六羥基黃酮的抑菌及抗氧化性研究

孫 磊， 吳娟娟， 王歡歡， 陳寶江，2*， 吳 迪*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河北保定071000；2.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定071000；3.晨光生物科技集團股份有限公司，河北邯鄲056000）

畜牧業(yè)的健康發(fā)展對保證中國農(nóng)業(yè)健康發(fā)展和提高人民生活水平十分重要，在飼料中添加抗生素有改善動物機體機能和促進營養(yǎng)吸收的作用。但近年來越來越多研究表明，抗生素的使用會加速畜禽耐藥性的出現(xiàn)，同時還會造成畜產(chǎn)品中抗生素殘留，進而會影響食品安全和公共衛(wèi)生安全。因此，尋求抗生素替代成為動物營養(yǎng)研究的熱點。

動物由于飼料、環(huán)境等多種原因，腸道中經(jīng)常感染有害細菌，常見的有大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形菌等（史同瑞等，2013），這類有害菌寄生在腸道內(nèi)，可引起腹瀉，危害動物的健康和生產(chǎn)性能，甚至引發(fā)畜禽死亡（季秋晴等，2018）。同時，由于飼料中長期添加抗生素，已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性（孫和濤，2013）。因此，篩選合適的抑菌產(chǎn)品意義重大；另外，集約化飼養(yǎng)管理、飼養(yǎng)環(huán)境、運輸?shù)榷喾N因素，又會使動物處于長期應激狀態(tài)，體內(nèi)自由基超量產(chǎn)生，健康受損。

研究表明，植物中的黃酮類物質(zhì)，不僅有一定抑菌消毒能力，還具有抗氧化、抗輻射等良好作用（Manjinder等，2014）。飼糧中添加黃酮類化合物可有效提高機體抗氧化能力，從而有效增強機體抵抗力（徐國銀，2007）；日糧中添加某種黃酮類化合物可起到清除自由基，增強仔豬抗病和抗腫瘤性，減少腹瀉率的作用（趙萌等，2016）。此外，黃酮類還具有幫助改善家畜的胃腸道血管黏膜濕潤狀態(tài)、調(diào)節(jié)家畜腸道益生菌群以及幫助緩解熱應激等特殊營養(yǎng)功效。

六羥基黃酮主要存在于黃芩的根、莖皮等部位，也可以通過化學方法合成（喬宇和石波，2019），有保肝、抗癌、抗炎等多種藥物治療以及保健作用（王放等，2016）。但對其抑菌效果及抗氧化性能的研究鮮見報道。本試驗以六羥基黃酮為對象，研究其對畜禽腸道常見有害菌的抑菌效果及抗氧化能力，為其在飼料上的使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種 有害菌：凍干菌粉金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、腸沙門氏菌腸亞種（ATCC13076）、奇異變形桿菌（CMCCB 49005）、大腸埃希氏菌（CICC 10899），購于國家菌種保藏中心。

1.2 試驗試劑 六羥基黃酮：由萬壽菊中提取，晨光生物科技集團股份有限公司提供；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、無水乙醇、水楊酸、H2O2、維生素C、Fe-SO4·7H2O、DPPH等，均為分析純。

1.3 儀器與設備DSHG-300A型水浴恒溫振蕩器；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱；SW-CJ-1B型潔凈工作臺；QL-861型螺旋振蕩器；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器；ELx800型酶標儀；722型可見分光光度計；96孔板（Costar公司）。

1.4 抑菌活性測定 本試驗采用標準的牛津杯法，通過測定抑菌圈大小來檢測六羥基黃酮對4種菌的抗菌作用。抑制細菌圈小于10 mm，為低程度敏感；10～15 mm，為中等程度敏感；15～20 mm，為高度敏感；20 mm以上，為極度敏感。

1.5 最小抑菌濃度測定 本試驗最小抑菌濃度（MIC）采用二倍稀釋法檢測。

細菌百分抑制率/%=1-細菌生長百分比（%）。

1.6 抗氧化性測定 取1 g六羥基黃酮于250 mL錐形瓶中，按1:50比例加入六羥基黃酮和提取液，60%的酒精溶液提取，60℃下水浴振蕩30 min。過濾，100 mL容量瓶收集濾出液體至容量瓶的刻度線。

