山奈酚調(diào)控AMPK/NOX4通路抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和胞外基質(zhì)積聚

玄露露，李彥秋，王懷杰，柳 凡，陳 瑩，趙春貞，王榮申*，李萬忠*

1濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，濰坊 261053；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012

DN有多種發(fā)病機(jī)制，其中OS是DN中關(guān)鍵致病因素，系由ROS水平升高引起[2]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)家族(NOX 1-5和Duox 1-2)通過質(zhì)膜將電子轉(zhuǎn)移到氧分子上產(chǎn)生ROS，此為DN中ROS主要來源之一[3]。NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)是DN患者腎臟中高度表達(dá)的NADPH亞型，是高糖誘導(dǎo)GMCs中OS產(chǎn)生的主要原因[3]。NOX4水平升高能夠直接引起腎小球纖維化[2]。沉默NOX4表達(dá)將會(huì)減弱腎小球膜擴(kuò)張、腎小球硬化和ECM積聚，揭示高糖刺激NOX4表達(dá)升高的分子機(jī)制及其涉及的上下游效應(yīng)因子具有重要意義。

5′-腺苷單磷酸激活蛋白激酶(5′-adenosine monophosphate-activated protein kinases，AMPK)磷酸化可以阻斷高糖誘導(dǎo)的NOX4表達(dá)，同時(shí)能夠抑制腎成纖維細(xì)胞的異常增殖和激活[4]。Sestrins是一種重要的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白家族，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用，其中Sestrin2是最重要的家族成員之一，可通過激活A(yù)MPK磷酸化，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷中起關(guān)鍵作用[5]。此外，AMPK可能是NOX激活的負(fù)調(diào)節(jié)劑，因?yàn)镾estrin2和AMPK激活可以抑制ROS，保護(hù)GMCs免受OS侵害[6]，表明激活Sestrin2和AMPK磷酸化可能具有預(yù)防DN作用。

基于OS和ECM積累已被證明在DN發(fā)病機(jī)理中起到重要作用，所以尋找具有抗氧化作用和減弱DN效應(yīng)的中藥及天然產(chǎn)物顯得尤為迫切。黃酮類成分因其出色功效而引起越來越多的學(xué)者研究。山奈酚(kaempferol，KAE)是一種黃酮類化合物，已被證明具有多種藥理活性。KAE通過抑制炎癥反應(yīng)和OS，減輕高血糖所致心臟損傷[7]；通過抑制RhoA/Rho激酶介導(dǎo)的炎癥信號(hào)，從而改善DN[8]。目前，關(guān)于KAE通過調(diào)節(jié)AMPK/NOX4途徑干預(yù)高糖誘導(dǎo)的GMCs OS和ECM積累的研究相對(duì)較少。本研究運(yùn)用GMCs體外高糖模型，探討KAE對(duì)高糖誘導(dǎo)的GMCs中OS和ECM積累的影響及其對(duì)DN的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

山奈酚(純度≥98%，HPLC分析，成都曼斯特生物科技有限公司)；GMCs細(xì)胞(南京KeyGen生物技術(shù)公司)；DMEM培養(yǎng)基(南京KeyGen生物技術(shù)公司)；DMSO、DCFH-DA熒光探針、青鏈霉素、MTT、RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑(索萊寶生物技術(shù)公司)；BCA蛋白測(cè)定試劑盒和Trizol(江蘇康為世紀(jì)有限公司)；Diphenylene iodonium(DPI，純度：99.90%，HY-100965，上海MCE公司)；高靈敏度NADPH熒光定量試劑盒和Lipofectamine 2000(美國(guó)Sigma公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)(南京建成生物技術(shù)有限公司)；Compound C(純度：99.65%，HY-13418A，上海MCE公司)；Anti-Sestrin2(ab236025，Abcam)；anti-phospho-AMPK(ab133448，Abcam)；anti-AMPK(ab80039，Abcam)；anti-NADPH oxidase 4(ab133303，Abcam)；anti-p22phox(ab75941，Abcam)；TGF-β1(ab92486，Abcam)；Collagen IV(ab6586，Abcam)；β-actin(ab8227)；GAPDH(ab8245)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光(日本Toyobo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)羅氏公司)；梯度PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；蛋白電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；M5多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

