絞股藍(lán)皂苷調(diào)控長鏈非編碼RNA TUG1/miR-26a干擾線粒體凋亡對(duì)ApoE-/-AS小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響及機(jī)制研究

宋 囡，曹慧敏，陳 絲，王 瑩，王 杰，王 群，賈連群*，楊關(guān)林*

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥創(chuàng)新工程技術(shù)中心 臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病前期的主要病理基礎(chǔ),肝臟是AS及其相關(guān)疾病啟動(dòng)和發(fā)展中最易受損的器官之一，其脂質(zhì)沉積水平直接或間接反應(yīng)動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積情況，可作為預(yù)測AS水平的指標(biāo)[1]。人類基因組中大部分為非編碼區(qū)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非編碼RNA(ncRNA)，微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(LncRNA)是ncRNA的兩個(gè)重要分類。其中，LncRNA通過多種機(jī)制在不同水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，發(fā)揮其生物學(xué)功能。近年來，miRNA和LncRNA在疾病發(fā)生發(fā)展中相互作用的分子機(jī)制引起了人們的注意[2]。長鏈非編碼RNA?；撬嵘险{(diào)基因1(taurine upregulates gene 1，TUG1)是一種進(jìn)化上高度保守的長鏈非編碼RNA。有研究發(fā)現(xiàn)TUG1與食管癌、胃癌、肝癌、肺癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]，但是其與肝臟脂質(zhì)沉積及動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，研究尚少。有研究發(fā)現(xiàn)干擾長鏈非編碼RNA TUG1可通過上調(diào)miR-26a緩解LPS誘導(dǎo)的線粒體損傷、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[4]。

絞股藍(lán)(Gynostemmapentaphyllum，GP)是絞股藍(lán)屬(Gynostemma)的多年生草本藤本植物。其名最早見于明代的《救荒本草》。其具益氣健脾，化痰止咳，清熱解毒的功效。曾被科技部“星火計(jì)劃”列為待開發(fā)的“珍貴中草藥”，在2002年被衛(wèi)生部列入保健品清單。自20世紀(jì)70年代以來，人們已經(jīng)系統(tǒng)地研究了絞股藍(lán)的化學(xué)成分及藥理學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)其主要藥用成分是絞股藍(lán)皂苷(gypenoside，GPs)。GPs通過降脂，抗血小板聚集和抗血栓形成發(fā)揮抗AS作用[5,6]。課題組前期采用ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)線粒體膜電位損傷及呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ酶活性下降，并且明確了GP的有效成分GPs、絞股藍(lán)皂苷XILX、人參皂苷GRb3可以通過提高線粒體膜電位；影響線粒體能量代謝相關(guān)蛋白；上調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的自噬效應(yīng)，降低內(nèi)皮細(xì)胞損傷，發(fā)揮對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[7-9]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本文重點(diǎn)關(guān)注GPs是否通過影響長鏈非編碼RNA TUG1/miR-26a干擾線粒體凋亡改善ApoE-/-AS小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，進(jìn)而防治AS。

1 材料

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組給藥

20只健康A(chǔ)poE-/-小鼠，10只C57BL/6J小鼠，體重20±2 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，環(huán)境溫度為22±1 ℃，濕度50%±5%，自然光照，正常飼料喂飼，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將20只健康A(chǔ)poE-/-小鼠隨機(jī)分為2組：模型組、絞股藍(lán)皂苷組，每組10只。給予高脂飼料喂飼，每日給予高脂飼料：脂肪供能比為41%的高脂純化飼料，通常稱為“西方飲食”飼料，額外添加0.15%膽固醇，喂飼12周。造模12周后，絞股藍(lán)皂苷組按照2.973 mg/kg/d灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，灌胃4周。

1.2 試劑、藥物與儀器

膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒(四川邁新生物技術(shù)有限公司)；HE染色液(北京索萊寶科技有限公司)；一抗稀釋液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP及GAPDH抗體(proteintech，中國)；絞股藍(lán)皂苷(西安天豐生物科技有限公司)；動(dòng)物組織RNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；全自動(dòng)生化分析儀(日本東芝)，7500Real Time PCR儀(美國Applied Biosystems)，Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)及配套試劑(ProteinSimple,San Jose，CA，USA)。

