基于化學(xué)模式分析的前胡栽培群體質(zhì)量特征研究

徐 廣，譚秋生，郭 瑀，羅 敏，鄧才富，任星宇

重慶市藥物種植研究所 中藥材生產(chǎn)質(zhì)量控制研究中心，南川 408435

中藥前胡為傘形科植物白花前胡PeucedanumprasrupterumDunn.的干燥根，具有降氣化痰、疏散風(fēng)熱等功效。臨床多用于外感風(fēng)熱、痰熱喘咳、風(fēng)熱咳嗽等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明，前胡主要的藥理作用為鈣通道阻滯、降血壓、抗心律、平喘、抗癌等[2-4]，其主要藥用活性成分為白花前胡甲素、白花前胡乙素等香豆素化合物[5,6]。傳統(tǒng)前胡藥材主要源于野生資源，隨著生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，市場對(duì)前胡藥材的需求急劇增加，野生藥材已不能滿足現(xiàn)有市場需求，近年來，在安徽、重慶等地已有大范圍人工種植[7]。栽培品增加的同時(shí)，藥材品質(zhì)出現(xiàn)良莠不齊、差異極大，多數(shù)藥材指標(biāo)成分含量不達(dá)標(biāo)[8-12]，影響治療效果。

項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)在前胡質(zhì)量提升栽培技術(shù)研究過程中，調(diào)查發(fā)現(xiàn)各地栽培品質(zhì)量差異極大，特開展了群體質(zhì)量特征的研究，通過采挖同一栽培小區(qū)的樣品，建立HPLC指紋圖譜，采用測定雙指標(biāo)成分含量與聚類分析、PCA等分析方法相結(jié)合全面地評(píng)價(jià)前胡的質(zhì)量差異性，分析其栽培群體質(zhì)量特征，對(duì)于前胡的質(zhì)量構(gòu)成特征和資源利用有重要意義，同時(shí)為前胡藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)和良種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀：包括LC solution色譜管理處理軟件、CTO-20A柱溫箱、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A二極管陣列檢測器、日本島津Shim-pack VP-ODS色譜柱(4.6 mm×0.5 μm×250 mm)、CBM-20Alite系統(tǒng)控制器；METTLER AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；CPA225D型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；Molecular標(biāo)準(zhǔn)智能型純水機(jī)(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)，KQ-1000DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DHG電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海龍躍儀器有限公司)。

1.2 材料

前胡樣品均采自重慶市藥物種植研究所位于重慶市南川區(qū)三泉鎮(zhèn)槐坪種植基地，由項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)自己種植管理，經(jīng)重慶市藥物種植研究所鄧才富研究員鑒定為P.praerupterumDunn.正品白花前胡。試驗(yàn)材料分兩組采樣，一組進(jìn)行單株采樣，挖取完整植株，剔除個(gè)體量過小的植株，剪取商品部位，去除泥沙清洗干凈，40 ℃烘干，切片粉碎過60目，依次編號(hào)S1～S18；一組進(jìn)行混合取樣20株，不分大小，剪取商品部位，去除泥沙清洗干凈， 40 ℃烘干，切片、粉碎過60目，編號(hào)S19。所有樣品保存于重慶市藥物種植研究所質(zhì)量控制研究中心樣品保管室。

1.3 試劑

甲醇(色譜純，批號(hào)20190901)、三氯甲烷(分析純，批號(hào)20120702)均購自重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；水：為臨用現(xiàn)制的超純水；白花前胡甲素(批號(hào)111711-201904)、白花前胡乙素對(duì)照品(批號(hào)111904-201804)均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取白花前胡甲素、白花前胡乙素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL各含白花前胡甲素73.0 μg、白花前胡乙素79.8 μg的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

取前胡樣品粉末(過60目)約0.5 g，精密稱定，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)15分鐘，放冷，再稱定重量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液5 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件

采用Shim-pack VP-ODS色譜柱(4.6 mm×0.5 μm×250 mm)，以甲醇-水(75∶25)為流動(dòng)相，洗脫時(shí)間40 min，流速1 mL/min，檢測波長為321 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

精密稱取樣品，按供試品溶液制備法制備，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定，計(jì)算。白花前胡甲素和乙素峰面積的RSD分別為1.29%、0.69%。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品，按供試品溶液制備法制備6份，測定，計(jì)算。白花前胡甲素和乙素峰面積的RSD分別為0.26%、0.43%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取樣品，按供試品溶液制備法制備，分別在0、3、7、13、24 h進(jìn)樣5次，白花前胡甲素和乙素峰面積的RSD分別為0.15%、0.09%。