GMCs細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%，接種于96孔板，進(jìn)行如下分組：正常組(normal glucose group，NG，5.6 mM葡萄糖)；高糖組(high glucose group，HG，30 mM葡萄糖)；滲透壓組(mannitol group，MA，30 mM甘露醇)；DPI(陽性藥物組，10 μM DPI + 30 mM葡萄糖)；山奈酚藥物組(5、10、20、40、80 μg/mL KAE + 30 mM葡萄糖)[9]。為了抑制AMPK/NOX4通路，使用compound C(10 μM)抑制AMPK表達(dá)。使用100 pmol的siNOX4、sip22phox瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GMCs，48 h后，Western blot檢測(cè)沉默效率。

1.4 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將GMCs(5×103個(gè)/mL)接種于96孔板內(nèi)，每孔加入100 μL含有不同濃度的KAE溶液(5、10、20、40、80 μg/mL)以及10 μM的DPI溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL)避光培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL的DMSO，脫色搖床振蕩10 min，使底部甲瓚完全被DMSO溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值。

二是在縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督管理站建成農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管平臺(tái)，重點(diǎn)生產(chǎn)基地、農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)設(shè)立檢測(cè)室，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)地、用藥情況等追蹤溯源，實(shí)現(xiàn)從產(chǎn)前、產(chǎn)中、上市前全程受控，確保了全縣產(chǎn)銷農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。

1.5 細(xì)胞增殖

將GMCs(5×103個(gè)/mL)接種于96孔板內(nèi)，按照“1.3”進(jìn)行細(xì)胞分組處理48 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定

使用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將細(xì)胞接種于96孔或6孔板內(nèi)，按照1.3進(jìn)行細(xì)胞分組處理48 h，每孔加入10 μM DCFH-DA，避光培養(yǎng)30 min。PBS洗滌3次，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光，酶標(biāo)儀(λex= 488 nm，λem= 525 nm)測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.7 細(xì)胞內(nèi)NOX、MDA、SOD活性測(cè)定

使用高靈敏度NADPH熒光定量測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NOX活性。收集GMCs，1 000×g離心3 min。棄去上清，PBS洗滌2次。用200 μL預(yù)冷的NADPH提取緩沖液破碎細(xì)胞。冰上靜置10 min，10 000×g離心5 min，以去除雜質(zhì)。吸取上清與NADPH工作液混合，室溫孵育60 min。用酶標(biāo)儀(λex= 535 nm，λem= 587 nm)測(cè)定熒光強(qiáng)度。MDA和SOD抗氧化指標(biāo)按相應(yīng)說明書進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.8 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析

Trizol提取細(xì)胞總RNA，Toyobo高容量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測(cè)相關(guān)mRNA的表達(dá)。2-ΔΔCt方法計(jì)算并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。引物序列如下：GAPDH，正向GTTACCAGGGC TGCCTTCTC和反向ACCAGCTTCCCATTCTCAG；NOX4，正向TGCATGGTGGTGGTATTGTTCCTC和反向AGCAGCAGCAGCATGTAGAAGAC；p22phox，正向CATGGAGCGGTGTGGACAGAAG和反向GCAGGCACGG ACAGCAGTAAG；TGF-β1，正向GCAACAATTCCTGGCGTTACCTTG和反向TGTATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC；Col IV，正向GATTGTGGTGGCT CTGGCTGTG和反向TCGTTCCAGGAAGTCCAGGTTCTC；Sestrin2，正向GACAACCTGGCGGTGGTGATG和反向CGTGTGCAGCAGCAGGTAGTG；AMPK，正向GACAACCTGGCGGTGGTGATG和反向CGTGTGCAGCAG CAGGTAGTG。

1.9 Western blot

收集GMCs，用含10% PMSF的RIPA裂解液進(jìn)行裂解并提取蛋白。使用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。吸取樣品30 μg加入到8%或12% SDS-PAGE凝膠中電泳，并用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜1.5 h，TBST洗滌三次，在Sestrin2、AMPK、P-AMPK、NOX4、p22phox、TGF-β1、Col IV、β-Actin或GAPDH的特異性一抗中4 ℃孵育過夜。TBST洗滌三次，二抗室溫孵育1 h，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，Image J軟件定量分析蛋白條帶灰度值。β-Actin或GAPDH作為內(nèi)參。

