基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討逍遙丸治療抑郁和焦慮的作用機(jī)制

劉 琳，鄒俊波，張小飛，王 媚，郭東艷，周 曉，王 林，張 雪，史亞軍

（陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046）

近些年，人們的生活和工作以及學(xué)習(xí)壓力不斷增加，使得抑郁癥和焦慮癥患病率也大幅度提升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界患有抑郁癥的人數(shù)占3.01%～5.00%，患有焦慮癥占4.00%～6.50%［1］。在我國(guó)18歲以上的成年人當(dāng)中，23.4% 的人有抑郁癥狀，4.6%的人患有抑郁癥［2］，4.98%的人患有焦慮，其中大學(xué)生和就業(yè)人群甚為嚴(yán)重。目前，治療抑郁和焦慮的藥物主要是以西藥為主，如艾司西酞普蘭、文拉法辛、苯二氮卓類等藥物。但其副作用大、依賴性強(qiáng)、用藥周期長(zhǎng)，給患者身體帶來(lái)了一定的傷害。

逍遙丸收錄于宋代的《太平惠民和劑局方》，由柴胡、薄荷、當(dāng)歸、芍藥、茯苓、白術(shù)以及生姜、甘草組成。具有疏健脾、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、肝氣不舒等功效，臨床上應(yīng)用于婦女乳腺增生、經(jīng)前期綜合征、月經(jīng)失調(diào)、多囊卵巢綜合征、圍絕經(jīng)期綜合征、慢性肝炎腸易激綜合征、神經(jīng)功能紊亂綜合征以及焦慮和抑郁癥等多種疾病［3，4］。尤其在婦科疾病的應(yīng)用極為廣泛，被稱為“女科圣藥”。同時(shí)它作為疏肝法的代表方，近些年來(lái)在治療焦慮癥和抑郁癥中效果也頗為顯著。但中藥復(fù)方具有“多成分、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)，使得逍遙丸治療抑郁癥和焦慮癥的作用機(jī)制尚未得到很好的闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，分析藥物與該網(wǎng)絡(luò)中特定節(jié)點(diǎn)或模塊之間的相互作用，從而了解藥物與機(jī)體相互作用的科學(xué)?；凇岸嗷?多靶點(diǎn)-復(fù)合疾病”模型，系統(tǒng)地探討了藥物與疾病之間的關(guān)系［5，6］。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中藥復(fù)方相結(jié)合，可以解釋中藥的作用機(jī)理，找到中藥的有效物質(zhì)。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究逍遙丸治療抑郁和焦慮的機(jī)制，為抑郁癥和焦慮癥的防治提供新思路，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材成分靶點(diǎn)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）對(duì)逍遙丸中八味藥材：柴胡、薄荷、當(dāng)歸、芍藥、茯苓、白術(shù)、生姜、甘草分別進(jìn)行化學(xué)成分搜集。根據(jù)ADME 參數(shù)設(shè)置口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18 為篩選條件，獲得具有較高活性的化合物成分以及靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)收集

分 別 以“anxiety”、“depressive disorder”為 關(guān) 鍵檢索詞在Malacards 和Genecards 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)查找與其相關(guān)的基因靶點(diǎn)。Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)首頁(yè)輸入檢索詞后分別以Score≥9.00、Score≥25.00 為篩選條件找到相對(duì)應(yīng)的疾病靶點(diǎn)。

1.3 “藥材成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)上述預(yù)測(cè)與篩選結(jié)果，刪除沒(méi)有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分以及重復(fù)的靶點(diǎn)。利用Venny 2.1.0 找到與疾病的共同靶點(diǎn)。創(chuàng)建“藥材成分-靶點(diǎn)”、“疾病-靶點(diǎn)”關(guān)系文件以及屬性文件，導(dǎo)入到Cytoscap（3.2.1）構(gòu)建“藥材成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將疾病與藥材的共同靶點(diǎn)輸入String 中的“multiple proteins”，選擇“Homo sapiens”檢索。下載蛋白相互作用的tsv 文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 根據(jù)節(jié)點(diǎn)自由度選擇篩選重要靶點(diǎn)。

