差向異構(gòu)體α-L-古羅糖醛酸通過(guò)α/β-1,4糖苷鍵隨機(jī)排列而成，這兩種糖單元相互聚合形成三種不同的結(jié)構(gòu)單元，分別是聚甘露糖醛酸(PolyM)、聚古羅糖醛酸(PolyG)及M和G隨機(jī)組合形成的雜聚物(PolyMG)[2]。褐藻膠的降解產(chǎn)物褐藻寡糖在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都具有巨大的利用潛力。褐藻寡糖在抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗凝血[5]、抗真菌[6]、神經(jīng)保護(hù)[7]、腸道消化吸收[8]及植物的生長(zhǎng)及保鮮[9]等方面具有良好的生物活性。

相比于酸堿化學(xué)降解法、電離輻射和高溫高壓物理降解法等傳統(tǒng)褐藻寡糖制備方法，利用褐藻膠裂解酶制備褐藻寡糖的生物酶解法具有反應(yīng)條件溫和、降解效率高、產(chǎn)物分離容易等優(yōu)勢(shì)。而目前已報(bào)道的產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株相對(duì)較少，因此篩選生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)酶量高、酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)等展開(kāi)深入研究，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[10]。

目前已知的產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株主要來(lái)源于海水、土壤和海洋藻類(lèi)等環(huán)境中[11]。此外，在皺紋盤(pán)鮑、黑斑海兔等主要以褐藻和紅藻為食的海生動(dòng)物的各種消化器官中也發(fā)現(xiàn)有褐藻膠裂解酶的存在[12-14]。螺類(lèi)作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中的一類(lèi)龐大的群體，主要以藻類(lèi)為食，因此其腸道中理論上有可能存在具有良好生理性質(zhì)的產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株。單齒螺(Monodontalabio)是一種大量生活在我國(guó)南北潮間帶的經(jīng)濟(jì)螺類(lèi)，常年以褐藻為食，具有較強(qiáng)的耐受環(huán)境變化的能力[15]。本研究從單齒螺的腸道中篩選得到了一株生長(zhǎng)周期短、性質(zhì)穩(wěn)定,且產(chǎn)生熱穩(wěn)定性較好的褐藻膠裂解酶的海生弧菌，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用情況進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

本實(shí)驗(yàn)所研究的單齒螺(Monodontalabio)來(lái)自山東省青島市某漁場(chǎng)。

2216E培養(yǎng)基：海藻酸鈉5 g,硫酸銨5 g,人工海水1 L,用于菌株的富集、種子液和發(fā)酵液的培養(yǎng)。在2216E培養(yǎng)基中加瓊脂粉15 g即為2216E固體培養(yǎng)基,用于菌株的篩選。

我妻氏血瓊脂平板,青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

酶解反應(yīng)底物：海藻酸鈉,上海源葉生物科技有限公司。5 g/L海藻酸鈉,溶于10 mmol/L Tris-HCl緩沖液。

1.1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋,北京市永光明醫(yī)療儀器廠；普通冰箱,TCL集團(tuán)；UV-3200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的富集培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下,用小錘將單齒螺外殼敲碎,取出螺體,用剪子挑出腸道部分,短暫浸入75%的乙醇中將表面消毒,噴灑無(wú)菌水去除表面殘留乙醇,加入裝有100 mL 2216E培養(yǎng)基的三角瓶中,28 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選

將富集后的樣品梯度稀釋至10-7,分別取各梯度下的樣品100 μL均勻涂布至以海藻酸鈉為唯一碳源的2216E培養(yǎng)平板上,28 ℃培養(yǎng)48 h。用95%的乙醇處理10 min顯示透明圈,挑取其中具有明顯凹陷透明圈的菌落,以透明圈直徑與菌落直徑的比值(D/d)為標(biāo)準(zhǔn),初步篩選得到可產(chǎn)褐藻膠裂解酶的目標(biāo)菌株。為了分離得到單一的菌落,將初篩的菌落在2216E平板上進(jìn)行劃線分離純化3次,觀察菌落生長(zhǎng)狀況及菌落形態(tài),并將得到的目標(biāo)菌株進(jìn)行編號(hào)整理。并進(jìn)一步通過(guò)革蘭氏染色法和掃描電子顯微鏡觀察菌株的生長(zhǎng)形態(tài)。

1.2.3 褐藻膠裂解酶活性的檢測(cè)