1.10 分子對(duì)接

Sestrin2(PDB ID：6N0M)和AMPK(PDB ID：4CFF)晶體結(jié)構(gòu)從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫下載，運(yùn)用MOE軟件進(jìn)行對(duì)接研究。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示，采用單因素方差分析(ANOVA)分析多組間的顯著性差異。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)三次，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 山奈酚抑制HG誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞增殖

為了研究KAE對(duì)GMCs的作用，通過MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖。如圖1a所示，運(yùn)用不同劑量的KAE(5、10、20和40 μg/mL)作用細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活力沒有明顯變化，表明該劑量下KAE沒有細(xì)胞毒性?；诖耍覀冞x取濃度為5、10、20 μg/mL的KAE進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，研究KAE對(duì)HG誘導(dǎo)的GMCs增殖影響，結(jié)果如圖1b顯示。與低糖(NG)組相比，HG顯著刺激細(xì)胞生長(zhǎng)；KAE以濃度依賴性方式抑制細(xì)胞增殖；MA組中細(xì)胞增殖與低糖組相似，表明HG刺激細(xì)胞異常增殖，而不是由于滲透壓升高所致。

圖1 山奈酚(KAE)抑制高糖(HG)誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞增殖Fig.1 Kaempferol (KAE) attenuated high glucose (HG)-stimulated cell proliferation in GMCs注：(a)MTT法測(cè)定山奈酚對(duì)GMCs細(xì)胞毒性的影響；(b)MTT法測(cè)定山奈酚對(duì)高糖誘導(dǎo)的GMCs增殖的影響。與NG比較，#P < 0.05；與HG比較，*P < 0.05,**P < 0.01。Note:(a) The effects of KAE on the cytotoxicity of GMCs were assessed by MTT assay;(b) The effects of KAE on HG-induced GMCs proliferation were assessed by MTT assay.#P < 0.05 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

2.2 山奈酚抑制HG誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

為了研究HG刺激GMCs后細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化，使用DCFH-DA熒光探針作用細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡下拍照觀察，在λex = 488 nm，λem = 525 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖2所示。與NG組相比，HG組內(nèi)細(xì)胞綠色熒光更多更強(qiáng)，ROS產(chǎn)生明顯增加(見圖2a)；KAE作用24 h后ROS產(chǎn)生降低(圖2a、b)，說明KAE能夠清除細(xì)胞內(nèi)ROS，具有一定抗氧化作用。

圖2 山奈酚(KAE)抑制高糖(HG)誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞內(nèi)ROS的生成Fig.2 KAE attenuated high glucose (HG)-stimulated ROS generation in GMCs注：(a)DCFH-DA熒光探針作用細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡記錄山奈酚對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響；(b)用酶標(biāo)儀定量ROS水平。與NG比較，##P < 0.01；與HG比較，**P < 0.01。Note:(a) GMCs were treated with DCFH-DA fluorescent probe,and the effects of KAE on intracellular ROS production were recorded by inverted fluorescence microscopy;(b) The ROS level was quantified by microplate reader.##P < 0.01 vs NG;**P < 0.01 vs HG.

2.3 山奈酚對(duì)HG誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞內(nèi)NOX、MDA、SOD影響

為了研究KAE抗氧化能力，使用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NOX、MDA、SOD水平變化，如圖3a、b所示。與NG組相比，HG刺激細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)NOX活性、MDA含量明顯增高；經(jīng)過KAE處理后，顯著抑制NOX和MDA活性。如圖3c可知，在HG刺激下，細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著下降，KAE可以劑量依賴性方式增加SOD活性，表明KAE通過去除自由基而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害。

圖3 山奈酚(KAE)對(duì)高糖(HG)誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞內(nèi)NOX、MDA、SOD的影響Fig.3 Effects of kaempferol (KAE) on NOX,MDA and SOD in high glucose (HG)-stimulated GMCs注：山奈酚對(duì)高糖誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞內(nèi)NOX(a)、MDA(b)、SOD(c)的影響。與NG比較，##P < 0.01；與HG比較，**P < 0.01。Note:Effects of KAE on NOX (a),MDA (b),SOD (c) in HG-induced GMCs.##P < 0.01 vs NG;**P < 0.01 vs HG.

