斑蝥黃中β，β-胡蘿卜-4，4-二酮測定方法的改進

劉 紅， 劉貴蓮， 袁 敏， 梅紹鋒*， 耿維軍， 朱九堡

（1.四川特驅農牧科技集團有限公司，四川成都610207；2.四川特驅投資集團有限公司，四川成都610207；3.新津邦得科技有限公司，四川成都611435）

斑蝥黃（或稱斑蝥黃質）是一種類胡蘿卜素，存在于某些蘑菇、甲殼類、魚類、藻類、蛋、血液和肝臟中，1984年FDA/WHO批準斑蝥黃列入食品添加劑并制訂了質量標準。斑蝥黃質可作為食品添加劑用于飲料、調味醬和肉類加工品等，另外，還可作為飼料添加劑改善蛋黃的顏色，并且著色后色調不受pH影響，對日光亦相當穩(wěn)定，不易褪色。但斑蝥黃自身穩(wěn)定性較差，對氧化劑、熱和濕都十分敏感，因此需貯存于充惰性氣體的遮光性容器內。GB/T 18970-2003檢測方法中用無色的圓底燒瓶便于觀察溶液的蒸發(fā)情況，存在色素降解的風險；用旋轉蒸發(fā)儀蒸干5 mL樣品需要1～2 h，同時旋轉蒸發(fā)儀使用步驟繁鎖，操作難度大；將蒸干的樣品轉入容量也增加了檢測誤差。因此本實驗旨在對GB/T 18970-2003檢測斑蝥黃方法進行改進，以提高檢測效率和準確度。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑Secure225D-1CN分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）；TDZ4-WS臺式低速離心機，湖南湘儀；UV-2800A紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）；MTN-2800D-24氮吹儀（無水浴控溫），天津奧特賽恩斯；RE52CS-2旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)。無水乙醇、三氯甲烷、環(huán)己烷均為分析純。

1.2 實驗方法 本實驗進行了4個單因子的改進：（1）溶液未吹干對檢測結果的影響；（2）溶液剛吹干和容量瓶底白吹對檢測結果的影響；（3）超聲溶解時間對檢測結果的影響；（4）自溶時間對檢測結果的影響。最后通過分析檢測結果，確認方法改進的關鍵因素。其他操作步驟按國標改進的測定方法進行。

1.2.1 樣品的制備 取有代表性的樣品約500 g，混合均勻，四分法將試樣分裝到4個避光真空的密封袋中，防止樣品成分變質。

1.2.2 樣品溶液的制備 稱取試樣0.10～0.11 g（即為10%天麗紅或10%斑蝥黃；2.5%的斑蝥黃應稱取0.35～0.40 g），精確到0.0001 g，置于250 mL容量瓶中，加10 mL預熱至60℃的蒸餾水，并在60℃的水浴中保持5 min，冷卻后，加100 mL無水乙醇和100 mL三氯甲烷，用超聲波水浴處理5 min，用三氯甲烷定容。搖勻后，取出100 mL溶液置于兩只50 mL具塞離心管內，4000 r/min離心5 min，移出離心上層清液待用。

1.2.3 國標檢測步驟 移取離心管內上層清液5.0 mL，置于旋轉蒸發(fā)器的圓底燒瓶中，在45℃真空蒸發(fā)至干，殘渣用0.5 mL無水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤濕后，加入環(huán)己烷，少量多次進行溶解，并轉移到100 mL的容量瓶中，用環(huán)己烷定容。其檢測數(shù)據為X1。

分光光度計測定波長是468～472 nm的吸收最大值，使用1 cm的吸收池，以空白環(huán)已烷作為參比。此方法提取的主要成分是β，β-胡蘿卜-4，4-二酮，其在波長470 nm處有最大吸收值，在900～1100 nm有一個試劑雜峰。

1.3 數(shù)據統(tǒng)計與分析 實驗數(shù)據用“平均值±標準偏差”表示，使用F檢測法比較兩個方法數(shù)據的精密度，用t檢測比較兩種方法的平均值之間是否存在顯著性差異，同時國標GB/T 18970-2003重復性要求相對偏差應在2%以內。

2 結果

2.1 修改方法中幾個關鍵因素的實驗比對

2.1.1 上清液氮吹未吹干對樣品檢測含量的影響移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹至容量瓶中液體0.5 mL左右，然后向容量瓶中加入0.5 mL無水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤濕后，超聲波中超聲10 min，用環(huán)己烷定容。因為定容后溶液均渾濁，因此放置30 min變澄清后再進行比色。其檢測數(shù)據為X2。

從表1可以看出，上清液未吹干，定容放置半小時后，溶液變澄清后檢測吸光值，上清液使溶液的透光率降低，吸光值增大，使檢測數(shù)據偏高，兩個樣品的相對偏差分別是4.58%、3.95%，均大于重復性要求的相對偏差2%，因此差異顯著。

