羊乳蛋白質(zhì)組成及消化特性

蔡俊娜，張富新，劉玉芳，許晶輝，章依婷，吳阿敏

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062）

羊乳營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分[1]，具有乳脂肪球小[2]、蛋白質(zhì)不易過(guò)敏、不易發(fā)生乳糖不耐癥和易消化吸收的特性[1]。此外，羊乳中還含有表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子[1]、胰島素生長(zhǎng)因子[3]、環(huán)腺苷酸[4]、乳鐵蛋白[5]和免疫球蛋白[6]等生物活性物質(zhì)，具有一定的營(yíng)養(yǎng)保健功能。近年來(lái)，隨著人們營(yíng)養(yǎng)保健意識(shí)的提高，羊乳的營(yíng)養(yǎng)保健功能已受到關(guān)注。目前有關(guān)羊乳的基本營(yíng)養(yǎng)組成已有大量報(bào)道[1,7-9]，但有關(guān)羊乳蛋白質(zhì)組成及消化特性的研究相對(duì)較少。因此本研究對(duì)羊乳酪蛋白和乳清蛋白進(jìn)行分離，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）研究蛋白質(zhì)組成及酪蛋白和乳清蛋白的消化特性，為評(píng)價(jià)羊乳蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)及開(kāi)發(fā)利用羊乳提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳采自西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)150 只薩能奶山羊混合乳樣，乳樣采集后低溫（4 ℃）運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，分裝后于－40 ℃貯藏。

鹽酸 洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；CaCl2·2H2O 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇、甲醇、冰乙酸 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/g）、胰酶（1 750 U/g） 美國(guó)Sigma公司；豬膽鹽 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甘氨酸 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、SDS、Tris、SDS-PAGE還原性蛋白凝膠制備試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（4×）、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（14.4～116.0 kDa） 碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；BSA22025電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TGL-16B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FDU1200真空冷凍干燥機(jī) 上海愛(ài)郎儀器有限公司；FM恒溫水浴鍋 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VORTEX-5旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Power PacTM基礎(chǔ)電泳儀電源、Mini-Protean?Tetra Cell電泳槽 上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；THZ-300/300C恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ChemiDoc-it System 510 Imager化學(xué)發(fā)光成像儀 美國(guó)UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 羊乳酪蛋白和乳清蛋白的制備

為了更精確研究羊乳中蛋白質(zhì)的消化特性，避免SDS-PAGE中蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物對(duì)電泳條帶的影響，將羊乳中酪蛋白和乳清蛋白進(jìn)行分離。羊乳在3 500×g條件下離心20 min，置于－20 ℃冰箱15 min后去除上層脂肪。用1.0 mol/L HCl將脫脂乳pH值調(diào)整至羊乳酪蛋白等電點(diǎn)4.2，靜置30 min后，在3 000×g條件下離心30 min，沉淀部分為酪蛋白，上清液為乳清[10-11]。用0.1 mol/L HCl將乳清的pH值調(diào)至4.0，90 ℃加熱25 min，冷卻至室溫（25 ℃），在10 000×g條件下離心20 min，沉淀部分為乳清蛋白[12-13]。以上步驟重復(fù)3 次，得到的酪蛋白和乳清蛋白用真空冷凍干燥機(jī)制成酪蛋白粉和乳清蛋白粉，用于酪蛋白和乳清蛋白的體外模擬消化實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 SDS-PAGE

參照王銀等[14]的方法，用2.25 mL 30 g/100 mL丙烯酰胺（29 g丙烯酰胺、1 g雙丙烯酰胺，超純水定容至100 mL）、1.25 mL pH 8.8 Tris-HCl、50 μL 10 g/100 mL SDS、50 μL 10 g/100 mL過(guò)硫酸銨（ammonium persulfate，APS）、5 μL四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）和1.4 mL超純水制備13.5%的分離膠；用0.313 mL 30 g/100 mL丙烯酰胺、0.313 mL pH 6.8 Tris-HCl、25 μL 10 g/100 mL SDS、37.5 μL 10 g/100 mL APS、3.75 μL TEMED和1.813 mL超純水制備3.75%的濃縮膠。將13.5%的分離膠注入凝膠板中凝膠40 min后加入3.75%的濃縮膠，凝膠40 min，完成制膠。

