一株改善木薯酒糟發(fā)酵蛋白飼料品質(zhì)的酵母菌株篩選、鑒定和應(yīng)用

高素芹， 王曉偉，2*， 趙孟孟， 荊學(xué)金， 荊忠平， 張明俊，2， 趙志強(qiáng)，2， 武傳菊

（1.山東益昊生物科技有限公司，山東濰坊262400；2.青島諾森生物技術(shù)有限責(zé)任公司，山東青島266706；3.平度市同和動(dòng)物衛(wèi)生與產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督站，山東青島266706）

當(dāng)前我國酒精發(fā)酵生產(chǎn)主要以玉米、稻谷、小麥等糧食作物為原料，但糧食作物原料價(jià)格較高，會(huì)造成酒精發(fā)酵成本增加，限制酒精發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展。而我國南方盛產(chǎn)木薯，其淀粉含量高，且易種植、耐干旱貧瘠，不與糧食作物爭(zhēng)耕地，價(jià)格相對(duì)便宜，因此可作為生產(chǎn)生物酒精的首選原料之一（劉振等，2005）。

酒糟是酒精發(fā)酵生產(chǎn)主要的副產(chǎn)物，其含有豐富的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、礦物質(zhì)、粗淀粉和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，生產(chǎn)1 t酒精類產(chǎn)品的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生數(shù)噸的酒糟，但酒糟中營養(yǎng)物質(zhì)未被利用，不僅會(huì)造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，而且長時(shí)間堆積不處理，還會(huì)造成環(huán)境污染，因此，如何充分利用酒糟的營養(yǎng)價(jià)值對(duì)提高釀酒工業(yè)循環(huán)經(jīng)濟(jì)效益具有關(guān)鍵性的作用（張銀等，2019）。

酒糟傳統(tǒng)的處理方式主要是先沉降，然后離心脫水，最后直接用作飼料，而酒糟上清液大多直接排放，但其化學(xué)需氧量（COD）很高，會(huì)造成環(huán)境污染。針對(duì)上述問題，本研究旨在降低酒糟上清液的COD含量，并得到單細(xì)胞蛋白，提高固體酒糟的蛋白含量，變廢為寶，既能減少環(huán)境污染，又能緩解蛋白飼料的短缺現(xiàn)狀（蔡俊，2001），降低飼料成本，提高飼料營養(yǎng)物質(zhì)含量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 從大曲酒醅等發(fā)酵基質(zhì)中采集樣品，置于無菌封口袋中，用于菌種的分離和篩選。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑D-果糖、L-山梨糖、D（+)木糖、纖維二糖、D-半乳糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、菊糖、D-阿拉伯糖、棉籽糖、葡萄糖、蔗糖，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；提取酵母菌基因組試劑盒和Taq酶，購自大連寶生物工程有限公司。

1.2.2 試驗(yàn)儀器 電子顯微鏡（日本NIKON公司）、恒溫水浴鍋（武漢市琴臺(tái)醫(yī)療器械廠）、恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）、超凈工作臺(tái)（上海智成分析儀器制造有限公司）、恒溫振蕩器（上海智成分析儀器制造有限公司）、全自動(dòng)滅菌鍋（上海博訊有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基 酵母膏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（GYP培養(yǎng)基）：酵母粉5 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，水1000 mL，酸堿度自然；酒醅汁培養(yǎng)基：酒醅50 g，加入250 mL水，煮沸20 min，紗布過濾，調(diào)pH到7.0，定容至250 mL，加5 g瓊脂；酒精耐受培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，調(diào)pH至7.0，滅菌后冷卻至50℃加入10%的乙醇；單糖發(fā)酵培養(yǎng)基：將D-果糖、L-山梨糖、D（+)木糖、纖維二糖、D-半乳糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、菊糖、D-阿拉伯糖、棉籽糖、葡萄糖、蔗糖按2%加入無碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；PDA培養(yǎng)基。

1.4 木薯酒糟的制備

1.4.1 釀酒酵母的活化 取100 mL純凈水，加入250 mL三角瓶中，煮沸后冷卻，加入1.6 g釀酒酵母，2.0 g蔗糖，混勻，38℃水浴鍋中保溫15 min，之后33℃水浴鍋中保溫2 h。

1.4.2 培養(yǎng)基的制備 稱取91.36 g木薯粉放入500 mL三角瓶中，量取208.64 mL水注入，混勻。放入90～95℃水浴鍋中保溫，加液化酶0.045 mL，作用90 min，然后用稀硫酸調(diào)pH至4.0～4.5，放入65℃水浴鍋中保溫，加液化酶0.09 mL，作用30 min，加（NH4）2SO40.6 g，90℃巴氏消毒20 min。

1.4.3 接種 將活化的釀酒酵母按5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，33℃溫箱中培養(yǎng)3 d。

1.4.4 蒸餾酒精 根據(jù)處理酒糟上清液的需要，加入100 mL水，在不少于半個(gè)小時(shí)的時(shí)間內(nèi)蒸出100 mL液體，剩余的固液混合物即木薯酒糟。

