高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法同時測定PM2.5中5種形態(tài)砷濃度

徐映如，張慧敏，朱圓圓

1.上海市虹口區(qū)疾病預防控制中心理化科，上海 200082

2.上海市疾病預防控制中心化學品毒性檢定所，上海 200336

砷污染往往是空氣、水和食物系統(tǒng)的多重污染，吸入式暴露是砷暴露的主要途徑之一［1-3］，但國內外對空氣砷的研究較少，監(jiān)控標準模糊，無明確的經呼吸道砷暴露參考濃度［3-4］?？諝馍榇蟛糠指患谛×筋w粒物PM2.5中［5］，可在大氣中長時間停留，且無法被呼吸器官屏障阻礙，容易進入肺部通過肺泡吸收，從某種角度來看，與水和食物相比，空氣中的砷可能更具危害性。據(jù)臨床報告，吸入式砷暴露可導致多種呼吸道疾病及皮疹、神經炎、肝炎和心肌炎等多方面損害［6-8］。國內外不少地區(qū)已在檢測中發(fā)現(xiàn)空氣中砷濃度超標［9-10］，以上海為例，2016—2017年空氣總砷暴露量（6.92×10-7mg·kg-1·d-1）在全國各大城市中是明顯偏高的［11］；2017—2018年空氣PM10中總砷質量濃度（簡稱濃度）達67.09 ng·m-3，為GB 3095—2012《環(huán)境空氣質量標準》限值（6 ng·m-3）的10倍有余［12］。

除濃度外，砷的毒性及生物可及性主要與其形態(tài)有關［13-14］。環(huán)境砷主要有無機形態(tài)的亞砷酸鹽［As（Ⅲ）］和砷酸鹽［As(Ⅴ)］，及有機形態(tài)的一甲基胂酸（monomethylarsonate，MMA）、二甲基胂酸（dimethylarsinate，DMA）、砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）和砷膽堿（arsenocholine，AsC）等。一般認為毒性順序依次為As（Ⅲ）＞As(Ⅴ)＞MMA＞DMA＞AsC＞AsB，無機砷毒性遠大于有機砷，AsB和AsC對人體無毒［10］。但一些有機砷的遺傳毒性遠強于無機砷［15］。從癥狀來看，As（Ⅲ）的慢性吸入可能損害細胞免疫并損害多器官［16］，As(Ⅴ)可能影響胚胎發(fā)生和胎兒發(fā)育［17］，MMA 則可能引起高血壓［18］。因此，要準確反映空氣砷暴露的遠期健康效應，有必要建立不同形態(tài)砷含量的檢測方法。

現(xiàn)有的空氣形態(tài)砷檢測方法，如高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）與氫化物原子熒光光譜聯(lián)用［19-21］、反相色譜柱與電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）聯(lián)用［22］，存在靈敏度不高、分離度不佳、難以檢出有機砷、三價形態(tài)砷易被氧化、檢測結果不準確且操作復雜的問題。本研究通過超聲提取法，采用HPLC-ICP-MS 聯(lián)用［23-24］，并選用離子色譜柱，建立PM2.5中As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA、DMA 和AsB 5種形態(tài)砷濃度的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

8900 電感耦合等離子體串聯(lián)質譜儀、1200 高效液相色譜儀（美國Agilent），Milli-Q 超純水機（美國Millipore），SK2210LHC 超聲波清洗器（中國上?？茖С晝x器有限公司），MS200多管渦旋混勻儀（中國杭州瑞誠儀器有限公司），TH-1000CⅡ大流量采樣器（中國武漢天虹），石英濾膜（20.3 cm×25.4 cm，美國PALL），S400pH計、XS204電子天平（瑞士Mettler Toledo）。

碳酸銨（色譜純，美國Sigma），硝酸（HPLC級，美國Fisher），氨水（優(yōu)級純，中國國藥集團化學試劑有限公司），亞砷酸鹽溶液標準物質［（1.011±0.016）μmol·g-1］、砷酸鹽溶液標準物質［（0.233±0.005）μmol·g-1］、一甲基胂酸溶液標準物質［（0.335±0.011）μmol·g-1］、二甲基胂酸溶液標準物質［（0.706±0.024）μmol·g-1］和砷甜菜堿溶液標準物質［（0.518±0.015）μmol·g-1］均購自中國計量科學研究院。砷標準使用溶液用超純水逐級稀釋配制成1.00 mg·L-1工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 采樣區(qū)域和樣品采集

