補陽還五湯含藥血清對急性心肌梗死大鼠內(nèi)皮祖細胞增殖、遷移和黏附能力的影響

溫志浩，黃德慶，黃明劍，潘朝鋅，王慶高，梁逸強，龐 延，曹亞平，李倩宇

（1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西 南寧 530023；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，廣西 南寧530023；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥理基地，廣西 南寧 530023；4. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心，廣西 南寧 530200）

急性心肌梗死（acute myocardial infaction，AMI）是一種嚴重的冠心病。在冠脈介入治療得到廣泛推廣的今天，其死亡率已明顯下降。藥物洗脫支架通過抑制血管內(nèi)膜增殖顯著減少了支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生［1，2］。然而，由于藥物洗脫支架對細胞增殖抑制作用是非選擇性的，影響了支架植入后血管內(nèi)皮細胞的修復(fù)，導(dǎo)致血管內(nèi)膜愈合延遲，同時提高了晚期管腔丟失的風(fēng)險［3，4］。因此，AMI 患者的遠期預(yù)后仍不理想。

冠脈內(nèi)皮損傷被認為是心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的一個重要的始動環(huán)節(jié)［5］。隨著AMI 治療的后灌注時代的到來，采用何種方法促進AMI 后內(nèi)皮修復(fù)，已經(jīng)成為重要的臨床和科研議題之一。既往許多研究表明，提高內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）數(shù)量和功能可促進受損冠脈內(nèi)皮修復(fù)，促進血管的新生，改善心臟功能，但目前上述療法仍停留在動物實驗階段，還缺乏可靠的臨床研究，仍迫切需要探索新的治療藥物來改善EPCs 數(shù)量和功能。益氣活血方藥應(yīng)用為AMI 治療提供了新的研究方向。既往課題組納入80 例符合氣虛血瘀證的支架植入術(shù)后AMI 患者，隨機分為治療組與對照組。對照組采用西醫(yī)常規(guī)處理，治療組在對照組基礎(chǔ)上加用補陽還五湯。結(jié)果顯示，補陽還五湯聯(lián)合西藥較單純使用西藥，可更好地提高肱動脈內(nèi)皮依賴血管舒張功能和血漿一氧化氮水平，并降低血漿內(nèi)皮素-1 及神經(jīng)肽Y。補陽還五湯聯(lián)合西藥可保護支架植入術(shù)后AMI 患者血管內(nèi)皮功能［6］。但關(guān)于益氣活血方藥改善AMI 患者內(nèi)皮功能的機制尚缺乏系統(tǒng)的研究。

為進一步探討益氣活血方藥在改善EPCs 的數(shù)量和功能方面的作用，本研究采用補陽還五湯對AMI 大鼠進行干預(yù)，與阿托伐他汀鈣對比，分離并培養(yǎng)EPCs，采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法、黏附能力測定實驗以及改良的Boyden 小室的方法觀察內(nèi)皮祖細胞的增殖、黏附以及遷移能力，以期為益氣活血方藥保護AMI 患者血管內(nèi)皮功能提供更多依據(jù)，從細胞水平研究該方藥對EPCs 數(shù)量和功能的作用，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD 雄性大鼠（SPF 級）54 只，體重（230±20）g，6 周齡，提供方為南方醫(yī)科大學(xué)動物中心，批號0016556，研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準。

1.2 藥物、試劑及儀器

補陽還五湯配比：黃芪120 g、赤芍4.5 g、紅花3 g、地龍3 g、川芎3 g、當(dāng)歸6 g、桃仁3 g。上述生藥材去除雜質(zhì)切制后，按組方劑量配比制作浸膏，使用前配蒸餾水，生藥材終含量為2.0 g/mL。使用時采用補陽還五湯水煎液（12.83 g 生藥/kg）灌胃進行治療干預(yù)，每天1 次；對照藥物阿托伐他汀，參考相關(guān)文獻大鼠給藥劑量設(shè)為10 mg·kg-1·d-1，每日1 次灌 胃［7］；M199 培 養(yǎng) 基（Gibco，11150067），CCK8（Dojindo，CK04），Dil-ac-LDL（索 萊 寶，H7970），F(xiàn)ITC-UEA-I（Sigma，L9006）；生 物 倒 置 顯 微 鏡（OLYMPUS 公司，CKX41），細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher 公司，HERAcell?150i）。