2.4.4 線性試驗(yàn)

對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣2.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0、18.0 μL，以進(jìn)樣量為X，峰面積為Y進(jìn)行線性方程計(jì)算，白花前胡甲素線性方程為y= 339 815x-44 889，R2=0.995 5；白花前胡乙素線性方程為y=273 907x-33 865，R2=0.995 5。具有良好的線性關(guān)系。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的前胡樣品適量，共6份，置250 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入一定量的白花前胡甲素、乙素對(duì)照品溶液，按照“2.2”法制備，并測定，計(jì)算回收率，甲素平均回收率103.81%，RSD：1.52%；乙素平均回收率105.09%，RSD：0.76%(見表1)。

表1 白花前胡甲素、乙素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 數(shù)據(jù)處理方法

應(yīng)用Excel 2010、GraphPad Prism 8、Origin 8等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、處理及相關(guān)圖表繪制，以中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)進(jìn)行相似性分析，提取共有色譜峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)和正交校正的偏最小二乘分析(OPLS)，進(jìn)而篩選差異性標(biāo)志物。

2.6 雙指標(biāo)成分含量特征分析

由圖1得知，18個(gè)單株樣品中白花前胡甲素達(dá)標(biāo)11個(gè)，白花前胡乙素達(dá)標(biāo)5個(gè)(S5、S6、S7、S10和S11)，雙不達(dá)標(biāo)2個(gè)(S13和S17)，無雙達(dá)標(biāo)樣品。甲素含量極大值為極小值的3.76倍，乙素含量極大值為極小值的9.7倍。同時(shí)發(fā)現(xiàn)甲素高，乙素就低；甲素低，則乙素高；呈負(fù)相關(guān)性。而18個(gè)樣品甲素和乙素的均值為1.15%和0.24%達(dá)到藥典要求的0.9%和0.24%。通過甲素和乙素比值(A)、乙素和甲素比值(B)，分析其質(zhì)量特征，其趨勢如圖2所示。由圖中發(fā)現(xiàn)，乙素含量高的S5、S6、S7、S10和S11五個(gè)樣品的A和B數(shù)量特征較為接近；其余樣品的A和B數(shù)量特征較為接近，表明白花前胡群體質(zhì)量特征變化差異大。全小區(qū)混合取樣(S19)的指標(biāo)成分含量分別為1.278%和0.293%。

圖1 19批前胡雙指標(biāo)含量特征Fig.1 Content characteristics of double index in 19 batches of P.prasrupterum

圖2 18批前胡單株雙指標(biāo)比值圖Fig.2 Two-index ratio chart in 18 batches of P.prasrupterum注：A：甲素/乙素，B：乙素/甲素。Note:A:Praeruptorin A/praeruptorin B;B:Praeruptorin B/praeruptorin A.

2.7 譜圖相似性和化學(xué)模式識(shí)別

2.7.1 相似度分析

取收集的19批前胡樣品按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，得到19批樣品HPLC指紋圖譜，并導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版》軟件，以S1圖譜作為參照譜圖，采用中位數(shù)法，多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配生產(chǎn)共有峰6個(gè)。321 nm檢測波長下的圖譜疊加圖如圖3。根據(jù)18批樣品的HPLC檢測結(jié)果，具有6個(gè)共有特征峰，采用對(duì)照品對(duì)其2個(gè)共有峰進(jìn)行了指認(rèn)，分別為白花前胡甲素(峰2)和白花前胡乙素(峰5)(見圖4)。計(jì)算不同單株樣品之間與對(duì)照譜圖(R)的相似度見圖5。結(jié)果表明，18批前胡單株樣品相似度在0.648～0.999。相對(duì)于R，其中S5、S6、S7、S10、S11相似度較低，分別為0.948、0.879、0.827、0.753和0.823，其他樣品的相似度均在0.965～0.989之間。說明前胡不同植株類型間內(nèi)在質(zhì)量差異較大，植株類型表現(xiàn)豐富，有利于種質(zhì)資源的挖掘利用。圖5前胡指紋圖譜相似度熱圖可較為直觀地反應(yīng)植株類型間指標(biāo)成分的較大差異。

圖3 19批前胡和對(duì)照譜圖匹配圖Fig.3 HPLC fingerprints of 19 batches of P.prasrupterum

圖4 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜(A)與對(duì)照品HPLC圖(B)Fig.4 Reference fingerprint of 18 batches of P.prasrupterum(A) and HPLC chromatogram of reference substances(B)注：2.白花前胡甲素；5.白花前胡乙素。Note:2.Praeruptorin A;5.Praeruptorin B.