2.4 山奈酚對(duì)HG誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞內(nèi)ECM積聚影響

DN早期變化是GMCs肥大，這是由于高血糖早期階段蛋白質(zhì)合成增加所致。如圖4a所示，HG組中細(xì)胞總蛋白與細(xì)胞數(shù)量的比率明顯大于NG組；經(jīng)KAE處理，細(xì)胞比率呈劑量依賴性下降。為了闡明KAE對(duì)ECM積累影響，利用qRT-PCR評(píng)估TGF-β1和Col IV的mRNA表達(dá)水平。如圖4b、c所示，HG顯著刺激GMCs中TGF-β1和Col IV mRNA表達(dá)；KAE處理后其表達(dá)水平下降。Western blot結(jié)果表明，KAE抑制HG刺激的GMCs中TGF-β1和Col IV蛋白水平表達(dá)(圖4d～f)，表明KAE可以抑制HG誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ECM積聚。

圖4 山奈酚(KAE)對(duì)高糖(HG)刺激的GMCs內(nèi)ECM的影響Fig.4 Effect of kaempferol (KAE) on ECM accumulation in high glucose (HG)-induced GMCs注：(a)細(xì)胞總蛋白與細(xì)胞數(shù)量的比率表示為μg/105個(gè)細(xì)胞；(b、c)qRT-PCR分別檢測(cè)KAE處理對(duì)TGF-β1和Col IV mRNA表達(dá)的影響；(d～f)Western blot分別檢測(cè)KAE處理對(duì)TGF-β1和Col IV蛋白表達(dá)的影響。與NG比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與HG比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:(a) The ratio of total protein to cell number is expressed as μg/105 cells;(b,c) The mRNA effects of KAE treatment on TGF-β1,Col IV expression in HG-treated GMCs using qRT-PCR,respectively;(d-f) The protein effects of KAE treatment on TGF-β1,Col IV expression in HG-treated GMCs using Western blot,respectively.#P < 0.05,##P < 0.01 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

2.5 山奈酚對(duì)HG誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞內(nèi)NOX4和p22phox影響

NOX是一種酶復(fù)合物，可以促進(jìn)ROS產(chǎn)生。由于NOX家族的蛋白亞型只有結(jié)合跨膜亞基(p22phox)形成活性復(fù)合物，才能發(fā)揮其生物學(xué)功能，所以我們通過qRT-PCR和Western blot分析檢測(cè)KAE對(duì)NOX4和p22phox表達(dá)影響。結(jié)果表明：HG刺激GMCs中NOX4和p22phox的mRNA和蛋白水平表達(dá)，而KAE能夠抑制NOX4和p22phox表達(dá)(圖5a～d)?；诖?，KAE可以通過抑制NOX家族蛋白亞型，發(fā)揮其抗氧化作用。

圖5 山奈酚(KAE)對(duì)高糖(HG)誘導(dǎo)的GMCs內(nèi)NOX4和p22phox表達(dá)的影響Fig.5 Effects of kaempferol (KAE) on NOX4 and p22phox expression in high glucose (HG)-induced GMCs注：(a、b)qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)KAE對(duì)NOX4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響；(c、d)qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)KAE對(duì)p22phox mRNA和蛋白表達(dá)的影響。與NG比較，##P < 0.01；與HG比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:(a,b) The mRNA and protein effects of KAE on NOX4 expression in HG-induced GMCs using qRT-PCR and Western blot,respectively;(c,d) The mRNA and protein effects of KAE on p22phox expression in HG-induced GMCs using qRT-PCR and Western blot,respectively.##P < 0.01 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