將1 g/100 mL酪蛋白和1 g/100 mL乳清蛋白分別用超純水稀釋10 倍，制備樣品稀釋液，取30 μL樣品稀釋液，加入10 μL蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min完成樣品處理。將3.03 g Tris、18.7 g甘氨酸、1 g SDS定容至1 L，配成電極緩沖液，加入電泳槽內(nèi)，然后添加樣品稀釋液。電泳條件：初始電泳電壓為75 V，當(dāng)酪蛋白和乳清蛋白樣品進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至200 V，直至樣品條帶完全分離。將凝膠從凝膠板上取下，在水平搖床中用染色液（1 g考馬斯亮藍(lán)R-250、450 mL甲醇、100 mL冰乙酸，定容至1 L）染色2 h，然后用脫色液（100 mL甲醇和100 mL冰乙酸，定容至1 L）脫色24 h，最后用化學(xué)發(fā)光成像儀掃描，進(jìn)行條帶灰度分析，樣品中各蛋白質(zhì)的相對(duì)含量按式（1）～（2）計(jì)算。

1.3.3 體外模擬消化

帥大叔之前都決定認(rèn)栽，忍氣吞聲，可在兇悍男發(fā)泄完畢回到自己車上時(shí)，他的情緒被引爆了，接下來(lái)的一切便失控了。

羊乳酪蛋白和乳清蛋白分別進(jìn)行體外模擬胃液消化、腸液消化、胃腸液消化。

模擬胃液消化：參照Pan Yi[15]、Hodgkinson[16]等方法，略作修改。將2 g NaCl和7 mL 2 mol/L HCl用超純水定容至1 L，配制成人工胃液。分別取10 mL 1 g/100 mL酪蛋白和1 g/100 mL乳清蛋白，于37 ℃預(yù)熱5 min后，分別添加10 mL人工胃液，用2 mol/L HCl將pH值調(diào)整至2.5，添加胃蛋白酶（180 U/mg蛋白質(zhì)）后，于37 ℃恒溫水浴中分別消化30、60、120 min，用1 mol/L NaOH調(diào)整消化液pH值至7.0終止反應(yīng)，取消化液進(jìn)行SDS-PAGE。

模擬腸液消化：參照Moreno-Montoro[17]、Kim[18]等方法，略作修改。將68.3 mL 84.7 g/L NaHCO3、10 mL 22.2 g/L CaCl2·2H2O和30 g豬膽鹽用超純水定容至500 mL，配制成人工腸液。分別取10 mL 1 g/100 mL酪蛋白和1 g/100 mL乳清蛋白，于37 ℃預(yù)熱5 min，分別添加0.1 mL人工腸液，用1 mol/L NaOH將pH值調(diào)整至7.0，添加胰酶（34.5 U/mg蛋白質(zhì)）后，于37 ℃恒溫水浴中分別消化2、10、30 min，沸水浴5 min終止反應(yīng)，取消化液進(jìn)行SDS-PAGE。

模擬胃腸液消化：參照文獻(xiàn)[15-18]方法，略作修改。取10 mL 1 g/100 mL酪蛋白和1 g/100 mL乳清蛋白，按上述步驟模擬胃液消化30 min后，用1 mol/L NaOH調(diào)整消化液pH值至7.0，然后模擬腸液分別消化2、10、30 min，沸水浴5 min終止反應(yīng)，取消化液進(jìn)行SDS-PAGE。

用化學(xué)發(fā)光成像儀對(duì)SDS-PAGE條帶的灰度值進(jìn)行測(cè)定，蛋白質(zhì)消化率按式（3）計(jì)算[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；采用DPS 9.50統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊乳蛋白質(zhì)組成

圖1 羊乳蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE analysis of proteins in goats’ milk

由圖1可知，羊乳蛋白質(zhì)電泳條帶分離清晰，可明顯區(qū)分酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白組成；乳清蛋白主要由α-乳白蛋白和β-乳球蛋白組成，此外乳清蛋白中還含有少量的乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白。

表1 羊乳蛋白質(zhì)組成Table 1 Protein composition of goats’ milk

2.2 羊乳酪蛋白消化特性

圖2 羊乳酪蛋白模擬胃液消化、腸液消化和胃腸液消化SDS-PAGE圖（n=3）Fig. 2 SDS-PAGE analysis of simulated gastric juice digestion, intestinal juice digestion and gastrointestinal juice digestion of casein in goats’ milk (n = 3)