2 方法

2.1 動(dòng)物處置

取材實(shí)驗(yàn)前禁止進(jìn)食12 h，不禁水，稱體重，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血約5～10 mL，靜置1～2 h，3 000 rpm離心30 min，分離血清，取上清液，低溫(4 ℃)保存。取小鼠肝組織并切成小塊，分別4%多聚甲醛固定及冷凍。

2.2 血脂檢測

按生化試劑盒說明書采用全自動(dòng)生化分析儀檢測小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

2.3 HE染色觀察肝臟組織病理形態(tài)

將肝臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，按蘇木素-伊紅(HE)染色常規(guī)方法進(jìn)行。70%～100%梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋、切片(切片厚度5 μm)、貼片、烤片后，用二甲苯脫蠟、70%～100%梯度酒精復(fù)水、蘇木精染色、70%鹽酸酒精分色、伊紅復(fù)染后，再用70%～100%梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片石蠟包埋，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝臟組織形態(tài)。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR檢測長鏈非編碼TUG1、miRNA-26a及Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP mRNA表達(dá)

Trizol處理各組肝臟組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)定PCR反應(yīng)條件，用SYBR Green Mater Mix試劑檢測待測基因的mRNA及miRNA水平(引物序列見表1)，共重復(fù)檢測3次。用ΔΔCT法對(duì)RT-PCR結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。ΔCT值為目的基因CT值與管家基因(GAPDH，U6)CT值的差值，ΔΔCT為各實(shí)驗(yàn)組ΔCT與空白對(duì)照組ΔCT的差值。平均相對(duì)含量=2-ΔΔCT，為相對(duì)于正常組mRNA及miRNA水平。

表1 引物序列

2.5 Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)檢測Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP 蛋白表達(dá)

打開Wes、電腦和Compass軟件，進(jìn)行硬件自檢。利用RIPA蛋白裂解液(含PMSF)提肝臟組織蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，使用Antibody Diluent II按1∶50比例稀釋一抗，每個(gè)樣品上樣量為4.5 μL(包括5×Master Mix 0.9 μL，樣品原液與0.1×Sample Buffer合為3.6 μL，95 ℃變性5 min)。樣品制備后，分別按照樣品、封閉液、一抗、二抗、發(fā)光液及清洗緩沖液的順序加入板內(nèi)，排板布局，點(diǎn)擊start進(jìn)行檢測，檢查結(jié)束后分析結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 絞股藍(lán)皂苷對(duì)ApoE-/-AS小鼠血脂水平的影響

與正常對(duì)照組相比，模型ApoE-/-小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，絞股藍(lán)皂苷組血清中TG、TC、LDL-C水平均發(fā)生顯著性降低(P<0.01)，HDL-C水平無明顯變化趨勢(見表2)。

表2 各組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的比較

3.2 絞股藍(lán)皂苷對(duì)ApoE-/- AS小鼠肝臟病理形態(tài)的改變

正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞為圓形，細(xì)胞核居中，胞漿內(nèi)未見脂滴，排列方式為條索狀且肝竇不狹窄；模型組肝細(xì)胞體積變大，胞漿內(nèi)可見大量的脂肪空泡，且大小不等，肝竇狹窄或消失；絞股藍(lán)皂苷組較模型組有所變化，其肝細(xì)胞脂肪變性程度減輕，脂肪空泡明顯減少，肝竇狹窄有所減輕(見圖1)。

圖1 小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)改變結(jié)果(200×)Fig.1 Results of pathological morphological changes of mouse liver (200×) 注：A：正常組；B：模型組；C：絞股藍(lán)皂苷組Note:A:Normal group;B:Model group;C:Gypenoside group

3.3 絞股藍(lán)皂苷對(duì)ApoE-/-AS小鼠肝臟長鏈非編碼TUG1、miRNA-26a及Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP mRNA表達(dá)的影響

