天麻素聯(lián)合異鉤藤堿通過(guò)線粒體途徑抑制MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡

李曉明，榮 華，潘思文，董妙先

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006

帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)是一種伴隨運(yùn)動(dòng)缺陷癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。90%以上的PD為散在性發(fā)作，約10%的PD為家族性遺傳發(fā)作。PD主要病理生化特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元漸進(jìn)性缺失，導(dǎo)致紋狀體多巴胺水平降低[1]，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropridine，MPTP)具有線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制作用，進(jìn)入體內(nèi)后生成活性1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)，MPP+在線粒體內(nèi)產(chǎn)生的自由基引起線粒體損傷[2]。線粒體介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡是PD重要病理機(jī)制[3]。在PD患者死亡后的腦組織中，一些瀕死的神經(jīng)元表現(xiàn)出凋亡的形態(tài)學(xué)特征[4]。針對(duì)線粒體損傷而開展的PD治療研究受到基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究者的廣泛關(guān)注。自1967年Cotzias等將左旋多巴首次成功應(yīng)用于PD臨床治療以來(lái)，多巴胺替代治療一直是治療PD的主要手段，但這種療法僅能在一定程度上緩解臨床癥狀，不能從根本上延緩疾病進(jìn)程[5]。中醫(yī)藥治療PD具有療效穩(wěn)定持久，毒副作用較小的優(yōu)勢(shì)。隨著對(duì)PD發(fā)生、發(fā)展凋亡機(jī)制的研究深入，中藥有效成分聯(lián)合在PD神經(jīng)保護(hù)治療中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)[6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，天麻素和異鉤藤堿均在體內(nèi)體外帕金森病模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7，8]，PD是遺傳和環(huán)境因素引起的復(fù)雜疾病，基于多靶點(diǎn)的聯(lián)合用藥治療PD越來(lái)越受到關(guān)注。本研究旨在探討天麻素和異鉤藤堿聯(lián)合應(yīng)用保護(hù)MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Safire 2型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；Stratagene Mx3005P Real-time PCR儀(Agilent公司)；JY-ZY5電泳槽和JY200C電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；Smart ChemiTMImage Analysis System(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；HL-2000分子雜交箱(美國(guó)UVP公司)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BioTek公司)。

1.1.2 細(xì)胞株和藥品

PC12細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；MPP+iodide(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：035M4782V)；異鉤藤堿(南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)：JZ18102901)；天麻素(南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)：JZ18061402)；氯化鋰(Lithium chloride,LiCl；Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：MKBV0497V)；LY294002(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：092M4616V)；PD98059(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：MKBR5598V)。

1.1.3 試劑和引物

Caspase-Glo?3/7Assay(Promega公司，批號(hào)：0000126888)；Quantikine?rat/mouse cytochromecassay kit(R&D systems公司，批號(hào)：P131219)；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(挧圣生物，批號(hào)：J6901150)；高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(康為世紀(jì)公司，批號(hào)：022819190619)；二抗(康為世紀(jì)公司，批號(hào)：40420)；Anti-Akt antibody(Santa Cruz公司，批號(hào)D0219)；Anti-p-Akt antibody(Santa Cruz公司，批號(hào)：J0721)；Cell Titer 96?AQueous Non-Radioactive cell Proliferation Assay(Promega公司，批號(hào)：0000312867)；Cell Death Detection ELISAPLUSAssay Kit(Roche公司，批號(hào)：29876600)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)/NADH Quantification Kit(BioVision公司，批號(hào)：9G020337)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

PC12細(xì)胞用含10%小牛血清及1%青霉素- 鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，每2～3天更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞密度生長(zhǎng)融合達(dá)70%～80%時(shí)傳代。加入250 μM MPP+預(yù)處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞1 h后，加入天麻素(1 μM)和/或異鉤藤堿(0.3 μM)共同孵育24 h后，收集細(xì)胞。為了分析細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB/Akt)和糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)信號(hào)通路的作用，在MPP+損傷之前，PC12細(xì)胞用PD98059、LY294002或/和氯化鋰預(yù)處理30 min。