表1 上清液氮吹未吹干對樣品檢測含量的影響

2.1.2 上清液氮吹干燥程度對樣品檢測含量的影響 移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹干或容量瓶底部吹白，殘渣用0.5 mL無水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤濕后，超聲波中超聲10 min，用環(huán)己烷定容。剛吹干的檢測數(shù)據為X2，容量瓶底部吹白的檢測數(shù)據為X3。

從表2可以看出，樣品剛吹干或容量瓶底部變白，加0.5 mL無水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤濕后，超聲10 min定容比色，其相對偏差＜2%；F檢測值為1.30，查表F表為3.79，F(xiàn)小于F表，X2與X3的精密度無顯著性差異；10%天麗紅和10%斑蝥黃的t檢測值分別為0.13和0.09，查表（95%）得：t表=2.45，t小于t表，X2與X3的準確度無顯著性差異。

2.1.3 上清液氮吹干變白后超聲溶解時間對樣品檢測含量的影響 移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹至容量瓶底部變白，殘渣用0.5 mL無水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤濕后，超聲波中超聲10 min或20 min，用環(huán)己烷定容。超聲10 min的檢測數(shù)據為X2，超聲20 min的檢測數(shù)據為X3。

從表3可以看出，樣品氮吹干后變白，加0.5 mL無水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤濕后，水浴超聲10 min定容比色或水浴超聲20 min定容比色，其相對偏差＜2%；F檢測值為2.73，查表F表為3.79，F(xiàn)小于F表，X2與X3的 精密度無顯 著性差異；10%天麗紅和10%斑蝥黃的t檢測值分別為0.31和0.57，查表（95%）得：t表=2.45，t小于t表，X2與X3的準確度無顯著性差異。

表3 上清液氮吹干變白后超聲溶解時間對樣品檢測含量的影響

2.1.4 上清液氮吹干變白后靜止溶解時間對樣品檢測含量的影響 移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹至容量瓶底部變白，殘渣用0.5 mL無水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤濕后，靜止溶解20 min或45 min，用環(huán)己烷定容。靜止溶解20 min的檢測數(shù)據為X2，靜止溶解45 min的檢測數(shù)據為X3。

從表4可以看出，樣品氮吹干后變白，加0.5 mL無水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤濕后，靜止溶解20 min定容比色或靜止溶解45 min定容比色，其相對偏差＜2%；F檢測值為1.34，查表F表為3.79，F(xiàn)小于F表，X2與X3的精密度無顯著性差異；10%天麗紅和10%斑蝥黃的t檢測值分別為0.19和0.51，查表（95%）得：t表=2.45，t小于t表，X2與X3的準確度無顯著性差異。

表4 上清液氮吹干變白后靜止溶解時間對樣品檢測含量的影響

2.2 國標GB/T18970-2003與改進后測定數(shù)據的分析 移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于旋轉蒸發(fā)器的圓底燒瓶中，按國家標準：GB/T 18970-2003檢測，檢測數(shù)據為X1。

方法優(yōu)化1：移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹至無溶液，殘渣用0.5 mL無水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤濕后，水浴超聲溶解10 min，用環(huán)己烷定容，檢測數(shù)據為X2。

方法優(yōu)化2：移取樣品溶液制備中離心上層清液5.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用氮吹儀（不需水浴控溫）吹至無溶液，殘渣用0.5 mL無水乙醇和0.5 mL三氯甲烷潤濕后，靜止溶解20 min，用環(huán)己烷定容，檢測數(shù)據為X3。

從表5可以看出，優(yōu)化方法1和優(yōu)化方法2與國標的比對，其F檢測值分別為1.80、1.12，查表F表為3.44，F(xiàn)均小于F表，兩種優(yōu)化方法與國標的精密度無顯著性差異；2.5%斑蝥黃、10%天麗紅、10%斑蝥黃的優(yōu)化方法1和優(yōu)化方法2的t檢測值分別為1.31、0.79、0.25和2.43、0.62、0.58，查表（95%）得：t表=2.78，t小于t表，兩種優(yōu)化方法與國標的準確度無顯著性差異。

表5 國家標準檢測數(shù)據與優(yōu)化方法的數(shù)據比對

3 討論

現(xiàn)行國家標準：GB/T 18970-2003飼料添加劑10%β，β-胡蘿卜-4，4-二酮（10%斑蝥黃），使用的旋轉蒸發(fā)儀，其真空度控制的難度較大，操作過程繁瑣；使用的蒸發(fā)瓶為無色，存在色素降解的風險，因為斑蝥黃對氧氣、光和熱都十分敏感；同時還多了蒸干后溶解轉移的步驟，增加了操作的難度。改進后的方法，直接將5 mL的上清液移到100 mL的棕色容量瓶中（棕色容量瓶有避光的作用），通過氮吹的方式，只需1 h左右就可以吹干，且一次可進行三個樣品氮吹，移取氮吹的上清液，吹干或吹干變白也不影響檢測結果。因為在氮吹時，可能出現(xiàn)剛好吹干或吹白情況，因此將靜止溶解的時間定為20 min或超聲溶解的時間定為10 min。兩種優(yōu)化方法有助于提高檢測的精密度和準確性，同時節(jié)約了檢測時間。