1.2.1 采樣點采樣點位于上海市虹口區(qū)北外灘社區(qū)一建筑物三樓屋頂（121.517236°E，31.261601°N），采樣儀器距地面高度約為11 m。附近包括一條主干道（東面約400 m）、住宅區(qū)（南面和北面）、辦公樓（西面）。

1.2.2 樣品采集采樣時間從2019年1月持續(xù)到2019年12月，覆蓋全年四季。樣品共84 份，包括春（3—5月）、夏（6—8月）、秋（9—11月）、冬季（1—2月和12月）各21份。每個月10—16日進行連續(xù)24 h的PM2.5采樣，采用大流量采樣器，采樣流量為800 L·min-1。采樣前將石英濾膜在600℃下烘烤4 h 以消除有機物干擾，并在干燥器中平衡24 h。采樣后將濾膜置于溫度（25±1）℃、相對濕度（50±5）%的恒溫恒濕箱中平衡24 h 后稱重，-18℃環(huán)境下儲存，30 d內完成檢測［25-26］。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制取AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA、As（Ⅴ） 1.00 mg·L-1工作溶液，用0.15 mol·L-1硝酸逐級稀釋，配制成濃度分別為0.0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0、100.0 μg·L-1的標準系列。

1.3.2 樣品前處理（1）總砷測定前處理。按重量稱取1/8樣品濾膜，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL的0.15 mol·L-1硝酸，70℃水浴超聲浸提3 h 后，取出放至室溫，充分振蕩后，將離心管置于低速離心機上4 500 r·min-1，離心半徑10 cm，離心5 min，并用0.45 μm濾頭過濾。準確移取2 mL 濾液，超純水定容至5 mL 待測。同時做空白對照實驗。

（2）5 種形態(tài)砷測定的前處理。按重量稱取1/8 樣品濾膜，置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入20 mL 提取液，1 500 r·min-1（渦旋半徑4 mm）渦旋1 min，使提取液與濾膜充分混合，室溫超聲水浴后取出。分別比較3 種提取液（純水、0.15 mol·L-1硝酸、0.30 mol·L-1硝酸）和4 種超聲時間（15、30、60、120 min）對不同形態(tài)砷提取效率的影響，對比添加50 mg抗壞血酸對As（Ⅲ）穩(wěn)定性的影響，優(yōu)化提取條件。充分振蕩后，將提取液過0.22 μm水相濾膜，濾液置于2 mL進樣瓶中測定。同時做空白對照實驗。

1.3.3 儀器條件HPLC工作參數(shù)：（1）考察2種色譜柱［Agilent Zorbax SB-Aq 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）配合Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18 4-Pack 預柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm），Dionex IonPac AS19陰離子交換柱（4 mm×250 mm，5 μm）配合Dionex IonPac AG19預柱（4 mm×50 mm，5 μm）］的分離度和靈敏度。（2）基于碳酸銨體系進行流動相優(yōu)化［27］，配置4種濃度（20、30、40、50 mmol·L-1碳酸銨，pH=9.7）、4種pH值（pH=9.3、9.5、9.7、9.9）的碳酸銨水溶液（30 mmol·L-1）對流動相進行考察。等度洗脫，流動相流速為1.0 mL·min-1；進樣體積10 μL。

ICP-MS 工作參數(shù)：分析模式為全定量分析，射頻功率1 550 W，載氣為高純氬氣，等離子體氣體流速15.00 L·min-1，輔助氣體流速1.00 L·min-1，載氣流速、補償氣體流速1.00 L·min-1，霧化室溫度2℃。采集模式，采集時間10.5 min，積分時間單位為s，掃描類型為單桿/串接，采用ICP-MS中的He模式測定。

1.3.4 檢出限和定量限以標準狀況下采樣體積為1 056 m3，定容體積為20 mL，信噪比為3 時對應的濃度作為方法檢出限，以信噪比為10 對應的濃度為方法定量限。

1.3.5 準確度和精密度以加標回收率來考察準確度，以相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來表示精密度。一張濾膜按重量等分成8 份，其中6 份進行加標回收實驗，剩余2 份作為空白對照。PM2.5中總砷濃度的范圍為0.400～8.311 ng·m-3，因此在砷形態(tài)分析實驗中分別添加低、中、高三種不同濃度水平（0.38、1.52、7.58 ng·m-3）的AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA、As（Ⅴ）混合標準溶液并進行前處理，測定樣品加標前后5種形態(tài)砷的濃度，計算加標回收率（n=6）。