將1.2.2中純化后的單菌落點(diǎn)接種于以海藻酸鈉為唯一碳源的2216E培養(yǎng)平板上,30 ℃培養(yǎng)48 h,觀察透明圈大小。

將純化后的單菌落分別接種于2216E種子培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)12 h,再將種子液以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于2216E發(fā)酵培養(yǎng)基中,在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。將菌液在4 ℃條件下8 000 r/min離心30 min后,取上清液作為粗酶液,通過(guò)3,5-二硝基水楊酸法(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS法)測(cè)定粗酶活力。

本實(shí)驗(yàn)所使用的酶活力測(cè)定體系為：在400 μL含15 g/L NaCl的5 g/L的海藻酸鈉溶液(溶劑為10 mmol/L Tris-HCl緩沖液)中,加入100 μL粗酶液,在40 ℃條件下振蕩反應(yīng)20 min,加入500 μL DNS終止液終止酶學(xué)反應(yīng),混勻,沸水浴10 min,流水冷卻,在540 nm處檢測(cè)光吸收值,測(cè)定還原糖的生成量。以加入100 μL熱失活酶液為對(duì)照組,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。酶活力單位(U)定義為:在一定的溫度下,單位時(shí)間內(nèi)將底物降解生成1 μg還原糖所需的酶量。

1.2.4 16S rDNA序列分析法鑒定菌種種屬來(lái)源

采用菌落PCR的方法對(duì)目標(biāo)菌株16S rDNA進(jìn)行驗(yàn)證,取40 μL裂解液加入10 μL菌液,沸水浴15 min,混勻,以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以正向引物27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTAGGACTT-3′)為引物,反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性45 s,56 ℃下退火1 min,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；再在72 ℃下延伸10 min。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物測(cè)序后拼接得到DNA序列,使用NCBI的BLAST在線軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用MEGA 7.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 神奈川現(xiàn)象試驗(yàn)

將在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h的目標(biāo)菌株點(diǎn)種于我妻氏血瓊脂平板,在37 ℃培養(yǎng)18 h,通過(guò)觀察平板是否出現(xiàn)β溶血現(xiàn)象,判斷目標(biāo)菌株是否具有溶血性。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)菌株單因素發(fā)酵優(yōu)化

將菌株活化后以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于不同條件的2216E液體培養(yǎng)基中,30 ℃,220 r/min培養(yǎng)12 h,在單因素試驗(yàn)中,控制單一變量,研究不同的碳源(海藻酸鈉、葡萄糖、蔗糖、淀粉、木糖)、氮源(酵母提取物、胰蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4Cl)、培養(yǎng)溫度(15、20、25、30、35、40 ℃)、培養(yǎng)基的初始pH值(5、6、7、8、9)、初始NaCl質(zhì)量濃度(10、20、30、40、50、60 g/L)等培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)酶量的影響。

1.2.7 生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酶曲線繪制

在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種3次傳代后的菌株,在最優(yōu)發(fā)酵條件下以1%的接種量培養(yǎng),在菌株生長(zhǎng)過(guò)程中每2 h取樣測(cè)定OD600值及酶活力,繪制菌株生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酶曲線。

1.2.8 菌株酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

在pH 7.5的條件下,分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下研究粗酶液的最適溫度。

在40 ℃的條件下,分別在pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的Tris-HCl緩沖液中確定粗酶液的最適pH。

本研究對(duì)照組患者行急診內(nèi)科的常規(guī)護(hù)理。觀察組在對(duì)照組常規(guī)護(hù)理的基礎(chǔ)上行急診救治模式的護(hù)理干預(yù),結(jié)果表明,觀察組患者至急救室后靜脈通道開(kāi)放時(shí)間、急救室停留時(shí)間顯著較短,且入院10分鐘后FPSR評(píng)分明顯較低,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明觀察組患者采用急診救治模式護(hù)理進(jìn)行干預(yù)治療后,提高了急診救治的效果,緩解了患者的疼痛。兩組患者干預(yù)前后SAS、SDS評(píng)分均明顯降低,且觀察組患者干預(yù)后的SAS、SDS評(píng)分較對(duì)照組明顯要低,觀察組家屬的滿(mǎn)意度比對(duì)照組明顯要高,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明急診救治模式的護(hù)理干預(yù)對(duì)心絞痛患者的負(fù)面情緒起到了良好的調(diào)節(jié)作用,提高了患者家屬對(duì)護(hù)理的滿(mǎn)意度。