與正常組相比，模型ApoE-/-AS小鼠肝臟Lnc-TUG1表達(dá)顯著升高，miRNA-26a顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，絞股藍(lán)皂苷肝臟Lnc-TUG1表達(dá)有所下降，miRNA-26a表達(dá)有所上調(diào)(P<0.05)；與正常對(duì)照組相比，模型ApoE-/-AS小鼠肝臟Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved PARP mRNA表達(dá)顯著升高，cleaved caspase-9 mRNA僅有上升趨勢，Bcl2 mRNA顯著下降(P<0.01或P<0.05)；與模型組相比，絞股藍(lán)皂苷小鼠肝臟Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，cleaved PARP mRNA僅有下調(diào)趨勢，Bcl2 mRNA顯著上調(diào)(P<0.01或P<0.05,見圖2)。

圖2 各組小鼠肝臟Lnc TUG1、miRNA-26a及Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP mRNA的表達(dá)(n=3)Fig.2 The expression of Lnc TUG1,miRNA-26a and Bcl2,Bax,Cytc,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,cleaved PARP mRNA in the liver of each group of mice (n=3)注：A：正常組；B：模型組；C：絞股藍(lán)皂苷組。與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01，下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Gypenoside group.Compared with the normal control group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.The same below.

3.4 絞股藍(lán)皂苷對(duì)ApoE-/-AS小鼠肝臟Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP蛋白影響

與正常對(duì)照組相比，模型ApoE-/-AS小鼠肝臟Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl2蛋白顯著下降(P<0.01或P<0.05)；與模型組相比，絞股藍(lán)皂苷小鼠肝臟Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl2蛋白顯著上調(diào)(P<0.01或P<0.05)(見圖3)。

圖3 各組小鼠肝臟Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP蛋白表達(dá)(n=3)Fig.3 The expression of Bcl2,Bax,Cytc,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9 and cleaved PARP protein in the liver of each group of mice (n=3)

4 討論與結(jié)論

隨著人們生活水平顯著提高，飲食結(jié)構(gòu)也有所改變，在高膽固醇飲食與高強(qiáng)度工作壓力等因素下，心血管疾病的發(fā)病率逐漸增高，AS為心血管疾病最主要的死亡因素，對(duì)其防治具有重要的意義。GP系葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物。絞股藍(lán)全草入藥，性涼，味苦、微甘，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有清熱解毒、止咳清肺祛痰、養(yǎng)心安神、補(bǔ)氣生精之功效[10]。GPs是從GP中提取的有效成分群，含有80余種人參皂苷類成分，所有GPs的苷元部分都為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類，對(duì)治療和預(yù)防AS等心血管疾病有顯著功效[11,12]。

長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid，LncRNA)是一類長度超過200 nt的功能性RNA分子，不具有蛋白編碼功能，早期被認(rèn)為是RNA轉(zhuǎn)錄過程中的“噪音”[13]。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA參與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[14]。值得重視的是LncRNA也在心血管疾病中存在差異表達(dá)，并且通過不同的作用機(jī)制在心血管疾病的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用，參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。前期研究已明確miRNA通過與靶mRNA上的互補(bǔ)序列結(jié)合來抑制mRNA的翻譯或促進(jìn)mRNA的降解[15]，而LncRNA可以作為miRNA海綿與miRNA相互作用[16]來影響mRNA進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在缺氧/復(fù)氧條件下，LncRNA AK088388通過作為miR-30a的內(nèi)源性RNA海綿來調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的自噬[17]。LncRNA Mexis是依賴于LXR轉(zhuǎn)錄的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)基因的擴(kuò)增器，而ABCA1蛋白可將動(dòng)脈血管壁細(xì)胞內(nèi)的膽固醇泵出細(xì)胞，對(duì)高密度脂蛋白(HDL)的形成和膽固醇外流的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[18]。可見，LncRNA參與脂質(zhì)代謝影響AS發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究不容忽視。TUG1是一種進(jìn)化上高度保守的長鏈非編碼RNA，目前研究明確TUG1不僅與食管癌、胃癌、肝癌、肺癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展極為密切，LncRNA TUG1與miR-138-5p相互影響可能參與慢性心力衰竭的發(fā)病發(fā)展[19,20]，并且可通過上調(diào)miR-26a緩解LPS誘導(dǎo)的線粒體損傷、細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-26在心血管疾病中發(fā)揮重要作用，其在心臟疾病中表達(dá)下調(diào)，miRNA-26在心肌肥大中起關(guān)鍵作用，大鼠模型和心肌細(xì)胞中miRNA-26a/b表達(dá)均下調(diào)[21]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，線粒體凋亡途徑在AS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，并且在此過程中，GPs具有調(diào)節(jié)作用。根據(jù)ApoE-/-小鼠在高脂喂飼12周可出現(xiàn)典型的AS病理特征，本文選用AS經(jīng)典模型(ApoE-/-的C57BL/6J小鼠)作為主要研究對(duì)象，以C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照[22]，重點(diǎn)關(guān)注GPs是否通過影響長鏈非編碼RNA TUG1/miR-26a干擾線粒體凋亡改善ApoE-/-AS小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，進(jìn)而防治AS。