1.5 生物通路富集分析

在R 軟件平臺(tái)安裝cluster profiler 軟件包，對(duì)重要靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和kegg 功能富集分析，將結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式輸出。再使用R 平臺(tái)的top GO軟件包構(gòu)建交互網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 成分靶點(diǎn)收集結(jié)果

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共收集了161 種化合物，其中柴胡17 種、當(dāng)歸2 種、白芍13 種、茯苓15 種、白術(shù)7 種、生姜5 種、甘草82 種、薄荷20 種。八味藥材總共含有247 個(gè)靶點(diǎn)（不包括重復(fù)靶點(diǎn)）。

2.2 疾病靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

Malacards 數(shù)據(jù)庫(kù)中找到關(guān)于焦慮癥的靶點(diǎn)8個(gè)、抑郁癥靶點(diǎn)4 個(gè)。Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)中以Score≥9.00 找到關(guān)于焦慮癥的靶點(diǎn)有337 個(gè)，Score≥25.00 的找到關(guān)于抑郁癥的靶點(diǎn)有379 個(gè)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)找到的靶點(diǎn)去除重復(fù)靶點(diǎn)后焦慮癥的相關(guān)靶點(diǎn)有337 個(gè)，抑郁癥的相關(guān)靶點(diǎn)有379 個(gè)。分別將藥材成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)輸入Venny 2.1.0 作圖后，發(fā)現(xiàn)疾病與藥材共同靶點(diǎn)有24 個(gè)，焦慮癥和抑郁癥的共同靶點(diǎn)有150 個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 逍遙丸與疾病之間共同靶點(diǎn)圖Fig 1 Common targets between Xiaoyao Wan and diseases

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將24 個(gè)共同靶點(diǎn)上傳至String 數(shù)據(jù)庫(kù)，組織（organism）設(shè)置為“Homo sapiens”得到蛋白與蛋白之間相互作用的圖，如圖2。然后下載PPI tsv 文件將其導(dǎo)入Cytoscape，再將疾病-靶點(diǎn)、藥材-靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 中作出“逍遙丸-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3 所示。利用Network Analyer 計(jì)算出網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)“betweenness centrality”、“closeness centrality”、“degree”后，在NetworkAnalye 中 的Visualize Parameters 選擇“Degree”得到圖4。圖中顏色越深節(jié)點(diǎn)越大表示相關(guān)性越強(qiáng)、越重要。度值由高到低為鈉依賴性去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體（APP）、D（2）多巴胺受體（DRD2）、鈉依賴型5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（SLC6A 4）、白 細(xì) 胞 介 素-6（IL-6）、MU 型 阿 片 受 體（OPRM1）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、胺氧化酶［含黃素］A（MAOA）、5-羥色胺受體2A（HTR2A）、單胺氧化酶B（MAOB）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、5-羥色胺受體3A（HTR3A）、大麻素受體1（CNR1）、鈉依賴型多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC6A3）、D（2）多巴胺受體（DRD1）、雌激素受體（ESR1）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、雌激素受體（ESR1）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、超氧化物歧化酶［Cu-Zn］（SOD1）、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（SLC6A2）、γ-氨基丁酸受體亞單位α-2（GABRA2）、血清對(duì)氧磷酶/芳香酯酶1（PON1）、γ-氨基丁酸受體亞單位α-1（GABRA1）、神經(jīng)元型乙酰膽堿受體亞單位α-7（CHRNA7）。

圖2 String 中24 個(gè)蛋白之間相互關(guān)系圖Fig 2 The relationship diagram of 24 proteins in String

圖3 “逍遙丸-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 The network diagram of“Xiaoyao Wan-targetsdiseases”