在pH 7.5,40 ℃的條件下,分別加入5 mmol/L的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+,對(duì)不同金屬離子對(duì)粗酶液的影響進(jìn)行測(cè)定,對(duì)照組為不加金屬離子組。

在40、45、50、55 ℃的條件下,分別對(duì)粗酶液處理5、15、30、60、90、120 min,研究粗酶液在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。

1.2.9 褐藻降解效果測(cè)定

取新鮮海帶和馬尾藻,在75%的乙醇中浸泡消毒10 min,用無(wú)菌水反復(fù)清洗至無(wú)乙醇味。分別在100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5 g海帶和馬尾藻,在最適菌株生長(zhǎng)條件下(加入具體條件)培養(yǎng)72 h,用100目濾網(wǎng)過(guò)濾處理后的樣品,取殘?jiān)?干燥,測(cè)定海帶和馬尾藻的干重變化。對(duì)照組分別為未處理組和人工海水處理組。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選

從20個(gè)單齒螺樣品中共篩選得到165株生長(zhǎng)狀況良好且在平板上形成明顯凹陷透明圈的菌株,通過(guò)對(duì)其透明圈直徑與菌落直徑的比值(D/d)的比較,篩選出20株D/d>6的目標(biāo)菌株進(jìn)行復(fù)篩,在3次純化后篩選出活性穩(wěn)定的12株菌株進(jìn)行單獨(dú)點(diǎn)接和粗酶活力測(cè)定。如圖1所示,菌株ML17的D/d值最大同時(shí)粗酶活力最高(表1)。

圖1 菌株ML17在以海藻酸鈉為唯一碳源培養(yǎng)平板上的透明圈情況

表1 單齒螺腸道來(lái)源的不同菌株的活性比較

2.2 菌種的鑒定

將菌株ML17在添加海藻酸鈉唯一碳源的2216E培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h,菌落呈白色,不透明,菌落突起,濕潤(rùn),邊緣光滑,有光澤,菌落直徑為0.6～0.8 mm,培養(yǎng)基有明顯凹陷圈和透明圈,通過(guò)光學(xué)顯微鏡下觀察,革蘭氏染色呈G-,菌體呈近球狀。掃描電子顯微鏡30 000倍觀察其細(xì)胞形態(tài)如圖2所示,菌體呈短桿狀或橢圓狀,兩端鈍圓。

圖2 掃描電子顯微鏡觀察菌株ML17細(xì)胞形態(tài)(30 000×)

通過(guò)分子生物學(xué)手段,測(cè)定菌株ML17的16S rDNA序列為1 452 bp,通過(guò)BLAST序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)其16S rDNA與海生弧菌Vibriomaritimusstrain KP37A1的相似性達(dá)到99.29%。依據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)聚類(lèi)分析(圖3),并結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征,鑒定該菌為弧菌屬菌株,并命名為Vibriosp.ML17,將該菌株保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心,保藏編號(hào)為CGMCC No.20377。

圖3 菌株ML17的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

副溶血性弧菌等一些具有溶血致病性的菌株會(huì)在我妻氏血瓊脂平板上出現(xiàn)β溶血現(xiàn)象,形成透明溶血圈,這一現(xiàn)象即神奈川現(xiàn)象(Kanagawa phenomenon,KP)。為了確定Vibriosp. ML17是否也會(huì)存在溶血性安全隱患,本研究通過(guò)我妻氏血瓊脂平板對(duì)Vibriosp. ML17進(jìn)行培養(yǎng)分析。實(shí)驗(yàn)中未觀察到β溶血現(xiàn)象的發(fā)生,初步表明Vibriosp. ML17沒(méi)有溶血致病性,具有較好的安全性。

2.3 菌種生長(zhǎng)條件優(yōu)化

對(duì)不同碳源、氮源、生長(zhǎng)溫度、pH、NaCl濃度的生長(zhǎng)條件下的相對(duì)生物量和相對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定。在質(zhì)量濃度均為5 g/L的海藻酸鈉、葡萄糖、蔗糖、淀粉、木糖5種不同的碳源條件下,將Vibriosp. ML17在30 ℃培養(yǎng)12 h,海藻酸鈉是Vibriosp.ML17的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的最佳碳源,但基本無(wú)法利用木糖作為碳源(圖4-a)。而在質(zhì)量濃度均為5 g/L的酵母提取物、胰蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4Cl 四種不同的氮源條件下,Vibriosp. ML17對(duì)復(fù)合氮源的利用率要優(yōu)于單一的無(wú)機(jī)氮源,其中在胰蛋白胨的條件下生長(zhǎng)和產(chǎn)酶最佳(圖4-b)。