由圖2可知，羊乳酪蛋白消化前的條帶清晰，可明顯區(qū)別αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，但經(jīng)過(guò)胃腸液消化后的酪蛋白條帶逐漸減少或消失，表明羊乳酪蛋白在胃腸液中逐漸被消化。

由表2可知，羊乳酪蛋白在胃液消化期間，隨著消化時(shí)間延長(zhǎng)，其消化率進(jìn)一步提高，但4 種酪蛋白在胃液中的消化情況有一定差別，在胃液消化30 min時(shí)，αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白消化率分別為84.42%、79.17%和76.27%，αs2-酪蛋白的消化率僅為62.69%，顯著低于αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白（P＜0.05），這表明在胃液消化前期αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白更易消化，隨著胃液消化時(shí)間延長(zhǎng)，4 種酪蛋白消化率差異不大，在胃液消化120 min時(shí)，4 種酪蛋白消化率達(dá)到99.00%以上，羊乳酪蛋白幾乎完全消化。

羊乳酪蛋白在腸液消化2 min時(shí)，消化率高達(dá)99.00%以上，消化10 min后，酪蛋白幾乎完全消化，表明羊乳酪蛋白在腸液中消化率較高，顯著高于胃液消化。羊乳酪蛋白胃液消化30 min后腸液消化2 min時(shí)幾乎完全消化，進(jìn)一步表明羊乳酪蛋白主要在腸液中消化，這與楊博睿[11]和Jasińska[22]等的報(bào)道一致。

2.3 羊乳乳清蛋白消化特性

圖3 羊乳乳清蛋白模擬胃液消化、腸液消化和胃腸液消化SDS-PAGE圖（n=3）Fig. 3 SDS-PAGE analysis of simulated gastric juice digestion,intestinal juice digestion and gastrointestinal juice digestion of whey protein in goats’ milk (n = 3)

由圖3可知，羊乳乳清蛋白電泳條帶清晰，可明顯觀察到α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白條帶，但經(jīng)過(guò)胃腸液消化后的蛋白條帶逐漸減少或消失，表明羊乳乳清蛋白在胃腸液中逐漸被消化。

由表3可知，乳清蛋白組分在胃腸液中的消化有較大差別，乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白在胃液和腸液中的消化率顯著高于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白（P＜0.05）。在胃液中消化30 min時(shí)，乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的消化率分別為70.91%、59.49%和56.13%，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率僅為32.51%和33.14%；胃液消化60 min時(shí)，乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的消化率分別為95.08%、89.19%和91.25%，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率僅為56.65%和42.58%；胃液消化120 min時(shí)，乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的消化率均達(dá)到90.00%以上，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率僅為67.53%和50.82%，這表明乳清蛋白中的乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白在胃液中易消化，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在胃液中不易消化。

表3 羊乳乳清蛋白在模擬胃腸液中的消化率Table 3 Digestibility of whey protein in goats’ milk in simulated gastrointestinal juice %

乳清蛋白在腸液中消化2 min時(shí)，乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的消化率分別為99.27%、81.97%和75.57%，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率分別為18.55%和45.53%；乳清蛋白在腸液中消化10 min時(shí)，乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的消化率均達(dá)到90.00%以上，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率僅為26.83%和54.05%。胃腸液消化（胃液消化30 min后腸液消化30 min）后α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率才達(dá)到78.48%和91.36%，這表明α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在胃腸液中難以消化。Almaas[23]、Inglingstad[24]等也報(bào)道，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在胃腸中難以消化，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是乳清蛋白中主要成分，其消化特性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白中分別存在4 個(gè)和2 個(gè)分子二硫鍵[25]，分子二硫鍵的存在增加了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的穩(wěn)定性，不易被消化道中的蛋白酶水解。

3 結(jié) 論

通過(guò)SDS-PAGE和模擬體外消化對(duì)羊乳蛋白質(zhì)組成和消化特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，羊乳主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，酪蛋白由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白組成，乳清蛋白主要由α-乳白蛋白和β-乳球蛋白組成，同時(shí)還含有少量的乳鐵蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白。通過(guò)對(duì)羊乳中酪蛋白和乳清蛋白的消化特性研究發(fā)現(xiàn)，羊乳酪蛋白比乳清蛋白更易消化，且消化主要在腸液中進(jìn)行。