當歸-骨碎補配伍治療骨折三期辨證中期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制

李志鴻， 葉學(xué)勁， 劉經(jīng)鵬， 陳文陽， 滕居贊

（1.廣州市荔灣區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州510000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530011；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西南寧530000）

骨折常導(dǎo)致骨折不愈合[1-2]。中醫(yī)學(xué)將骨折治則分為三期，骨折中期相當于原始骨痂形成期，此期的特點是腫痛較前期減輕，但瘀腫尚未消盡，筋骨雖連而未堅，故此期宜和營生新、接骨續(xù)損。骨折的愈合是從修復(fù)過程的起始直至骨折最終塑形完成為止的一個連續(xù)不斷的過程。而骨折中期是連接初、后期的一個必不可少的“樞紐”。一旦骨折中期愈合欠佳，將會導(dǎo)致骨折初期治療盡棄，而骨折后期過程停滯，最終導(dǎo)致骨折不愈合。骨折中期治療常用的代表中藥為當歸、骨碎補[3]。當歸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傘形科多年生草本植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸的作用。骨碎補始載于《藥性本草》，為水龍骨科多年附生蕨類植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.SM.的干燥根莖，其功效主要為活血續(xù)傷、補腎強骨。當歸、骨碎補對推進骨折愈合進程有明顯的作用[4]，骨折的愈合與血液供應(yīng)、骨膜完整性破環(huán)程度、斷端的接觸、周圍肌群的影響相關(guān)。中藥因其成分復(fù)雜，對其有效成分的研究開展受限，而中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則可從中藥的化合物-靶向-疾病關(guān)系反映、闡述其之間的相互作用。本研究系統(tǒng)性運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法綜合探討當歸-骨碎補可能的化合物構(gòu)成，并分析當歸-骨碎補配伍治療骨折三期辨證中期可能的藥理學(xué)機制，以期為下一步的藥物基礎(chǔ)研究提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 當歸-骨碎補的化學(xué)成分借助中藥系統(tǒng)藥理 學(xué) 分 析 平 臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分別檢索當歸、骨碎補的所有化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%[5]，類藥性（DL）≥0.18[6]為篩選標準，篩選當歸、骨碎補中的活性成分，最后得到當歸2個、骨碎補18個化合物。

1.2 當歸-骨碎補化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將通過TCMSP平臺按照篩選標準所得的當歸-骨碎補的20個化合物及其258個靶點，應(yīng)用Cytoscape3.7.1開放源碼的生物信息分析軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 當歸-骨碎補靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫10.5線上軟件（http：//string-db.org），將篩選所得的當歸-骨碎補靶點上傳，選擇智人種（homo sapiens），應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建當歸-骨碎補靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 閉合骨折相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建基于CTD（https：//ctdbase.org）和GeneCards（https：//www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫綜合篩選挖掘閉合骨折相關(guān)靶點，構(gòu)建閉合骨折相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫，與當歸-骨碎補化合物靶點進行對比分析，篩選出當歸-骨碎補作用于閉合骨折的靶點，應(yīng)用Venny 2.1在線工具（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/）繪制韋恩圖。

1.5 當歸-骨碎補化合物靶點與閉合骨折相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建根據(jù)當歸-骨碎補化學(xué)成分-靶點預(yù)測結(jié)果和靶點-疾病預(yù)測結(jié)果，應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件中的“Merge”功能，將2個預(yù)測結(jié)果合并成“化學(xué)成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，進行全局化可視網(wǎng)絡(luò)分析。通過Network Analysis功能計算網(wǎng)絡(luò)的拓撲參數(shù)，分析其相互關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 有效化合物的篩選本研究搜索到化合物共196個，其中，當歸化合物125個，骨碎補71個。最后篩選得到當歸2個、骨碎補18個化合物，主要活性成分的OB和DL值見表1。

表1 當歸、骨碎補主要有效化合物信息Table 1 Data of main effective constituents from Radix Angelicae Sinensis and Rhizoma Drynariae

2.2 當歸-骨碎補化學(xué)成分潛在靶點預(yù)測及相互作用篩選當歸、骨碎補化合物的有效靶點共258個，構(gòu)建“化合物成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。當歸-骨碎補化合物靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見圖2。

圖1 當歸-骨碎補化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae constituent-target network

圖2 當歸-骨碎補靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Target protein interaction network of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae

2.3 閉合骨折相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建以“Closed Fracture”或“Fracture Closed”作為關(guān)鍵詞在CTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫中查詢，初步篩選出CTD數(shù)據(jù)庫72個，GeneCards數(shù)據(jù)庫2 950個，共3 022個候選基因。根據(jù)“Reference Count”值取GeneCards數(shù)據(jù)庫中相關(guān)度最高的前200個結(jié)果，其中與閉合骨折靶點有25個重合，分別為VEGFA、RB1、PPARG、MET、ESR1、CA2、AR、MMP2、IL-6、TP53、VCAM1、PTGS2、NOS2、ABCC1、MAPK3、MAPK1等。當歸-骨碎補靶點與閉合骨折靶點的韋恩圖，見圖3。當歸-骨碎補對閉合骨折作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4。當歸-骨碎補化合物-靶點-閉合骨折的全局性網(wǎng)絡(luò)，見圖5。

圖3 當歸-骨碎補靶點與閉合骨折靶點的韋恩圖Figure 3 Venn diagram of targets related with Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae and closed fracture

圖4 當歸-骨碎補對閉合骨折作用靶點蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)Figure 4 Interaction network of target proteins of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture

圖5 當歸-骨碎化合物-靶點-閉合骨折網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae constituent-target-closed fracture network

2.4 當歸-骨碎補對閉合骨折作用靶點的京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析和基因本體論（GO）分析將當歸-骨碎補對閉合骨折的25個作用靶點上傳ClueGO插件中進行GO分析，GO分析注釋圖見圖6~8。得出111個生物學(xué)過程（biological process，BP），包括：對雌激素的反應(yīng)（response to estrogen），對缺氧的反應(yīng)（response to hypoxia），轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)，NDA模板化（positive regulation of transcription，DNA-templated），細胞對缺氧的反應(yīng)（cellular response to hypoxia）等；19個細胞組成（cellular component，CC），包括細胞膜穴樣內(nèi)陷（caveola）、細胞外空隙（extracellular space）、細胞質(zhì)（cytosol）等。24個分子功能（molecular function，MF），包括：酶結(jié)合（enzyme binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、轉(zhuǎn)錄因子逆結(jié)合（transcription factor binding）、相同的蛋白結(jié)合（identical protein binding）等。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，當歸-骨碎補作用于閉合骨折的靶點的通路有51條，主要包括：癌 癥 通 路（pathways in cancer）、膀 胱癌（bladder cancer）、低氧誘導(dǎo)因 子1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路（PI3K/Akt signaling pathway）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路（VEGF signaling patway）等等，見圖9。

圖6 當歸-骨碎補對閉合骨折作用靶點的GO分析Figure 6 GO analysis results for the targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture

圖7 當歸-骨碎補對閉合骨折作用靶點的GO分析結(jié)果（P＜0.05）Figure 7 GO analysis results for the targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture（P＜0.05）

圖8 當歸-骨碎補治療閉合骨折靶點的GO分析結(jié)果餅狀圖（P＜0.05）Figure 8 Pie chart of targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture by GO analysis（P＜0.05）

圖9 當歸-骨碎補對閉合骨折作用靶點的KEGG分析的氣泡圖Figure 9 Bubble diagram for targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture by KEGG analysis

3 討論

骨折屬于中醫(yī)學(xué)“骨折病”的范疇?！墩w類要》指出：“肢體損傷外，則氣血傷于內(nèi)，營衛(wèi)有所不貫，臟腑由之不和?！遍_創(chuàng)了“氣血學(xué)說”和“平補法”的理論基礎(chǔ)，主張以補氣血、活血、補肝腎為主的治法。當歸-骨碎補作為骨折三期辨證中期治療常用的藥物配伍，其臨床療效肯定?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，當歸具有抗凝血、止血[7]，改善血液循環(huán)[8]，促進造血[9]的作用；骨碎補具有促進成骨細胞生成[10]、礦化[11]，促進骨折愈合[12]的作用。但目前國內(nèi)對當歸、骨碎補促進骨折愈合機制的研究多局限在當歸多糖、當歸提取物，骨碎補總黃酮[13-14]、骨碎補提取物這一類化合物，且對當歸-骨碎補在骨折愈合的體內(nèi)代謝作用機制研究鮮見。故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對當歸-骨碎補配伍治療骨折三期辨證中期的機制進行可能性推斷。