圖4 靶點(diǎn)與靶點(diǎn)相互關(guān)系圖Fig 4 The relationship map between targets

2.4 功能富集分析

為了解逍遙丸在治療抑郁和焦慮中發(fā)揮作用的機(jī)制，本文通過(guò)R 語(yǔ)言的cluster profiler 軟件包執(zhí)行GO 和KEGG，共富集并排列了1 231 條路徑，其中KEGG 有72 條路徑，表1 顯示了前10 條路徑。圖5 的氣泡圖是根據(jù)P值大小排列的，P值越小表示該路徑與疾病的相關(guān)性越強(qiáng)。可以看出神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）、可卡因成癮（cocaine addiction）、多巴胺能突觸（dopaminergic synapse）、酒精中毒（alcoholism）、苯丙胺成癮（amphetamine addiction）、嗎啡成癮（morphine addiction）、朊病毒?。╬rion diseases）、非洲錐蟲(chóng)?。ˋfrican trypanosomiasis）、尼古丁成癮（Nicotine addiction）等參與抑郁和焦慮的病理發(fā)展。通過(guò)圖6 和表2 可以了解到這些路徑上的靶點(diǎn)如DRD2、DRD1、HTR2A、MAOB、MAOA、SLC6A3 是同時(shí)作用于許多不同的路徑。通過(guò)cluster profiler 包重建了圍棋交互網(wǎng)絡(luò)，此網(wǎng)絡(luò)反映這些圍棋術(shù)語(yǔ)之間的內(nèi)部關(guān)系，根據(jù)圖7 可以看出圓點(diǎn)顏色越紅形狀越大代表此路徑與該病理發(fā)展越明顯。

圖5 KEGG 前20 條P 值顯著的通路富集氣泡圖Fig 5 Enrichment of the first 20 pathways of KEGG pathway

圖6 抑郁、焦慮、逍遙丸靶點(diǎn)的KEGG 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig 6 KEGG interaction network diagram of depression，anxiety and Xiaoyao Wan targets

圖7 核心靶點(diǎn)調(diào)控途徑網(wǎng)絡(luò)圖Fig 7 Network diagram of core targes regulation pathway

表1 KEGG 通路富集前10 條路徑Tab 1 Enrichment of the first 10 pathways of KEGG pathway

表2 數(shù)字所代表的靶點(diǎn)Tab 2 Targets represented by number

GO 分析結(jié)果表示，在“生物過(guò)程（BP）”中富集1 024 條路徑，根據(jù)矯正后的P值進(jìn)行排序得到柱形圖，見(jiàn)圖8。由圖可以看出，逍遙丸治療抑郁和焦慮的靶點(diǎn)主要參與對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)（response to toxic substance）、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)（regulation of neurotransmitter levels）等過(guò)程的調(diào)節(jié)。GO 分析在“細(xì)胞成分（CC）”中富集了54 條路徑，P值最顯著的前20 項(xiàng)如圖9，從細(xì)胞組分的富集結(jié)果來(lái)說(shuō)主要參與了突觸后膜（postsynaptic membrane）、突觸前（presynapse）、突觸前膜積分成分突觸前膜（presynapse）等部位。GO 分析結(jié)果在“分子功能（MF）”中富集了81 條路徑，圖10 列出了前20 條。從分子功能富集結(jié)果可以看出，逍遙丸治療抑郁和焦慮主要體現(xiàn)在神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（neurotransmitter receptor activity）、銨離子結(jié)合（ammonium ion binding）、無(wú)機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（inorganic cation transmembrane transporter activity）、陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（cation transmembrane transporter activity）等方面。

圖8 “生物過(guò)程（BP）”前20 條P 值顯著的通路富集圖Fig 8 Enrichment diagrams of the first 20 pathways with significant P value in "biological process（BP）"

圖9 “細(xì)胞成分（CC）”前20 條P 值顯著的通路富集圖Fig 9 Enrichment diagrams of the first 20 pathways with significant P value in "cellular component（CC）"