圖5 前胡指紋圖譜相似度熱圖Fig.5 Heat map of fingerprint similarty from P.prasrupterum

2.7.2 化學(xué)模式識(shí)別

考慮到相似度分析中不同植株間差異太大，進(jìn)一步開展化學(xué)模式分析，掌握前胡植株類型的豐富程度和內(nèi)在質(zhì)量形成規(guī)律，為生產(chǎn)中質(zhì)量穩(wěn)定性控制提供技術(shù)支撐。

2.7.2.1 HCA分析

將18個(gè)白花前胡單株樣品的6個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)輸入SICMA 14.1軟件，對(duì)樣品進(jìn)行HCA分析。通過HCA分析得聚類樹狀圖見圖6，18個(gè)樣品聚為兩類，S5、S6、S7、S10、S11、S13和S17這7個(gè)植株類型聚為一個(gè)大類；而其他的11個(gè)前胡植株類型又聚為一個(gè)大類。

圖6 前胡的聚類分析樹狀圖Fig.6 Cluster analysis of P.prasrupterum

結(jié)合雙指標(biāo)質(zhì)量特征分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，聚類分析所得兩個(gè)大類以前胡甲素含量是否達(dá)標(biāo)進(jìn)行了明顯分異。前胡甲素不達(dá)標(biāo)的聚類中除S13和S17兩個(gè)類型為雙不達(dá)標(biāo)外，其余5個(gè)類型的前胡乙素都遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，其中有4個(gè)甚至超過了一倍；而其余11個(gè)植株樣品形成的大類中，雖然前胡甲素含量達(dá)標(biāo)，但有8個(gè)植株類型的乙素指標(biāo)還不及藥典要求的50%。

2.7.2.2 PCA分析

為了更為客觀、直接的闡明前胡質(zhì)量特征的差異性，利用SICMA 14.1軟件對(duì)其共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，其得分圖可以提供可視化的前胡分類圖。將18個(gè)白花前胡的HPLC圖譜共有峰面積導(dǎo)入SICMA 14.1軟件，經(jīng)歸一化處理后進(jìn)行PCA分析，其R2X為0.999，Q2為0.787，表明模型穩(wěn)定，預(yù)測能力強(qiáng)，結(jié)果如圖7所示。

圖7 PCA得分圖Fig.7 PCA score scatter plot

由圖7可知，18個(gè)白花前胡樣品區(qū)分良好，S13和S17為一類；S5、S6、S7、S10和S11為一類；S1、S4、S8和S14聚為一類；S2、S3、S9、S12、S15、S16和S18聚為一類。表明18個(gè)白花前胡樣品的質(zhì)量差異性較大。同時(shí)也驗(yàn)證了前面聚類分析結(jié)果的可靠性。

2.7.2.3 OPLS分析

為了更好地解釋樣品組間差異性，找到組間貢獻(xiàn)率較大的共有峰，對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS分析得到散點(diǎn)圖(圖8)、VIP值圖(圖9)和載荷散點(diǎn)圖(圖10)。結(jié)果顯示，模型參數(shù)R2X=0.999，R2Y=1.00，Q2=0.434，表明模擬擬合程度和預(yù)測能力較好，當(dāng)前模型適合作為白花前胡HPLC指紋圖譜的模式識(shí)別方法。從OPLS-DA得分散點(diǎn)圖可看出，樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)均落在95%置信區(qū)間內(nèi)，說明各個(gè)樣品的化學(xué)成分相似，但分散區(qū)域較大，說明樣品在整體質(zhì)量上存在較大的差異。在載荷散點(diǎn)圖中，距離圓點(diǎn)越遠(yuǎn)，權(quán)重值越大，說明各成分的變化對(duì)區(qū)分樣品的作用越大[13,14]，結(jié)合變量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)值圖，篩選出能引起不同白花前胡樣品成分差異的主要標(biāo)記性成分，現(xiàn)在VIP>1且誤差條范圍在X>0以上的成分確定為貢獻(xiàn)較大的成分，從圖9中，可看出VIP>1且誤差條范圍在X>0以上的成分有2個(gè)，影響大小依次為峰2(白花前胡甲素)和峰5(白花前胡乙素)。同時(shí)在載荷圖中也顯示這兩個(gè)化合物的變量離原點(diǎn)的距離較遠(yuǎn)，說明這兩個(gè)成分是不同樣品間成分差異的主要標(biāo)記物。