1.4 質量控制

采樣器每次使用前要進行流量校準。每批樣品采樣，應設空白對照。測定PM2.5中不同形態(tài)砷時，同時進行空白和空白濾膜加標的測定。每批樣品的標準曲線相關系數(shù)r＞0.999 0。

2 結果

2.1 提取條件的確定

應用不同提取液（純水、0.15 mol·L-1硝酸、0.30 mol·L-1硝酸）配制5 種形態(tài)砷的標準溶液，隨著超聲時間的變長（15、30、60、120 min），除了As（Ⅲ）濃度有明顯變化，其他4 種形態(tài)砷［AsB、DMA、MMA、As（Ⅴ）］濃度基本在（10.00±0.20）μg·L-1之間。純水中As（Ⅲ）氧化率最高、提取效率最低，10 μg·L-1As（Ⅲ）經超聲120 min后，大約35% As（Ⅲ）被氧化成As（Ⅴ）。

采用純水、0.15 mol·L-1硝酸、0.15 mol·L-1硝酸+50 mg抗壞血酸作為提取液分別超聲30 min，As（Ⅲ）氧化比例分別為7.6%、2.4%、0.3%，可見酸性環(huán)境更有利于提取穩(wěn)定。在3 種提取液（純水、0.15 mol·L-1硝酸、0.30 mol·L-1硝酸）的As（Ⅲ）標準溶液中各加入50 mg抗壞血酸，經過超聲15、30、60、120 min 后，As（Ⅲ）濃度幾乎沒有變化，且改善了As（Ⅴ）的峰形，提高了檢測的靈敏度。在空白濾膜上加標，As（Ⅲ）同樣沒有出現(xiàn)氧化現(xiàn)象，且提取液為0.15 mol·L-1硝酸的回收率最高（96.6%～101.3%），表明添加抗壞血酸能有效抑制As（Ⅲ）氧化成As（Ⅴ）。選用0.15 mol·L-1硝酸，超聲提取30 min 時，提取效率最高，對比結果見圖1。

圖 1 不同提取液濃度和時間條件下的提取效率Figure 1 Extraction efficiency under different extract concentration and time conditions

2.2 色譜條件的確定

2.2.1 色譜柱選擇對比發(fā)現(xiàn)Agilent Zorbax SB-Aq體系分離速度快，但分離度和峰形不佳；Dionex IonPac AS19體系優(yōu)化后可實現(xiàn)5種形態(tài)砷的有效分離，見圖2。

圖2 兩種色譜柱對5種形態(tài)砷的分離效果Figure 2 Separation effects of two chromatographic columns on five arsenic species

2.2.2 流動相濃度和pH 選擇4 種不同濃度流動相（20、30、40、50 mmol·L-1碳酸銨水溶液，pH=9.7）色譜圖如圖3所示，隨著流動相碳酸銨的濃度增加，5種形態(tài)砷中MMA和As（Ⅴ）的保留時間縮短，而AsB、DMA和As（Ⅲ）的保留時間基本不變。當流動相為20 mmol·L-1碳酸銨時，分析時間過長且峰形不佳；當流動相濃度超過30 mmol·L-1碳酸銨時，AsB、DMA、As（Ⅲ）無法實現(xiàn)基線分離。故選擇30 mmol·L-1碳酸銨為最佳濃度。

圖3 不同濃度碳酸銨分離5種形態(tài)砷的HPLC-ICP-MS色譜圖Figure 3 Separation effects of different concentrations of ammonium carbonate on five arsenic species by HPLC-ICP-MS

4種不同pH條件下（pH=9.3、9.5、9.7、9.9）碳酸銨色譜圖如圖4所示?？梢?，隨著流動相pH增加，MMA和As（Ⅴ） 保留時間縮短，而AsB、DMA、As（Ⅲ）的保留時間基本不變。當pH值為9.3時，DMA和As（Ⅲ）無法實現(xiàn)基線分離，且出峰時間比較長。選取pH=9.5 為最優(yōu)條件（圖4），出峰時間為10 min，分離效果和峰形最好。

圖4 不同pH碳酸銨分離5種形態(tài)砷的HPLC-ICP-MS色譜圖Figure 4 Separation effects of different pH values of ammonium carbonate on five arsenic species by HPLC-ICP-MS