研究發(fā)現(xiàn)GPs可以改善ApoE-/-AS小鼠血脂水平及肝臟脂質(zhì)沉積情況，結(jié)果與前期研究一致。在此基礎(chǔ)上，首先發(fā)現(xiàn)ApoE-/-AS小鼠肝臟長鏈非編碼RNA TUG1明顯上調(diào)，而miR-26a顯著下調(diào)，經(jīng)GPs干預(yù)后，上述情況出現(xiàn)反向結(jié)果。而線粒體凋亡途徑相關(guān)指標(biāo)也同時(shí)發(fā)生變化，ApoE-/-AS小鼠肝臟Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表達(dá)趨勢基本一致，在模型組中Bcl2 mRNA及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，GPs干預(yù)后，Bcl2 mRNA及蛋白表達(dá)有所上調(diào)，Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表達(dá)有所下調(diào)。線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的主要基地和供應(yīng)能量的重要場所，在細(xì)胞凋亡的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。線粒體是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，作為細(xì)胞的能量工廠，參與氧化磷酸化和ATP的生成，同時(shí)線粒體功能障礙也將會(huì)導(dǎo)致ATP合成受損。內(nèi)源性線粒體途徑是細(xì)胞凋亡主要途徑之一，Cytc是線粒體內(nèi)包含的與細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系的物質(zhì)。在凋亡信號(hào)的刺激下，線粒體膜的通透性處于開發(fā)狀態(tài)，Cytc的釋放以及caspase的激活進(jìn)而發(fā)生線粒體凋亡[23,24]。可見，Cytc由線粒體釋放至胞漿是引發(fā)線粒體凋亡途徑發(fā)生的關(guān)鍵步驟，Cytc釋放是在細(xì)胞凋亡早期發(fā)生的重要事件，具體環(huán)節(jié)為通過線粒體MPTP或Bcl-2家族成員調(diào)控的MOMP釋放到細(xì)胞質(zhì)中，接下來釋放到細(xì)胞質(zhì)中的Cytc進(jìn)一步被利用，可在ATP/dATP存在的情況下，與caspase-9結(jié)合形成凋亡復(fù)合物，繼而活化caspase-9，活化后的caspase-9又可激活caspase-3，進(jìn)一步啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25,26]。Caspase是一類酶原，正常狀態(tài)下是以無活性的結(jié)構(gòu)存在的，caspase依賴的線粒體通路中，Cytc從線粒體釋放后與ATP，Apaf-1聯(lián)合構(gòu)成多聚體，同時(shí)caspase-9和它結(jié)合構(gòu)成凋亡體，可水解caspase-9酶原而激活caspase-9，激活的caspase-9又可以進(jìn)一步激活caspase-3，活化的caspase-3可切割DNA修復(fù)酶PARP，使PARP被剪切為小片段，不能發(fā)揮其正常功能，進(jìn)而導(dǎo)致DNA裂解，最終引起細(xì)胞凋亡[27,28]。綜上結(jié)果說明，GPs可能通過影響長鏈非編碼RNA TUG1/miR-26a干擾線粒體凋亡改善ApoE-/-AS小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，進(jìn)而防治AS，其干擾機(jī)制可能與調(diào)控線粒體凋亡的Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP表達(dá)水平有關(guān)。然而，其具體靶向調(diào)控關(guān)系，有待后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)深入驗(yàn)證，此研究有望為中藥防治疾病的網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)分析、中藥多成分多靶點(diǎn)復(fù)雜機(jī)制解析等研究奠定基礎(chǔ)，為中西醫(yī)結(jié)合防治心血管疾病及臨床應(yīng)用提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。