1.3 急性心肌梗死大鼠模型制備方法

取正常SD 大鼠，以3%戊巴比妥腹腔麻醉。將SD 大鼠四肢固定，氣管插管，接呼吸機，于第3～4肋間心尖搏動區(qū)最強的點為中心，作橫行切口，鈍性分離肋間肌，將肺壓向左側(cè)胸腔，用彎鑷輕輕撕開心包膜，從左心耳下方縫扎冠脈，結(jié)扎時力度要適中，注意防止將心肌離斷。結(jié)扎后，以術(shù)后心電圖標準肢體Ⅱ?qū)?lián)提示ST 段弓背抬高表明模型成功。逐層縫合關(guān)閉胸腔，待生命體征平穩(wěn)可拔除氣管插管，腹腔內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組僅開胸，不結(jié)扎冠脈。

1.4 實驗分組和給藥

共分為6 組，每組9 只，于術(shù)后第2 天開始灌胃。（1）空白組：正常飲食，給予等量生理鹽水灌胃；（2）假手術(shù)組：假手術(shù)后給予等量生理鹽水灌胃；（3）模型組：造模后給予等量生理鹽水灌胃；（4）西藥對照組：造模后給予阿托伐他汀灌胃；（5）中藥干預(yù)組：造模后給予補陽還五湯灌胃；（6）中西醫(yī)結(jié)合組：造模術(shù)后給予補陽還五湯和阿托伐他汀鈣灌胃。

1.5 EPC 提取

分別于術(shù)后7 、14 d 和第4 周觀察相關(guān)指標，每次每組處死3 只大鼠進行EPCs 數(shù)量和功能的分析。

每組于各時間點隨機取3 只大鼠，進行腹腔麻醉后固定。胸部消毒后，剪開胸部皮膚，穿刺心腔內(nèi)抽血，肝素抗凝，搖勻后立即進行細胞分離。取大鼠淋巴細胞分離液Ls-1083 約4 mL 左右，按照血液：細胞分離液比5∶3，輕輕地加入血液于細胞分離液液面并離心（2 000 r/min，20 min）。離心完畢后，小心將中層細胞用吸入移至另一離心管。加入PBS 液輕輕吹打混勻后離心（1 500 rpm，10 min），吸去上層液體，上述同樣方法吹打、混勻、離心兩次。在加最后一次PBS 混勻后，在離心前吸少量用于細胞計數(shù)。細胞計數(shù)：在細胞計數(shù)板上滴入少量細胞混懸液，蓋上蓋玻片，顯微鏡下計數(shù)16 個小方格的細胞總數(shù)。將離心好的細胞上清吸去，根據(jù)細胞計數(shù)計算所需稀釋的濃度決定需加M199 培養(yǎng)基的量。將單個核細胞按4×106/mL，鋪在24 孔培養(yǎng)板（包被0.5%明膠）上，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d 后，以PBS洗掉非貼壁細胞，換M199 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7 d。

1.6 EPCs 的鑒定與計數(shù)

每組EPCs 與acLDL-DiI（2.4 μg/mL），37 ℃孵育1 h，檢測EPCs 對acLDL-DiI 的攝取情況。吸去acLDL-DiI，加2%多聚甲醛并固定細胞10 min。用PBS 液浸洗后將FITC-UEA-I（10 μg/mL）加于上述標本，37 ℃孵育l h。倒置熒光顯微鏡鑒定雙染色陽性細胞為EPCs，用Image Pro Plus 圖像分析軟件進行細胞計數(shù)。計數(shù)5 個隨機選擇×200 視野的EPCs，取平均值。

1.7 對EPCs 增殖能力的影響

將各組EPCs 以等量空白EGM-2 配成單細胞懸液，接種于96孔板（每孔100 μL），各濃度分別設(shè)3個復(fù)孔，在CO2培養(yǎng)箱孵育48 h，每孔加入CCK-8 試劑10 μL，孵育2 h 后檢測OD 值。