1.4.5 離心 將酒糟經(jīng)過4000 r/min離心，取上清，即酒糟上清液。

1.5 黑曲霉發(fā)酵制備

1.5.1 黑曲霉液態(tài)發(fā)酵 將配制好的PDA液體培養(yǎng)基100 mL加入250 mL三角瓶中，115℃滅菌30 min。冷卻后接入已活化的黑曲霉，于32℃，180 r/min培養(yǎng)3 d，4000 r/min離心10 min，得到黑曲霉上清液。

1.5.2 黑曲霉固體發(fā)酵 將含水量約60%的麩皮培養(yǎng)基100 g裝入250 mL三角瓶中，121℃滅菌30 min，冷卻后接入已活化的黑曲霉，于32℃溫箱中培養(yǎng)3 d。

1.6 菌株的分離純化 稱取10 g酒醅加入到90 mL無菌水中，分別于牛肉膏培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，GYP培養(yǎng)基，酒醅汁培養(yǎng)基，酒精耐受培養(yǎng)基上稀釋平板分離。挑取平板上具有典型酵母形態(tài)的單菌落進(jìn)行劃線分離純化，獲得的單菌株分別編號(hào)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 菌株的發(fā)酵與篩選

1.7.1 單菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵 將分離純化得到的菌株分別接種到100 mL木薯酒糟上清液中，35℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 d，上清液中補(bǔ)加（NH4）2SO40.2 g，KH2PO40.1 g，CaCl20.2 g，Mg-SO40.05 g，最后取樣測(cè)菌量、COD值。

1.7.2 復(fù)合菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵 將篩選到的菌株分別與黑曲霉、10%黑曲霉上清液分成三個(gè)組別處理，處理組一：將篩選到的菌株直接接入100 mL木薯酒糟上清液中；處理組二：在100 mL木薯酒糟上清液中先接入10%的黑曲霉上清液，再接入篩選到的菌株；處理組三：將黑曲霉與篩選到的菌株混合后一起接入100 mL木薯酒糟上清液中，在相同條件下，35℃、180 r/min搖床發(fā)酵2 d，最后取樣測(cè)菌量、COD值。

1.7.3 單菌木薯酒糟固體發(fā)酵 稱取木薯酒糟85 g，糖蜜15 g，尿素2 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.1 g，加入60%的水混合均勻，常壓蒸煮30 min，冷卻后將篩選到的菌株按5%的接種量接入，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)40 h，最后取樣測(cè)菌量、粗蛋白質(zhì)、真蛋白含量。

1.7.4 復(fù)合菌木薯酒糟固體發(fā)酵

1.7.4.1 黑曲霉糖化木薯酒糟 將木薯酒糟100 g加水調(diào)至含水量65%，常壓蒸煮10 min，降溫至65℃，拌入10%黑曲霉發(fā)酵料塊，55℃恒溫培養(yǎng)30 h，取樣檢測(cè)還原糖含量。

1.7.4.2 復(fù)合菌木薯酒糟固體發(fā)酵 在經(jīng)過黑曲霉 處 理 后 的 木 薯 酒 糟 中 添 加 （NH4）2SO42 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.1 g，尿素1 g，將篩選到的菌株按5%的接種量接入，37℃恒溫培養(yǎng)40 h，最后取樣測(cè)菌量、粗蛋白質(zhì)含量。

1.8 檢測(cè)方法 粗蛋白質(zhì)測(cè)定：凱氏定氮法（馬丹，2008）；真蛋白測(cè)定（胡艷麗等，2007）；水分測(cè)定：恒重法（天津輕工業(yè)學(xué)院，1980）；還原糖測(cè)定：斐林試劑法（李正智，1965）；活菌菌量的測(cè)定：稀釋平板計(jì)數(shù)法（趙斌等，2002）；COD的測(cè)定：微波消解法（劉華，2009）。

1.9 菌株鑒定

1.9.1 生理生化試驗(yàn) 酵母的糖同化試驗(yàn)按照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》（巴尼特，1991）中生長圖譜法鑒定。

1.9.2 18S rRNA序列擴(kuò)增及分析 提取待測(cè)菌株總DNA作為模板，采用通用引物（正向引物NS1：5/-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3/；反向引物NS4：5/-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3/）進(jìn) 行18S rRNA的PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性（94℃1 min）、變性（94℃1 min）、復(fù)性（50℃1 min）、延伸（72℃1 min），30個(gè) 循 環(huán)；最 后 延 長（72℃5 min），保存（4℃）。

由測(cè)序公司完成測(cè)定18S rRNA全長約1000 bp DNA序列，將所測(cè)得的序列提交到GenBank，應(yīng)用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中已有的酵母18S rRNA序列進(jìn)行相似性比較分析，序列的比較分析及系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA 3.1軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離 采用稀釋平板涂布分離法，從酒醅中共分離得4株典型酵母形態(tài)的菌株。其中，從酒醅汁培養(yǎng)基中分離出兩株菌株，分別編號(hào)為JP-1，JP-2，從酒精耐受培養(yǎng)基中分離出兩株菌株，分別編號(hào)為JJ-1，JJ-2。