在15、20、25、30、35、40 ℃不同溫度的條件下,Vibriosp.ML17在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后,結(jié)果顯示(圖4-c)：Vibriosp.ML17在30 ℃生長(zhǎng)能力和產(chǎn)酶量最佳。菌株超過(guò)30 ℃時(shí)生長(zhǎng)能力會(huì)迅速下降,在40 ℃時(shí)基本已無(wú)法生長(zhǎng)。將Vibriosp. ML17分別置于pH 5、6、7、8、9的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后,結(jié)果顯示(圖4-d),Vibriosp.ML17在pH 7的條件下酶活力最高,而在pH 8時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。在pH 5、6、9的條件下菌株生長(zhǎng)狀態(tài)和產(chǎn)酶量均較低。由于Vibriosp. ML17來(lái)源于海洋生物體內(nèi),因此在含NaCl的條件下可能有利于其生長(zhǎng),對(duì)Vibriosp.ML17在含NaCl 10、20、30、40、50、60 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后,結(jié)果顯示(圖4-e)：Vibriosp. ML17在30 g/L的NaCl質(zhì)量濃度條件下生長(zhǎng)狀態(tài)和產(chǎn)酶量達(dá)到最佳。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到60 g/L時(shí)菌株基本無(wú)法生長(zhǎng)。

a-碳源；b-氮源；c-溫度；d-pH；e-NaCl質(zhì)量濃度

2.4 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況

通過(guò)對(duì)Vibriosp.ML17的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶曲線的分析表明,在最適生長(zhǎng)條件下,菌株在10 h即可達(dá)到平臺(tái)期,在14 h達(dá)到最高產(chǎn)酶量(圖5)。這一結(jié)果證明Vibriosp.ML17具有較快的生長(zhǎng)速度,發(fā)酵周期短,有利于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

圖5 Vibrio sp.ML17的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線

2.5 褐藻膠裂解酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 褐藻膠裂解酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

對(duì)不同溫度下Vibriosp.M17所產(chǎn)褐藻膠裂解酶的活性測(cè)定結(jié)果顯示(圖6-a)：在25～40 ℃時(shí),酶活力逐漸上升,40 ℃達(dá)到最大值,在45和50 ℃仍能保持90%和70%以上活性,從50 ℃之后開(kāi)始迅速下降,60 ℃基本失活。將粗酶液在40、45、50、55 ℃分別處理5、15、30、60、90、120 min后測(cè)定活性,發(fā)現(xiàn)粗酶液在40和45 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性,如圖6-b所示。

圖6 褐藻膠裂解酶最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

在40和45 ℃條件下處理60 min后活性分別剩余87.4%和66.4%,處理120 min后活性分別剩余65.9%和32.7%。

2.5.2 褐藻膠裂解酶的最適pH

對(duì)不同pH環(huán)境下Vibriosp. M17所產(chǎn)褐藻膠裂解酶活性的檢測(cè)結(jié)果表明(圖7),該菌株所產(chǎn)褐藻膠裂解酶最適pH值為7.5,在pH 6.5～8.0的偏酸和偏堿條件下均能保持80%以上的活性,過(guò)酸和過(guò)堿條件都會(huì)導(dǎo)致酶活力迅速下降。

圖7 褐藻膠裂解酶最適反應(yīng)pH

2.5.3 金屬離子對(duì)褐藻膠裂解酶的影響

對(duì)多種金屬離子的作用研究如圖8所示。Na+、K+、Ca2+對(duì)酶活力都有促進(jìn)作用,其中Na+、Ca2+最為顯著,分別可以提高39.4%和32.6%。Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+有抑制作用,其中Zn2+、Cu2+、Fe2+可完全抑制活性。Mg2+對(duì)酶活力無(wú)明顯影響。由于褐藻膠裂解酶主要來(lái)源于海洋當(dāng)中,所以海水中含量較高的Na+、K+、Ca2+等離子都會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生促進(jìn)效果。