圖10 “分子功能（MF）”前20 條P 值顯著的通路富集圖Fig 10 Enrichment diagrams of the first 20 pathways with significant P value in "molecular function（MF）"

3 討論

抑郁和焦慮被認(rèn)為是常見(jiàn)的、不易治愈、發(fā)病率逐年增高的精神類疾病，致病因素較為復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。中醫(yī)研究認(rèn)為，抑郁和焦慮是由于情志不舒、氣機(jī)郁滯、肝疏泄失常所引起的，隸屬于情志病、心病的范疇?，F(xiàn)代研究對(duì)抑郁癥和焦慮癥發(fā)病機(jī)制主要是從神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)，神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂假說(shuō)以及免疫功能紊亂假說(shuō)等方面進(jìn)行解釋。

逍遙丸治療疾病達(dá)八十多種，涉及婦科、內(nèi)科、消化科、兒科以及皮膚科，在臨床上廣為應(yīng)用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)逍遙丸具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、保肝利膽、改善微循環(huán)、改善胃腸道功能性等作用。近幾年在神經(jīng)系統(tǒng)方面應(yīng)用居多，主要應(yīng)用于抑郁癥和焦慮癥。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)借助多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape 軟件等構(gòu)建了逍遙丸治療抑郁癥和焦慮癥的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)以及蛋白-蛋白互作，并對(duì)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)以及通路進(jìn)行了分析。通過(guò)以上的研究與分析，發(fā)現(xiàn)逍遙丸化合物成分主要集中在5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、APP、DRD2、SLC6A4、IL-6、CAT、HTR2A、IL-1β、HTR3A、SLC6A3、DRD1、IL-10、SLC6A2、GABRA2、GABRA1 等通路或靶點(diǎn)。

5-羥色胺能突觸與5-HT 密切相關(guān)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT 的含量及功能異常會(huì)導(dǎo)致抑郁、焦慮、精神分裂等精神類疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，焦慮模型小鼠大腦中縫背核的5-HT 能神經(jīng)元的活性明顯增加，將5-HT1A 受體激動(dòng)劑注射到海馬和杏仁核后發(fā)現(xiàn)會(huì)起到抗焦慮作用［7，8］。Hendricks 等［9］將與5-HT 能系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Pet-1 敲除后，小鼠中樞5-HT 能神經(jīng)元缺失、海馬等腦區(qū)5-HT 含量顯著減少，Pet-1-/-小鼠的焦慮水平顯著高于野生型小鼠。突觸后5-HT1AR 與5-HT 結(jié)合會(huì)激活5-HT 的分泌，加強(qiáng)細(xì)胞信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)從而改善抑郁癥狀［10］。在應(yīng)激反應(yīng)中，5-HT2A 受體表達(dá)升高會(huì)增進(jìn)動(dòng)物焦慮和抑郁樣行為，當(dāng)其下調(diào)后癥狀明顯減輕［11，12］。多巴胺能突觸參與腦內(nèi)多巴胺（DA）的合成，DA 在愉快感覺(jué)的產(chǎn)生、傳遞以及愉快信息的存儲(chǔ)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。相應(yīng)膜受體激活是DA發(fā)揮作用的關(guān)鍵，DA 受體具有5 種亞型可分成DRD1 和DRD2 兩類。吳帥等［13］研究證明多巴胺抗抑郁作用是通過(guò)DRD1 抑制谷氨酸及其NMDA 受體NR2B 亞基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。DRD2 激活后也可導(dǎo)致抑郁的發(fā)生，當(dāng)DRD2 被激活后，細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平降低，在產(chǎn)后抑郁初期，它的表達(dá)明顯升高不但抑制cAMP 的產(chǎn)生而且也影響DA 生成，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁癥加重［14］。神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路的受體含4 類可分為A 類（視紫紅質(zhì)樣）、B 類（分泌素樣）、C 類（親代謝性谷氨酸鹽/外激素）和離子通道/其他受體，當(dāng)出現(xiàn)焦慮時(shí)會(huì)導(dǎo)致A 類受體表達(dá)下調(diào)［15］。IL-6、IL-1B、IL-10 屬于炎癥細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、參與機(jī)體的信號(hào)傳遞作用。申永輝等［16］發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者經(jīng)SSRI 類藥物治療后，血清中炎癥細(xì)胞因子水平明顯下降，抑郁癥狀得到改善。GABRA2、GABRA1 是γ-氨基丁酸的受體，而γ-氨基丁酸是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)廣泛分布的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與受體結(jié)合參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)元活性［17，18］。研究發(fā)現(xiàn)，GABRA2、GABRA1 參與了抑郁發(fā)病機(jī)制［19］。APP 是去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體（NET）的一種，NET 被認(rèn)為是去甲腎上腺素再攝取抑制劑（NRI）抗抑郁作用的靶點(diǎn)。許多常用抗抑郁藥物作為NET 的高親和力底物可抑制NET 對(duì)突觸間隙NE 的重?cái)z?。?0］。小鼠的去甲腎上腺素基因（SLC6A2）敲除后使得去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體缺乏，可能導(dǎo)致抗應(yīng)激行為［21，22］，有研究表明，SLC6A3、SLC6A2、DRD2 等基因的交互作用可能在中國(guó)漢族人群發(fā)生抑郁中起重要作用［23］。