2.3 方法線性范圍、標準工作曲線、檢出限和定量限

在0.50～100 μg·L-1的線性范圍內，所得回歸方程均呈較好的線性關系，r＞0.999。5種形態(tài)砷的方法檢出限為0.008～0.017 ng·m-3，定量限為0.027～0.058 ng·m-3，結果見表1。

表1 五種形態(tài)砷的方法線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Linear ranges,limits of detection,and limits of quantitation for five arsenic species

2.4 方法的準確度和精密度

加標回收率和相對標準偏差的結果見表2。五種形態(tài)砷的加標回收率在91.4%～107.9%之間，RSD 在1.68%～6.28%之間，說明該方法有良好的準確度和精密度，滿足分析測試的要求。

表2 方法的準確度和精密度Table 2 Accuracy and precision of the method

2.5 實際空氣PM2.5樣品測定

測定84 份PM2.5樣品中總砷和各形態(tài)砷的含量，其中某實際樣品的檢測結果如圖5。提取率（不同形態(tài)砷含量/總砷含量）范圍81.8%～112.8%，各形態(tài)砷濃度及總砷濃度按季節(jié)分別統(tǒng)計結果如表3所示，測定PM2.5樣品中，5 種形態(tài)砷按含量從高到低，依次為As（Ⅴ）、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA，以As（Ⅴ）無機砷為主，約占總砷的81.1%～95.7%之間。As（Ⅴ）濃度秋、冬季略高，春、夏季相近；As（Ⅲ）濃度冬季略高，夏季明顯低于其他季節(jié)，可能是夏季高溫導致大氣中As（Ⅲ）的氧化比較完全；AsB則呈現(xiàn)不同規(guī)律，夏季最高，秋季次之，春、冬較低；DMA 夏、秋高于春、冬；MMA全年都很低。此外，總砷年中位數(shù)（1.790 ng·m-3）未超標（6 ng·m-3），但秋、冬季個別月份有超標（10月份最大值為8.331 ng·m-3）。

圖5 某份PM2.5樣品砷含量色譜圖Figure 5 Chromatogram of arsenic concentration of a PM2.5 sample

表3 PM2.5樣品中5種形態(tài)砷濃度及總砷濃度分別檢測結果Table 3 Concentrations of five arsenic species and total arsenic in PM2.5 samples 單位（Unit）：ng·m-3

3 討論

本研究采用HPLC-ICP-MS 方法，通過對提取液、超聲時間、色譜柱和流動相條件的優(yōu)化，建立新的同時測定空氣PM2.5中AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA、As（Ⅴ）5種形態(tài)砷含量的檢測分析方法。5種形態(tài)砷的方法檢出限為0.008～0.017 ng·m-3，定量限為0.027～0.058 ng·m-3，實際樣品加標回收率為91.4%～107.9%，RSD 為1.68%～6.28%。與現(xiàn)有方法相比，本方法大大降低檢出限，靈敏度高、形態(tài)穩(wěn)定、耗樣量少，且前處理簡單、分析速度快、重復性好，兼具適用性與實用性，可為后續(xù)開展空氣砷暴露的遠期健康效應評估提供技術支持。

不同形態(tài)砷超聲提取液主要有硝酸、純水、甲醇-水等［28-29］，環(huán)境空氣中重金屬提取劑通常為硝酸。但硝酸有一定氧化性，部分形態(tài)砷穩(wěn)定性較差，如As（Ⅲ）容易被氧化為As（Ⅴ），為保證提取前后砷形態(tài)不發(fā)生變化，本研究調節(jié)硝酸濃度并對比3 種提取液（純水、0.15 mol·L-1硝酸、0.30 mol·L-1硝酸）的提取效率。此外還需采取一些措施來進一步減緩提取過程中As（Ⅲ）的氧化速度，如溶液除氧、低溫提取、添加抗氧化劑、溶液充氮保護等，最終采取操作比較便捷的添加抗氧化劑（抗壞血酸）方法，并基于土壤、底泥的水樣中使用的方法［30］進行優(yōu)化，減少抗氧化劑用量至50 mg。