1.8 對EPCs 遷移能力的影響

消化收集細胞后計數(shù)。25 μL 培養(yǎng)液稀釋血管內(nèi)皮生長因子，終濃度為50 ng/mL，加入改良的Boyden chamber 的下室，蓋上濾膜，再蓋上趨化小室的上室。將含2×104EPCs 的50 μL 培養(yǎng)液注入上室，蓋載玻片。在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。刮去濾膜上面的未移動細胞，用甲醇固定3～5 min，以結(jié)晶紫染色5 min，蒸餾水沖洗。后置于顯微鏡下，觀察遷移到低層的細胞，隨機選擇3 個視野（×200）計數(shù)。

1.9 對EPCs 黏附能力的影響

在EPCs 中加入含0.25%胰蛋白酶，消化2～3 min，反復(fù)吹打瓶壁細胞后，收集于離心管中，離心3～5 min（800～1 000 r/min），棄上清，加培養(yǎng)液并計數(shù)。取同等數(shù)目的EPCs，鋪于包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)板上，孵育30 min 并計數(shù)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件處理，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或秩和檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPCs 的培養(yǎng)、鑒定及計數(shù)結(jié)果

原代培養(yǎng)第3 天，可見細胞集落形成，單個核細胞呈半懸浮生長，邊緣細胞呈紡錘型生長；第4 天可見大量梭形細胞由集落中央向外周生長；第5 天見梭形細胞由集落中央向外周生長，呈放射狀；顯微鏡觀察呈DIL-ac-LDL 和FITC-UEA -I 雙熒光染色陽性認為是正在分化的EPCs?？梢娫诘? 天、第14天及第4 周外周血EPCs 計數(shù)中，模型組較假手術(shù)組明顯下降，中藥干預(yù)組、西藥對照組及中西醫(yī)結(jié)合組較模型組均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），中西醫(yī)結(jié)合組較中藥干預(yù)組及西藥對照組對EPCs 計數(shù)的提升作用更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1 和圖1。

表1 各組EPCs 計數(shù)的比較（n=3，±s）Tab 1 EPCs count of each group（n=3，±s）

表1 各組EPCs 計數(shù)的比較（n=3，±s）Tab 1 EPCs count of each group（n=3，±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05；與中藥干預(yù)組相比，□P＜0.05；與西藥對照組相比，▲P＜0.05。

4 w 97.500±0.451△□▲97.400±0.917 87.200±0.700*91.800±0.954*△95.600±0.603*△▲99.100±0.651*△□▲組別空白組假手術(shù)組模型組西藥對照組中藥干預(yù)組中西藥結(jié)合組7 d 91.000±0.833△□▲91.800±0.351 77.500±1.401*83.100±0.666*△87.600±0.751*△▲92.500±0.608△□▲14 d 96.500±0.586△94.400±1.358 85.000±3.350*90.300±2.178△93.600±2.914△95.400±1.650△▲

圖1 光鏡下各組原代EPCs（200×）Fig 1 Light microscopy of primary EPCs of each group（200×）

2.2 對EPCs 增殖能力的影響

模型組在3 個時間點的增殖能力均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），模型組及各用藥組隨著時間的推移，其增殖能力呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，而西藥對照組、中藥干預(yù)組、中西醫(yī)結(jié)合組在3個時間點較模型組均可顯著改善EPCs 的增殖能力（P＜0.05）。在7 d 和14 d 時間點，中藥干預(yù)組與西藥對照組改善作用類似，而中西醫(yī)結(jié)合組改善作用更好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組EPCs 增殖能力（n=5，±s）Tab 2 Proliferation capacity of EPCs of each group（n=5，±s）

表2 各組EPCs 增殖能力（n=5，±s）Tab 2 Proliferation capacity of EPCs of each group（n=5，±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05；與中藥干預(yù)組相比，□P＜0.05；與西藥對照組相比，▲P＜0.05。