2.6 山奈酚對(duì)HG誘導(dǎo)的GMCs中Sestrin2/AMPK通路影響

為了進(jìn)一步探究KAE作用的分子機(jī)制，我們使用qRT-PCR和Western blot方法確認(rèn)Sestrin2/AMPK通路的潛在參與。由圖6a～d可知，與NG組相比，HG刺激抑制Sestrin2和P-AMPK表達(dá)；加入KAE后，Sestrin2和P-AMPK表達(dá)顯著升高，表明KAE可以能通過激活Sestrin2/AMPK通路發(fā)揮抗氧化作用。

圖6 山奈酚(KAE)對(duì)高糖(HG)誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞內(nèi)Sestrin2和AMPK表達(dá)的影響Fig.6 Effects of kaempferol (KAE) on Sestrin2 and AMPK expression in high glucose (HG)-induced GMCs注：(a、b)qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)KAE對(duì)Sestrin2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響；(c、d)qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)KAE對(duì)AMPK mRNA和蛋白表達(dá)的影響。與NG比較，#P < 0.05,##P < 0.01；與HG比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:(a,b) The mRNA and protein effects of KAE on Sestrin2 expression in HG-induced GMCs using qRT-PCR and Western blot,respectively;(c,d) The mRNA and protein effects of KAE on AMPK expression in HG-induced GMCs using qRT-PCR and Western blot,respectively.##P < 0.01 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

2.7 siNOX4和sip22phox抑制HG誘導(dǎo)的GMCs中ROS和ECM積聚

為了探究NOX4/p22phox在分子機(jī)制中作用，我們利用siNOX4和sip22phox小干擾RNA，將HG誘導(dǎo)的GMCs中NOX4和p22phox沉默。首先，利用Western blot檢測(cè)基因沉默效果，與NC、NT相比，siRNA降低NOX4和p22phox表達(dá)(見圖7a～c)。其次，檢測(cè)在HG存在下，siNOX4和sip22phox對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響，如圖7d、e所示，與HG組相比，siNOX4和sip22phox明顯抑制ROS產(chǎn)生。由圖7f～i可知，siNOX4和sip22phox降低了TGF-β1和Col IV蛋白表達(dá)水平，說明激活HG誘導(dǎo)的ROS和ECM積累，可能由于NOX4/p22phox信號(hào)介導(dǎo)引起。

圖7 siNOX4和sip22phox對(duì)高糖(HG)誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞內(nèi)ROS和ECM積累的影響Fig.7 Effects of siNOX4 and sip22phox on intracellular ROS and ECM accumulation in high glucose (HG)-induced GMCs注：(a～c)用非靶向siRNA(NT)、siNOX4和sip22phox轉(zhuǎn)染GMCs,Western blot檢測(cè)NOX4和p22phox的蛋白表達(dá)水平；(d)DCFH-DA熒光探針作用細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡記錄山奈酚對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響；(e)用酶標(biāo)儀定量ROS水平；(f～i)Western blot檢測(cè)TGF-β1(f、h)和Col IV(g、i)的蛋白表達(dá)水平。與NG比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與HG比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:(a-c) GMCs were transfected with nontargeting siRNA (NT),siNOX4,sip22phox,and then the protein expression levels of NOX4 and p22phox were determined by Western blot;(d) GMCs were treated with DCFH-DA fluorescent probe,and the effects of KAE on intracellular ROS production were recorded by inverted fluorescence microscopy;(e) The ROS level was quantified by microplate reader;(f-i) The factors of TGF-β1 (f,h) and Col IV (g,i) were examined by Western blot.#P < 0.05,##P < 0.01 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

2.8 Compound C逆轉(zhuǎn)山奈酚對(duì)HG誘導(dǎo)的GMCs保護(hù)作用

考慮到AMPK參與KAE對(duì)HG誘導(dǎo)的GMCs作用，我們使用Compound C抑制AMPK表達(dá)。結(jié)果表明：Compound C逆轉(zhuǎn)KAE對(duì)HG誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞增殖、OS和ECM積聚的保護(hù)作用 (見圖8 a～g)。為了進(jìn)一步闡明KAE是否能直接結(jié)合Sestrin2/AMPK的活性位點(diǎn)，采用分子對(duì)接方法研究Sestrin2與AMPK的相互作用。KAE與Sestrin2的Glu-E451、Ser-E450、Thr-E377、Tyr-E375、Thr-E374、Thr-E386形成氫鍵對(duì)接，與His-E454形成苯環(huán)對(duì)接(見圖8h)。KAE可與AMPK的Glu-E274、Pro-A367、Lys-E170、Arg-E299和殘基Arg-E269形成5個(gè)強(qiáng)氫鍵，與Arg-E269形成苯環(huán)對(duì)接(見圖8i)?；谝陨戏治?，KAE可能通過激活Sestrin2/AMPK通路發(fā)揮抗氧化作用。