本研究考察了純水和酸性提取液的提取效果。純水提取時As（Ⅲ）很大一部分轉化為As（Ⅴ），而硝酸+抗壞血酸提取時砷形態(tài)穩(wěn)定，As（Ⅲ）幾乎無轉化。純水中As（Ⅲ）的氧化原因不明確，可能是提取液中的氧化性物質，如Fe（Ⅲ）或溶解氧［30-31］，在超聲環(huán)境下強化了氧化性；硝酸提取液中As（Ⅲ）氧化程度低于純水提取液，可能與As 的溶解性及離子形態(tài)有關，在pH=5～7 時，一方面As 溶解性對pH 相對敏感并隨pH升高呈現(xiàn)先降后升的特性，另一方面H3AsO3更多轉化為H2A-與HA2-離子形式，由于懸浮物帶負電荷，對陰離子排斥，且在一定的有機質濃度下和酸性條件時金屬陽離子橋絡合機制更易發(fā)生［32］，因此酸性條件下As（Ⅲ）更易被懸浮物質吸附從而阻礙氧化［33-34］。最終選用0.15 mol·L-1硝酸加50 mg 抗壞血酸作為提取液，達到了理想的提取效率和穩(wěn)定性。

色譜柱和流動相的選擇是分離多種目標物的關鍵，反相色譜柱受填充材料限制，在選定pH 條件下（pH=4.3）As（Ⅲ）以H3AsO3形式存在，不與離子對試劑發(fā)生相互作用，色譜柱上不保留；而選用陰離子交換柱（樹脂毛細管柱）堿性洗脫，各形態(tài)砷均呈現(xiàn)離子形態(tài)，可與離子基團交換保留。考慮各形態(tài)砷的解離常數(shù)［As（Ⅲ）（9.22），As（Ⅴ）（2.3、6.8、11.6），MMA（2.6、8.2），DMA（6.2），AsB（2.2）］，酸性條件下As（Ⅲ）無法電離，堿性條件下As（Ⅲ）以H2A-形式、As（Ⅴ）以HA2-或A3-形式、MMA 以HA-或A2-形式、DMA 以A-形式存在，兩性離子AsB 以陰離子形式存在，各形態(tài)可完全電離；隨pH 升高，更強的洗脫強度有利于縮短保留時間，但pH ≥10 的堿性條件不利于DMA 和As（Ⅲ）形態(tài)的分離。因此選擇在pH=9.3～9.7 區(qū)間進行酸堿度微調，最終選用pH=9.5的碳酸銨水溶液（30 mmol·L-1）為流動相。

上海市虹口區(qū)空氣PM2.5中砷元素檢測分析結果表明，PM2.5中總砷濃度為0.400～8.331 ng·m-3（見表3）；PM2.5中砷主要以As（Ⅴ）無機砷形式存在，約占總砷的81.1%～95.7%，含有少量的AsB、As（Ⅲ）、DMA和MMA，5種形態(tài)砷的總和占總砷含量的81.8%～112.8%。檢測中首次發(fā)現(xiàn)了AsB是上海市空氣PM2.5中砷的次要形態(tài)，濃度高于As（Ⅲ）并遠遠超過MMA和DMA，該結果推翻了目前的普遍認知，即砷在陸地環(huán)境（包括淡水和空氣）中主要以As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、MMA和DMA形態(tài)存在，AsB 形態(tài)含量極低［29］。國內外尚無空氣顆粒物中AsB的相關發(fā)現(xiàn)或研究，它是其他形態(tài)的砷在空氣中轉化合成的，還是從外源遷移而來的，目前未知。AsB濃度有季節(jié)性變化，夏季最高，春、冬較低，主導原因不明確。根據(jù)虹口區(qū)采樣點的地理位置，大氣顆粒物中AsB可能部分來源于沿海海水飛沫或新型排放途徑，如城市垃圾焚燒后擴散到大氣中的飛塵。AsB形態(tài)是砷的地球生物化學循環(huán)以及砷的自然解毒過程中的重要環(huán)節(jié)，因此建議相關部門對其進行源解析。

毒性最強的As（Ⅲ）在冬、秋、春季的濃度高于夏季，可能是氣溫更低導致氧化不完全；毒性次之的As（Ⅴ）在秋、冬季偏高。總砷的年中位數(shù)（1.790 ng·m-3）未超標，但秋、冬季個別月份總砷仍有超標。秋、冬季是呼吸道疾病的好發(fā)季節(jié)，為減輕呼吸道患病風險，以及避免慢性吸入性砷暴露的遠期健康風險，建議相關部門保持對環(huán)境空氣的監(jiān)控治理。