圖8 不同金屬離子對(duì)褐藻膠裂解酶的影響

2.6 菌株Vibrio sp.ML17對(duì)褐藻屬植物的降解作用

海帶和馬尾藻均屬于典型的褐藻門(mén)植物,褐藻膠是其細(xì)胞壁的主要成分之一。通過(guò)對(duì)2種不同綱的褐藻降解作用的測(cè)定,結(jié)果顯示(圖9),與未經(jīng)處理或僅用單純?nèi)斯ずＫ幚砗蟮臉悠方M相比,經(jīng)Vibriosp. ML17處理72 h后,海帶和馬尾藻干重分別減少了44.0%和38.9%,證明Vibriosp. ML17可有效實(shí)現(xiàn)對(duì)褐藻植物的降解作用。

圖9 褐藻膠裂解酶對(duì)不同褐藻的降解效果

3 討論

與其他來(lái)源的褐藻膠裂解酶相比,來(lái)源于微生物的褐藻膠裂解酶存在多種優(yōu)勢(shì),如酶產(chǎn)量高、相對(duì)酶活力較高、專(zhuān)一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和等[16]。在之前的報(bào)道中,MICHIHIRO等[17]通過(guò)改變海螺和海兔的飼料構(gòu)成,在腸道內(nèi)篩選得到了多種可降解褐藻膠的菌株。本研究從生活在我國(guó)南北潮間帶的單齒螺的腸道中發(fā)現(xiàn)了1株具有較高褐藻膠裂解酶活性的弧菌Vibriosp.ML17。受單齒螺長(zhǎng)期的生存高鹽海洋環(huán)境影響,Vibriosp.ML17對(duì)抵御不利環(huán)境具有一定優(yōu)勢(shì)。

目前已報(bào)道的大多數(shù)產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株,由于活力低、發(fā)酵周期長(zhǎng)等不足[18],導(dǎo)致其無(wú)法應(yīng)用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中,例如源自Hydrogenopahagasp.的褐藻膠裂解酶在40 ℃處理30 min后只能殘留10%活性[19],源自皺紋盤(pán)鮑的海洋弧菌褐藻膠裂解酶在40 ℃處理2 h后活性低于40%[20]。而本研究中,Vibriosp.ML17的褐藻膠裂解酶活性具有較好的熱穩(wěn)定性,在40和45 ℃處理2 h后相對(duì)活力仍能保持65.9%和32.7%。同時(shí),不同的金屬離子也會(huì)對(duì)褐藻膠裂解酶的活性產(chǎn)生影響,研究表明Na+、K+對(duì)本研究中的褐藻膠裂解酶酶活性有促進(jìn)作用,且Na+產(chǎn)生影響最大,這一結(jié)果與李云濤等[20]研究中褐藻膠裂解酶性質(zhì)相似,這可能與相關(guān)金屬離子參與褐藻膠裂解酶催化位點(diǎn)的結(jié)合及原本的生存環(huán)境有關(guān)[21]。

有文獻(xiàn)報(bào)道部分弧菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域有一定的生物防治作用,可改良水質(zhì),防控疾病等。李學(xué)智[22]通過(guò)蛭弧菌在草魚(yú)池塘的應(yīng)用性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)草魚(yú)爛鰓病、腸炎病等細(xì)菌性病害有一定的預(yù)防作用。同時(shí),姚艷艷等[23]還通過(guò)無(wú)溶血性及具有蛋白酶和淀粉酶活性推斷其從鮑魚(yú)腸道篩得的弧菌屬菌株YY7為潛在的益生菌。之前研究表明弧菌的致病力與毒力因子溶血素相關(guān)[24],而本研究篩選得到的菌株并無(wú)β溶血現(xiàn)象發(fā)生,不具有潛在致病性,可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面。

4 結(jié)論

本文以海藻酸鈉為唯一碳源對(duì)海洋螺類(lèi)單齒螺的腸道菌進(jìn)行篩選,獲得1株具有較高褐藻膠裂解酶活性的菌株Vibriosp.ML17(CGMCC NO.20377)。該菌株具有生長(zhǎng)發(fā)酵周期短、菌種安全的特點(diǎn),同時(shí)其分泌的胞外褐藻膠裂解酶具有較高的熱穩(wěn)定性,應(yīng)用試驗(yàn)表明其可以對(duì)褐藻進(jìn)行有效的降解,在72 h對(duì)海帶和馬尾藻的降解率分別達(dá)44.0%和38.9%,綜合上述研究表明Vibriosp.ML17在褐藻寡糖制備、水產(chǎn)養(yǎng)殖中的褐藻防治去除等領(lǐng)域具有良好工業(yè)應(yīng)用前景。