圖8 Compound C逆轉(zhuǎn)了山奈酚(KAE)在GMCs中對(duì)高糖(HG)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、OS和ECM積累的保護(hù)作用Fig.8 Compound C reversed the protective effects of KAE against high glucose (HG)-induced cell proliferation,OS and ECM accumulation in GMCs注：(b)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；(c)用酶標(biāo)儀測(cè)定ROS水平；(a、d～g)用Western blot檢測(cè)AMPK(d)、NOX4(e)、TGF-β1(f)、Col IV(g)蛋白水平；(h、i)采用分子對(duì)接方法研究了KAE與Sestrin2/AMPK的相互作用。與NG比較，##P < 0.01；與HG比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:(b) The cell proliferation was assessed by MTT assay;(c) The ROS level was quantified by microplate reader;(a,d-g) The protein levels of AMPK (d),NOX4 (e),TGF-β1 (f),and Col IV (g) were determined by Western blot;(h,i) Molecular docking methods were used to study the interaction between KAE and Sestrin2/AMPK.##P < 0.01 vs NG;*P < 0.05,**P < 0.01 vs HG.

3 討論與結(jié)論

血糖水平升高被認(rèn)為是糖尿病腎病腎功能和病理改變的關(guān)鍵因素[10]。由于在HG環(huán)境下培養(yǎng)的系膜細(xì)胞表型與DN患者相似[11]，故在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究KAE在體外對(duì)HG誘導(dǎo)的GMCs損傷保護(hù)作用，結(jié)果表明KAE通過調(diào)節(jié)AMPK/NOX4途徑抑制HG誘導(dǎo)的GMCs細(xì)胞增殖，OS和ECM積累。

DN早期特征是系膜細(xì)胞異常增殖和ECM過度沉積，通常導(dǎo)致腎小球系膜增生，腎纖維化和終末期腎損害[3]。膠原蛋白、纖維連接蛋白(FN)和層粘連蛋白是ECM的主要成分，其主要是在高血糖刺激下合成[12]。在DN中，TGF-β1是參與腎臟ECM積累的關(guān)鍵細(xì)胞因子[13]。在正常生理狀況下，機(jī)體多種細(xì)胞可以分泌不活躍狀態(tài)的TGF-β1；在高糖環(huán)境下，不活躍狀態(tài)的TGF-β1可以轉(zhuǎn)化為活躍狀態(tài)，通過增加ECM基因(如Col IV)表達(dá)和減少ECM降解，促進(jìn)腎小球ECM積累[13]。抑制TGF-β1能夠減弱高糖誘導(dǎo)的ECM基因表達(dá)變化，從而減少DN中ECM積累[14]。結(jié)果表明，在高糖刺激的GMCs細(xì)胞中，TGF-β1、Col IV的mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯升高，而KAE處理后可以降低其表達(dá)，表明KAE可以通過降低ECM積累和促進(jìn)其降解來發(fā)揮抗糖尿病作用。