通過(guò)在TCMSP 中的篩選發(fā)現(xiàn)逍遙丸中含有柴胡皂苷、芍藥苷、beta-谷甾醇、茯苓酸、槲皮素、白術(shù)內(nèi)酯以及豆甾醇等化學(xué)成分。柴胡皂苷A 可調(diào)節(jié)炎癥因子及相關(guān)通路，提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量，改善5-HT、DA 水平，下調(diào)下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能發(fā)揮抗抑郁和焦慮的作用［24，25］。芍藥苷是一種雙向抗炎免疫調(diào)節(jié)藥，可降低慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證焦慮模型大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α，對(duì)改 善 焦 慮 和 抑 郁 有 一 定 作 用［26，27］。Beta-谷 甾 醇 是一種常見(jiàn)的植物甾醇，具有良好的抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理活性［28］。茯苓酸具有抗炎作用，通過(guò)減弱白細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，抑制腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)量分泌，阻止過(guò)多白細(xì)胞到達(dá)炎癥部位和過(guò)度炎癥反應(yīng)［29］。槲皮素屬于黃酮類化合物，具有神經(jīng)保護(hù)作用。白術(shù)內(nèi)酯通過(guò)抑制NLRP3 炎性體的激活來(lái)從而減少I(mǎi)L-1β的產(chǎn)生，在慢性不可預(yù)測(cè)溫和應(yīng)激（CUMS）誘導(dǎo)的小鼠抑郁模型中發(fā)揮抗抑郁樣作用［30］。豆甾醇能明顯減少氯胺酮引起的小鼠的自發(fā)活動(dòng)、刻板行為、強(qiáng)化降壓延遲等一些精神病癥狀，增加γ-氨基丁酸（GABA）、減少多巴胺、并且能顯著降低結(jié)腸組織炎性因子［31］。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)逍遙丸可能通過(guò)柴胡皂苷、芍藥苷、白術(shù)內(nèi)酯、茯苓酸等化學(xué)成分作用于5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等相關(guān)通路。推測(cè)逍遙丸通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)影響5-HT、DA、參與下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）以及干預(yù)炎癥反應(yīng)過(guò)程起到治療抑郁和焦慮作用。此外，對(duì)于上述討論中剩余通路與靶點(diǎn)的相關(guān)研究報(bào)道較少，可為今后深入研究抗抑郁與焦慮作用潛在靶點(diǎn)的分子機(jī)制研究提供線索。