1.6.1 水楊酸法對·OH清除能力 按照濃度順序分別添加2 mL不同體積的樣品于10 mL PC離心管中，濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 mL，再加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，隨后加入超純水使反應體系達到10 mL。37℃靜置30 min。測定吸光度Ax。空白組以相同體積的超純水替代六羥基黃酮，其他步驟相同，記為A0。測定Ax和A0時以超純水為參比溶液。·OH清除率的計算公式為:

式中：A0為空白的吸光度值；Ax為加樣品的吸光度值。

1.6.2 DPPH法測定清除能力DPPH溶液配制：0.0197 g DPPH溶解于250 mL無水乙醇。依次分別 加 入 樣 品 液0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0 mL于10 mL離心管中，再加入0.2 mmol/L DPPH 2 mL，添加酒精溶液使反應體系達到8 mL，避光30 min后517 nm測吸光度Ax，此為試驗組?？瞻捉M用一樣體積的乙醇代替樣品液，測得吸光度A0。對照組用乙醇代替DPPH溶液，測得吸光度Aj。測定Ax、Aj和A0時以無水乙醇為參比溶液。DPPH清除率計算公式為：

式中：Ax為加樣品的吸光度值；Aj為對照的吸光度值；A0為空白的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 六羥基黃酮對4種有害菌的抑制效果 由表1可以看出，六羥基黃酮對4種有害菌均有抑制作用。當其濃度為5 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌抑制均達到中等敏感程度，奇異變形菌達到高程度敏感；20 mg/mL以后，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、奇異變形菌均達到高程度敏感。在本試驗范圍內(nèi)，抑菌圈能力隨六羥基黃酮濃度增高而變大。

表1 六羥基黃酮對4種有害菌的抑菌效果mm

2.2 六羥基黃酮對4種有害菌的最小抑菌濃度由表2可以看出，六羥基黃酮對奇異變形菌MIC最小，為0.125 mg/mL；其次為金黃色葡萄球菌與大腸桿菌；對腸沙門氏菌MIC最大。

表2 六羥基黃銅對4種有害菌最小抑制濃m度g/mL

2.3 六羥基黃酮對·OH的清除率 由表3可知，在樣品量為2.00～4.50 mL（濃度梯度0.03～0.26 mg/mL），六羥基黃酮對·OH的清除能力隨濃度增大逐漸增長，在樣品量4.50～6.50 mL（濃度梯度0.26～0.37 mg/mL），清除率趨于平緩，在樣品量6.50 mL（0.15 mg/mL濃度）清除率最高，為86.67%。在相同梯度下，六羥基黃酮對·OH的清除能力略低于維生素C。

表3 六羥基黃酮對·OH的清除效果%

2.4 六羥基黃酮對DPPH的清除率 由表4可知，DPPH的清除能力隨著六羥基黃酮濃度的增大逐漸加強。在樣品量0.6～4.8 mL（濃度梯度0.01～0.11 mg/mL），DPPH清除率穩(wěn)步增加，在樣品量4.8 mL（濃度梯度0.11 mg/mL）時，清除率到最高，為96.69%，在樣品量4.8 mL（0.11 mg/mL濃度）之后清除率逐漸平緩。并且在此梯度以上，六羥基黃酮的最大清除比率明顯高于維生素C。

表4 六羥基黃酮對DPPH的清除效果%

3 討論

3.1 六羥基黃酮抑菌分析 六羥基黃酮的抑菌能力主要由其化學結(jié)構(gòu)決定，黃酮芳環(huán)上羥基的化學結(jié)構(gòu)位置和其個數(shù)直接影響其抑菌活性。黃酮類化合物的抗菌活性主要體現(xiàn)在破壞細菌細胞膜、減緩菌體能量代謝及降低細菌的致病性等（柯春林等，2015；楊彩霞，2014）。它的抑制菌能力與其膜交互作用有緊密的聯(lián)系（吳婷，2014）。黃酮可以通過羥基破環(huán)細菌的細胞膜，使其營養(yǎng)物質(zhì)流失（侯媛媛，2015）。同時，還可以抑制細菌DNA拓撲異構(gòu)酶，導致其體內(nèi)某些蛋白和酶表達量的下降，引起菌體多種生物學功能的喪失，從而抑制菌體的生長和繁殖（陳禹先等，2013）。