4 w 0.837±0.033 0.824±0.044 0.619±0.053*1.052±0.052 △1.018±0.055 △1.069±0.027 △組別空白組假手術(shù)組模型組西藥對照組中藥干預(yù)組中西藥結(jié)合組7 d 0.609±0.043 0.624±0.049 0.423±0.050*0.829±0.023 △0.846±0.025 △1.053±0.046 △□▲14 d 0.430±0.031 0.422±0.039 0.238±0.034*0.622±0.051 △0.620±0.044△0.813±0.045△□▲

2.3 對EPCs 遷移能力的影響

模型組在第7～14 天內(nèi)的遷移能力呈顯著下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組及各用藥組隨著時間的推移，其遷移能力逐漸上升。而與模型組比較，西藥對照組、中藥干預(yù)組、中西醫(yī)結(jié)合組在3 個時間點均可顯著改善EPCs 的遷移能力。在7 d 及14 d 時間點，中藥干預(yù)組與西藥對照組改善作用類似，而中西醫(yī)結(jié)合組的遷移功能改善作用更好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組EPCs 遷移能力的比較（×104，n=3，±s）Tab 3 Migration capability of EPCs of each group（×104，n=3，±s）

表3 各組EPCs 遷移能力的比較（×104，n=3，±s）Tab 3 Migration capability of EPCs of each group（×104，n=3，±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05；與中藥干預(yù)組相比，□P＜0.05；與西藥對照組相比，▲P＜0.05。

4 w 1.117±0.066 1.182±0.048 0.610±0.027*1.436±0.111△1.451±0.049△1.844±0.055△□▲組別空白組假手術(shù)組模型組西藥對照組中藥干預(yù)組中西藥結(jié)合組7 d 0.668±0.055 0.686±0.031 0.310±0.011*1.033±0.099△1.028±0.066△1.838±0.102△□▲14 d 0.203±0.016 0.203±0.008 0.091±0.013*0.618±0.009△0.694±0.009△1.166±0.082△□▲

2.4 對EPCs 黏附能力的影響

模型組在第7～14 天內(nèi)的黏附能力呈顯著下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而西藥對照組、中藥干預(yù)組、中西醫(yī)結(jié)合組在3 個時間點較模型組均可顯著改善EPCs 的黏附能力。在第7 天、第14 天及第4 周時間點，中藥干預(yù)組與西藥對照組改善作用類似，而中西醫(yī)結(jié)合組較另兩個用藥組可更好的提高EPCs 黏附能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組EPCs 黏附能力的比較（×105，n=3，±s）Tab 4 Adhesion capacity of EPCs of each group（×105，n=3，±s）

表4 各組EPCs 黏附能力的比較（×105，n=3，±s）Tab 4 Adhesion capacity of EPCs of each group（×105，n=3，±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05；與中藥干預(yù)組相比，□P＜0.05；與西藥對照組相比，▲P＜0.05。

4w 0.795±0.011 0.786±0.020 0.650±0.010*0.790±0.007△0.790±0.007△0.902±0.017△□▲組別空白組假手術(shù)組模型組西藥對照組中藥干預(yù)組中西藥結(jié)合組7 d 0.724±0.014 0.731±0.006 0.548±0.029*0.702±0.007△0.693±0.014△0.753±0.027△□▲14 d 0.563±0.011 0.570±0.003 0.369±0.014*0.494±0.009△0.476±0.008△0.561±0.018△□▲

3 討論

近年來，隨著糖尿病、血脂代謝異常等危險因素的流行，AMI 在我國的發(fā)病率呈逐漸升高的態(tài)勢。中國心血管病研究報告2018 指出，2013 年中國大陸年齡≥15 歲人口冠心病的患病人數(shù)已達約1 139.6 萬人，較2008 年增加超過100 萬人。自2005年，AMI 死亡率呈現(xiàn)快速上升趨勢，近期農(nóng)村和城市AMI 死亡率分別為74.72/10 萬和58.69/10 萬［8］。而根據(jù)霍勇教授在2019 年代表國家心血管疾病醫(yī)療質(zhì)量控制中心發(fā)布的2018 年中國大陸地區(qū)冠心病介入治療數(shù)據(jù)，2018 年全年中國冠心病介入例數(shù)為915 256 例，已接近百萬例，但仍未降低AMI 患者死亡率。