DN發(fā)病機(jī)制與OS發(fā)生有關(guān)，可以激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路并刺激轉(zhuǎn)錄因子，從而導(dǎo)致ECM積累增加并減少基質(zhì)降解。HG誘導(dǎo)的ROS生成，會(huì)破壞氧化劑和抗氧化劑之間平衡，干擾抗氧化劑防御系統(tǒng)，從而導(dǎo)致GMCs受損。基于此，ROS的過量產(chǎn)生在DN發(fā)病機(jī)理中起到重要作用。在病理?xiàng)l件下，ROS清除需要酶和非酶系統(tǒng)的共同參與，例如SOD和MDA[15]。SOD是一種抗氧化劑金屬酶，通過催化超氧陰離子和過氧化氫歧化，在維持氧化和抗氧化之間平衡中發(fā)揮重要作用[16]。MDA對(duì)抗氧化劑防御系統(tǒng)有影響，因?yàn)镸DA水平與GMCs中膜脂質(zhì)過氧化水平直接相關(guān)[16]。結(jié)果顯示，KAE可能增加HG誘導(dǎo)的GMCs中SOD活性并降低MDA含量，表明KAE具有潛在的抗氧化特性。

ROS轉(zhuǎn)導(dǎo)和葡萄糖信號(hào)增強(qiáng)被認(rèn)為是促進(jìn)DN發(fā)展的重要致病因素。腎臟內(nèi)ROS有多種來源，其中NOX家族的NADPH氧化酶亞型主要與糖尿病腎病有關(guān)[3]。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)NOX家族有七個(gè)亞型，其中NOX4在大鼠和小鼠腎小球、足細(xì)胞和腎小管細(xì)胞中大量表達(dá)。通常情況下，NOX4和跨膜亞基(p22phox)結(jié)合形成活性復(fù)合物，才會(huì)發(fā)揮其生物學(xué)功能[17]。NOX4上調(diào)與暴露于HG的系膜細(xì)胞和管狀細(xì)胞中FN和TGF-β1升高有關(guān)[18]。NOX4與成纖維細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的ECM積累有關(guān)，有助于其分化為纖維化的成纖維細(xì)胞表型。NOX4被證明介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ治療下的系膜肥大的增加，以及FN升高[19]。過多OS和ECM積聚可能導(dǎo)致腎損傷，并被認(rèn)為是DN發(fā)生的重要原因。為了探討OS、ECM積聚和NOX之間關(guān)系，使用Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)DN中高表達(dá)的NOX4亞型的蛋白和mRNA水平。研究表明，消除NOX4活性會(huì)導(dǎo)致HG誘導(dǎo)的GMCs中OS和ECM降低[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前研究一致，HG通過上調(diào)NOX4和p22phox的mRNA和蛋白表達(dá)，刺激GMCs中ROS、TGF-β1和Col IV生成[20]。使用KAE以及沉默NOX4和p22phox，可以抑制OS和ECM積累，表明KAE發(fā)揮抗氧化作用是通過NOX4/p22phox途徑調(diào)控。

Sestrins家庭是由一組參與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性調(diào)節(jié)的壓力誘導(dǎo)蛋白組成，是抗氧化防御機(jī)制之一，具有兩種不同的生物學(xué)活性功能。首先，通過抑制ROS積累發(fā)揮抗氧化劑作用[7]，可能涉及抗氧化劑轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。其次，Sestrins通過激活A(yù)MPK或抑制Rag GTPases充當(dāng)mTORC1的反饋抑制劑[5]。AMPK是一種重要的代謝傳感器，在幾乎所有真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)[4]。研究表明，在HG條件下，Sestrin2和AMPK激活抑制GMCs中NOX4誘導(dǎo)的ROS積累[6]。AMPK磷酸化抑制人系膜細(xì)胞中ROS產(chǎn)生和ECM積累[14]。此外，AMPK磷酸化可以抑制TGF-β1在尿液中積累，抑制系膜基質(zhì)擴(kuò)張，減少DN小鼠模型中膠原沉積[21]。越來越多研究認(rèn)為AMPK與DN中NOX活性密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)KAE通過上調(diào)AMPK顯著抑制HG誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、ROS產(chǎn)生、NOX4、TGF-β1和Col IV表達(dá)。此外，compound C逆轉(zhuǎn)KAE對(duì)HG誘導(dǎo)的OS保護(hù)作用和ECM在GMCs中沉積。

綜上所述，本研究證明KAE通過調(diào)節(jié)AMPK/NOX4通路，對(duì)HG誘導(dǎo)的GMCs OS和ECM積累發(fā)揮保護(hù)作用，期望KAE可以作為防治DN的潛在候選藥物或先導(dǎo)化合物。