研究證實，某些黃酮抑制細菌效果良好。張洺嘉等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，黃酮能阻礙細菌細胞膜的形成；Basile等（1999）研究結(jié)果顯示，黃酮類化合物對奇異變形菌MIC為0.016 mg/mL；趙香汝等（2010）采用紙片擴散法測定了多種中藥對奇異變形菌及其他細菌的抑制效果，其中黃芩對奇異變形菌的抑菌圈為8 mm，MIC為7.8 mg/mL。而本研究的數(shù)據(jù)顯示，六羥基黃酮濃度為0.1 mg/mL時有抑制細菌效果，抑制細菌圈的直徑為13.36 mm，MIC為0.125 mg/mL，與上述研究結(jié)果相似。付璟等（2014）采用濾紙片法得出，六羥基黃酮對大腸桿菌的MIC為0.3125 mg/mL。本試驗得出的結(jié)果顯示，對大腸桿菌的抑制效果在濃度為100 mg/mL時最佳，抑制菌圈直徑為19.80 mm，MIC為0.625 mg/mL。這與上述結(jié)果存在一定差異，可能是由于本試驗所采用的六羥基黃酮純度與其他試驗不一致，同時，牛津杯法與濾紙片法存在一定差異。

云寶儀等（2013）用牛津杯法探究黃芩素對MRSA的抑制能力，其抑菌圈直徑達到16 mm，MIC為0.04 mg/mL。張有志等（2014）采用牛津杯法研究黃芩醇提取物對金黃葡萄球菌的抑制活性發(fā)現(xiàn)，150、200、250、300 μg/μL時抑菌圈直徑分別為17、18、18、18 mm。而本試驗結(jié)果是在濃度為100 mg/mL時，抑制效果最佳，抑制細菌圈約為16.64 mm，不論是濃度增大還是濃度降低，抑菌效果都會變?nèi)?。本試驗結(jié)果與上述結(jié)果大體相似。但達到同樣的抑菌效果，本試驗的供試藥液需要更高的濃度，這可能是因為所使用的菌種型號和所用的供試藥液的純度不同而導致的差異。

張霖等（2011）采用了體外藥敏試驗，得出黃酮對于鼠傷寒沙門菌的抑制細菌圈直徑為11 mm。侯媛媛等（2015）研究表明，黃芩素在10 mg/mL時，對沙門氏菌的抑制細菌圈直徑為14.6 mm左右，MIC為1 mg/mL。本試驗中，六羥基黃酮MIC為2.5 mg/mL。與上述結(jié)論相似，但同樣濃度的抑制效果有所差異，這可能是六羥基黃酮的抗菌成分提取方式不同導致抗菌成分含量不一致，從而導致抑菌效果有所差異。

3.2 六羥基黃酮抗氧化分析 六羥基黃酮抗氧化的內(nèi)在機理是提供一個或多個氫原子，與脂類有機化合物的自由基相結(jié)合，轉(zhuǎn)變成酚基自由基，從而降低了氧化速度（岳慶磊等，2003）。李志等（2019）研究結(jié)果表明，薏苡仁總黃酮與DPPH清除率之間呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。本試驗中，六羥基黃酮對·OH和DPPH有較強的清除作用。在2.00～4.50 mL（濃度梯度0.03～0.26 mg/mL）時，六羥基黃酮對·OH的清除效果隨含量升高而變強，最后逐漸穩(wěn)定；六羥基黃酮對·OH的清除作用雖略小于VC，但差值在10%之內(nèi)。六羥基黃酮對DPPH的清除能力也隨含量升高而變大，與上述結(jié)果相似。六羥基黃酮雖略比VC的清除率低，但在樣品量為4.8～6.0 mL（濃度梯度0.11～0.14 mg/mL）時，六羥基黃酮抗氧化性略強于VC。可以認為六羥基黃酮具有非常強的抗氧化效果。

4 結(jié)論

六羥基黃酮對4種有害菌均有較強的抑菌能力，濃度為100 mg/mL時效果最好。六羥基黃酮對·OH、DPPH的最大清除率分別為86.67%、96.69%，總體抗氧化性水平與維生素C接近。