在快速恢復(fù)AMI 患者血供基礎(chǔ)上，如能有效防范支架內(nèi)管腔丟失，患者的心功能將得到更好的保護，其遠期預(yù)后亦可得到更好的改善。研究表明EPCs 可以向缺血心肌趨化黏附，幫助修復(fù)損傷的冠脈內(nèi)皮，加速受損冠脈內(nèi)皮化修復(fù)，幫助保持心臟功能，降低AMI 患者死亡率［9，10］。EPCs 在血管內(nèi)皮損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著非常重要的作用。動員入血的EPCs 在一些黏附趨化因子作用下可向損傷局部迅速遷移，通過整合［11］、融合［12］以及旁分泌［13］的方式促進新生冠脈血管生成，并幫助內(nèi)皮修復(fù)。

據(jù)報道，冠心病患者EPCs 數(shù)量較正常人降低40%，其數(shù)量與危險分層級別呈負相關(guān)，EPCs 數(shù)量的降低和活性的抑制與冠脈粥樣硬化的發(fā)展明顯相關(guān)［14，15］。本研究結(jié)果也顯示，在第7、14 天及第4周急性心肌梗死模型大鼠外周血EPCs 計數(shù)、增殖、遷移及黏附能力均較假手術(shù)組均顯著下降，而中藥干預(yù)組、西藥對照組及中西醫(yī)結(jié)合組外周血EPCs計數(shù)、增殖、遷移及黏附能力較模型組均顯著增加（P＜0.05），而中西醫(yī)結(jié)合組較中藥干預(yù)組及西藥對照組對EPCs 功能的改善作用更為顯著（P＜0.05）。

冠狀動脈粥樣硬化可以造成內(nèi)皮的損傷。內(nèi)皮化修復(fù)類似于一種創(chuàng)傷后的愈合過程，中醫(yī)藥對于創(chuàng)傷的修復(fù)有著非常豐富的理論和實踐經(jīng)驗。中醫(yī)認為創(chuàng)傷修復(fù)不利的重要病機之一是氣行無力，血行不暢。氣虛血瘀則創(chuàng)面愈合不良，應(yīng)用內(nèi)托結(jié)合活血之法促進創(chuàng)面修復(fù)愈合，而且益氣活血法則被公認是AMI 治療中核心治療方法之一［16，17］。很多實驗和臨床研究證明，益氣活血法對改善內(nèi)皮功能障礙具有一定優(yōu)勢。李亥辰等［18］研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸可幫助改善心絞痛患者冠脈內(nèi)皮功能，降低心絞痛發(fā)作頻率，縮短其發(fā)作時間。謝生梅等［19］研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合西藥治療可改善冠心病患者內(nèi)皮功能、血脂和血液黏度。本研究結(jié)果顯示，他汀類藥物聯(lián)合補陽還五湯較單純的中藥或西藥治療可更好地改善AMI 大鼠的內(nèi)皮功能，可能可以更好改善AMI 患者內(nèi)皮功能，從而降低AMI 患者死亡率。本研究僅檢測了EPCs 功能的變化，但引起EPCs 功能改變的具體機制尚未進行深入探討，后續(xù)可增加相關(guān)的機制研究以提高實驗的可信度。

作者貢獻度說明：

溫志浩：實驗設(shè)計和論文撰寫；黃德慶：實驗實施動物飼養(yǎng)與取材；黃明劍：實驗實施EPCs 原代細胞提取與培養(yǎng)；潘朝鋅：實驗實施EPCs 原代細胞鑒定與計數(shù)；王慶高：實驗實施EPCs 增殖與遷移功能；梁逸強：實驗實施EPCs 黏附功能；龐延：數(shù)據(jù)分析；曹亞平：數(shù)據(jù)與圖像分析；李倩宇：數(shù)據(jù)與圖像分析。