圖8 OPLS得分圖Fig.8 OPLS score scatter plot

圖9 VIP值圖Fig.9 VIP score

圖10 載荷散點(diǎn)圖Fig.10 Loading scatter plot

3 討論與結(jié)論

研究中18個(gè)單株白花前胡甲素和白花前胡乙素平均含量為1.15%和0.24%，基本達(dá)到中國藥典的指標(biāo)要求，但全小區(qū)混合取樣的指標(biāo)成分含量分別為1.278%和0.293%，比18個(gè)單株指標(biāo)成分平均值都要高。表明在剔除的小株樣品中指標(biāo)成分含量在混合樣品含量構(gòu)成中權(quán)重較大。Song等[15]研究推測白花前胡香豆素類成分主要存在中柱鞘壁組織和次生韌皮部的分泌道中，同時(shí)Xie等[16]研究發(fā)現(xiàn)在中柱鞘壁組織和次生韌皮部的白花前胡甲素和白花前胡乙素含量最高。推測小株樣品個(gè)體類型自身含量較高，或者生長后期側(cè)根或小根中累積含量較高，是否存在小株、小根的中柱鞘壁組織和次生韌皮部占比大，分泌道多，進(jìn)而其香豆素含量高，有必要開展進(jìn)一步的詳細(xì)研究。

本研究采用HPLC技術(shù)建立前胡化學(xué)指紋譜圖，得到6個(gè)共有特征峰，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了HCA、PCA和OPLS分析，發(fā)現(xiàn)18個(gè)白花前胡樣品區(qū)分良好，共分為四類；同時(shí)得到2個(gè)特征(峰2和峰5)變量對(duì)樣品的區(qū)分影響顯著；并采用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照指認(rèn)2個(gè)特征變量為白花前胡甲素和白花前胡乙素。結(jié)果表明白花前胡甲素和白花前胡乙素在不同的植株類型間存在廣泛的變異，有必要在多產(chǎn)地平行試驗(yàn)中結(jié)合葉柄顏色、葉片裂缺深淺、葉面積、塊根性狀、單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性和穩(wěn)定性研究，分析不同農(nóng)藝性狀特征下相應(yīng)單株的質(zhì)量構(gòu)成權(quán)重及其遺傳穩(wěn)定性，在間苗或育種過程中剔除對(duì)質(zhì)量整體貢獻(xiàn)無價(jià)值的株系，從栽培管理的角度提升種植基地前胡的整體質(zhì)量水平，同時(shí)還可為品種選育與改良提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。

本研究還發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)樣株中前胡甲素含量高的，乙素就偏低；前胡甲素含量低，則乙素相對(duì)偏高；呈負(fù)相關(guān)性。而在項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)的產(chǎn)地調(diào)研過程中發(fā)現(xiàn)多數(shù)基地都是前胡甲素達(dá)標(biāo)而乙素很少達(dá)標(biāo)。通過分析白花前胡甲素和白花前胡乙素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式均為二氫花椒內(nèi)脂型香豆素，僅在其香豆素母環(huán)的10位取代基不同，甲素為乙?；?，乙素為烯?；滑F(xiàn)代合成技術(shù)利用順式凱林內(nèi)酯為母核合成白花前胡香豆素及其衍生物[17]。項(xiàng)目組推測：是否在前胡甲素和乙素兩者之間存在一種轉(zhuǎn)化關(guān)系或是在某種條件下出現(xiàn)乙素轉(zhuǎn)化為甲素有待項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)開展相應(yīng)研究做出合理評(píng)價(jià)。

本研究目前僅僅從藥典指標(biāo)成分的角度進(jìn)行了研究，尚未結(jié)合分子標(biāo)記等方法對(duì)這些種質(zhì)進(jìn)行鑒定。不同種質(zhì)類型是否受土壤類型、肥料種類、海拔高度、氣候條件等的影響，有必要在分子水平上研究前胡種質(zhì)遺傳多樣性，以精確鑒別重復(fù)和相似種質(zhì)，為遺傳育種中親本的選配提供新的依據(jù)，以便更好地開發(fā)利用前胡種質(zhì)資源。