2.2 菌株的發(fā)酵與篩選

2.2.1 單菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵 如表1所示，相同條件下，JJ-2在木薯酒糟發(fā)酵上清液發(fā)酵后菌量增加了36.5倍，而JJ-1、JP-1和JP-2發(fā)酵后菌量分別增加1.25倍、4倍、2.75倍，且JJ-2可將酒糟上清液的COD值降低17.17%，而JJ-1，JP-1，JP-2分別只能將COD值降低7.15%、8.58%、7.71%，說明這四株菌株中，JJ-2在木薯酒糟上清液中生長繁殖最好，降低木薯酒糟上清液的COD值幅度最大，且該菌篩選自酒精耐受培養(yǎng)基，具有酒精耐受性，因此，選取該菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 單菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵

2.2.2 復(fù)合菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵 如表2所示，在三組處理中，處理組二發(fā)酵后菌量增加121.5倍，木薯酒糟上清液COD值降低33.91%，均優(yōu)于其他兩個(gè)組別。

表2 復(fù)合菌木薯酒糟上清液液體發(fā)酵

2.2.3 單菌木薯酒糟固體發(fā)酵 如表3所示，菌株JJ-2在木薯固體酒糟中發(fā)酵后菌量達(dá)到3.20×109cfu/g，菌量增加約3200倍，粗蛋白質(zhì)含量增長9.29個(gè)百分點(diǎn)，真蛋白含量增加6.83個(gè)百分點(diǎn)。

表3 單菌木薯酒糟固體發(fā)酵

2.2.4 黑曲霉糖化木薯酒糟 如表4所示，經(jīng)過黑曲霉處理后木薯酒糟的還原糖含量可達(dá)8.2%，達(dá)到了添加糖蜜后木薯酒糟中還原糖含量，因此，可以直接添加菌株進(jìn)行固體發(fā)酵。

表4 黑曲霉糖化固體酒糟不同時(shí)間段還原糖含量%

2.2.5復(fù)合菌木薯酒糟固體發(fā)酵 如表5所示，JJ-2可以在經(jīng)過黑曲霉處理且未添加糖蜜作為碳源的木薯酒糟上較好的發(fā)酵生長，經(jīng)過發(fā)酵活菌數(shù)可達(dá)2.61×109cfu/g，粗蛋白質(zhì)含量增至22.69%，表明能較好的改善木薯酒糟品質(zhì)。

表5 復(fù)合菌木薯酒糟固體發(fā)酵

2.3 生理生化特征 生理生化特征鑒定結(jié)果見表6。

表6 生理生化特征鑒定結(jié)果

2.4 分子生物學(xué)鑒定 由圖1可知，JJ-2的18S rRNA基因核酸序列，與GenBank中Pichia kudriavzevii的核苷酸序列同源性達(dá)到100%。因此，確定JJ-2菌株為Pichia kudriavzevii。

圖1 基于JJ-2的18S rRNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本研究從酒醅中有針對(duì)性的篩選到耐酒精且在木薯酒糟中發(fā)酵良好的酵母菌株JJ-2，經(jīng)過生理生化研究和分子生物學(xué)鑒定，確定為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

酵母菌株JJ-2在木薯酒糟上清液液體發(fā)酵過程中可以有效降低上清液的COD值，在經(jīng)過10%黑曲霉上清液處理后的木薯酒糟上清液中也可以得到良好的發(fā)酵，并且COD值得到了更大程度的降低（COD含量降低了33.91%），說明木薯酒糟經(jīng)過10%黑曲霉上清液處理后，有利于木薯酒糟上清液的液體發(fā)酵。

酵母菌株JJ-2在木薯酒糟固體發(fā)酵過程中，可以良好的生長發(fā)酵，粗蛋白質(zhì)含量提高9.29個(gè)百分點(diǎn)，真蛋白含量提高6.83個(gè)百分點(diǎn)。在實(shí)際生產(chǎn)過程木薯酒糟通常需要添加糖蜜作為碳源進(jìn)行固體發(fā)酵生產(chǎn)，未能充分利用木薯酒糟中碳源，本試驗(yàn)通過添加黑曲霉對(duì)木薯酒糟進(jìn)行糖化處理，可達(dá)到添加糖蜜后還原糖的含量水平，并且酵母菌株JJ-2在經(jīng)黑曲霉糖化后的木薯酒糟發(fā)酵過程中，也可以良好的生長發(fā)酵，并且粗蛋白質(zhì)含量也得到了很大程度的提高（增長7.89個(gè)百分點(diǎn)）。

綜上可知，本研究篩選的酵母菌株JJ-2可適用于木薯酒糟的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，在降低木薯酒糟上清液COD、提高木薯酒糟蛋白含量方面有著很大改善作用，不僅緩解了木薯酒糟上清液排放對(duì)環(huán)境造成的污染壓力，而且還提升了木薯酒糟的飼料應(yīng)用營養(yǎng)價(jià)值和飼料蛋白品質(zhì)，增大了木薯酒糟的應(yīng)用領(lǐng)域。