本研究篩選最后得到當歸2個、骨碎補18個化合物。其中：β-谷甾醇（beta-sitosterol）可能通過改變體外成骨活性而改善骨脆性和骨折形態(tài)[15]。山柰酚（kaempferol）能抑制破骨細胞分化并促進其凋亡，促進骨細胞樣MG-63細胞系的分化，并減弱TNF在MC3T3-E1小鼠成骨細胞系中的信號傳導(dǎo)[16]，亦可通過促進成骨細胞功能和抑制骨髓中的脂肪細胞形成來預(yù)防去卵巢大鼠模型誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失[17]。柚皮素（naringenin）可作為超氧化物清除劑，有助于內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)保護骨骼免受骨質(zhì)疏松癥的侵害，而含有柚皮素的假蒟（Piper sarmentosum）的提取物則具有抑制脂肪組織和骨中11β-羥基類固醇脫氫酶1（11β-HSD1）表達和活性能力，從而恢復(fù)骨骼結(jié)構(gòu)和強度[18]。木犀草素（luteolin）可以通過促進糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥中的成骨細胞分化、礦化和增殖來增加骨形成，其通過抑制活性氧（ROS）的過度生成來抑制成骨細胞增殖，增強成骨標志物的表達以促進成骨細胞分化和增加骨保護素（OPG）/核因子κB受體活化因子配體（RANKL）比率以維持骨量，從而減弱成骨細胞凋亡。此外，木犀草素可增強OPG/RANKL比率和成骨細胞分化減輕糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥[19]。本研究分析結(jié)果表明，當歸-骨碎補化合物主要以甾醇類、黃酮類為主，且與目前現(xiàn)有研究結(jié)果一致。此外，還包括黃烷酮類（flavanones）、固醇類（stigmasterols）、海州骨碎補苷（marioside_qt）等。

對當歸-骨碎補對閉合骨折的25個作用靶點進行GO分析，涉及111個生物學(xué)過程、19個細胞組成、24個分子功能。KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)當歸-骨碎補作用于閉合骨折的通路有51條，主要明確涉及HIF-1信號通路、TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、VEGF信號通路等。氧供是影響骨折愈合的重要因素，HIF-1在調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，研究[20]發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下MC3T3-E1小鼠成骨細胞活力下降，HIF-1α蛋白表達增加，HIF-1α轉(zhuǎn)染的MC3T3-E1細胞的存活率高于未強制表達HIF-1α的細胞，HIF-1α在MC3T3-E1細胞系中的強制表達通過抑制細胞凋亡減弱了缺氧誘導(dǎo)的成骨細胞活力下降。TNF-α在干細胞向成骨分化過程中扮演著雙重角色（促進或抑制成骨分化），而TNF-α的作用時間，作用濃度及作用的干細胞類型又可能是決定其促進或抑制干細胞成骨分化的主要因素[21]。PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、存活、遷移和代謝過程的最為重要的一個信號通路。越來越多的證據(jù)表明，骨組織中的許多信號分子能夠選擇性激活PI3K/Akt信號通路的相關(guān)基因，通過調(diào)控成骨細胞和破骨細胞的活動，破壞骨重建過程中骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡[22]。miR-28-3p可以通過活化PI3K/Akt信號途徑而加速骨折愈合過程[23]。miR-181a/b-1通過調(diào)節(jié)第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因（PTEN）/PI3K/Akt軸和線粒體代謝促進骨生成[24]。VEGF是一種重要的信號蛋白，參與血管生成（胚胎循環(huán)系統(tǒng)的新生形成）和血管生成（從已存在的血管系統(tǒng)中生長血管）。研究[25]表明，骨碎補可通過激活VEGF/VEGFRs的表達，促進骨折愈合。早期骨質(zhì)疏松細胞（Osterix+）的VEGFA，但不是成熟的成骨細胞/骨細胞（Dmp1+），對于快速骨膜血管生成和編織骨形成的骨損傷時至關(guān)重要。而在損傷時需要來自另一種細胞來源而非來自成骨細胞譜系的VEGFA，以獲得最大的皮質(zhì)缺損髓內(nèi)血管生成和骨生成[26]。因此，預(yù)測當歸-骨碎補可能通過調(diào)控HIF-1、TNF、PI3K/Akt、VEGF等信號通路促進骨折三期辨證中期的愈合。

綜上所述，本研究以當歸-骨碎補主要活性成分為研究對象，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過分析其主要的活性成分，構(gòu)建“化合物-靶向-疾病”的關(guān)系，初步在分子層面展示了當歸-骨碎補作用于骨折三期辨證中期的機制，且大部分預(yù)測結(jié)果與現(xiàn)代藥理學(xué)研究相符，為科學(xué)用藥提供了指導(dǎo)；然而，本研究僅在分子水平初步預(yù)測當歸-骨碎補的作用機制，缺乏入血移行成分預(yù)測，且缺乏藥物相互作用機制研究，具有一定的局限性，因此，有待進一步加以理論完善以及實驗驗證。