1.2.2 caspase-3/7活性檢測(cè)

按Caspase-Glo?3/7 Assay試劑盒說(shuō)明書，PC12細(xì)胞加入Caspase-Glo?試劑，在室溫孵育60 min后，酶標(biāo)儀測(cè)量熒光值。通過(guò)計(jì)算處理組熒光值/對(duì)照組熒光值來(lái)確定caspase-3/7的活性。

1.2.3 JC-1染色法檢測(cè)線粒體膜電位

按JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，PC12細(xì)胞加入JC-1染色工作液，37 ℃孵育20 min，JC-1染色緩沖液洗滌，細(xì)胞培養(yǎng)液重懸PC12細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)JC-1線粒體膜電位。

1.2.4 細(xì)胞色素C(cytochromec，Cyt-c)含量檢測(cè)

按Quantikine?rat/mouse cytochromecassay kit試劑盒說(shuō)明書，收集PC12細(xì)胞上清液，加Cyt-c結(jié)合物，加洗液，加底物溶液，加停止液。在450 nm處酶標(biāo)儀測(cè)定光密度。用標(biāo)準(zhǔn)物濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清中Cyt-c含量。

1.2.5 免疫印跡檢測(cè)Akt磷酸化水平

采用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提取PC12細(xì)胞蛋白質(zhì)，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，濕法轉(zhuǎn)膜，TBST封閉液(含5%脫脂牛奶)室溫封閉PVDF膜2 h。加入p-Akt一抗雜交液4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加相應(yīng)二抗37 ℃孵育2 h。加入超敏化學(xué)發(fā)光液發(fā)光，X光片曝光。圖像分析軟件AlphaEaseFCTM(瑞士Alpha Innotech公司)分析印跡條帶的積分光密度，并用Akt1積分光密度值進(jìn)行歸一化。

1.2.6 細(xì)胞增殖分析

按CellTiter 96?AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞增殖活性，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值，細(xì)胞存活率=處理組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

按Cell Death Detection ELISAPLUSAssay Kit試劑盒說(shuō)明書，裂解PC12細(xì)胞，離心取上清液。加入檢測(cè)試劑孵育，加入終止液，405 nm處測(cè)定OD值。

1.2.8 分光光度法測(cè)定細(xì)胞總NAD和NADH含量

按照NAD+/NADH Quantification Kit說(shuō)明書用操作，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總NAD和NADH含量。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 天麻素、異鉤藤堿單用及聯(lián)用對(duì)PC12細(xì)胞凋亡和caspase-3/7活性的影響

ELISA結(jié)果顯示(如圖1A),與空白對(duì)照組比較，MPP+組PC12細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.05)；與MPP+組比較，天麻素組和異鉤藤堿組PC12細(xì)胞凋亡顯著減少(均P<0.05)。與天麻素或異鉤藤堿單獨(dú)處理組比較，天麻素聯(lián)合異鉤藤堿組細(xì)胞凋亡顯著減少(均P<0.05)。如圖1B所示，與空白對(duì)照組比較，MPP+組caspase-3/7活性顯著增加(P<0.05)；與MPP+組比較，天麻素組和異鉤藤堿組caspase-3/7活性顯著減少(均P<0.05)。而天麻素聯(lián)合異鉤藤堿組caspase-3/7活性較二者單獨(dú)處理組顯著降低(均P<0.05)。天麻素聯(lián)合異鉤藤堿對(duì)PC12細(xì)胞凋亡和caspase-3/7活性的抑制效應(yīng)可部分被PD98059和LY294002或LiCl單獨(dú)預(yù)處理逆轉(zhuǎn)，而PD98059、LY294002和LiCl聯(lián)合預(yù)處理則完全逆轉(zhuǎn)這些藥理效應(yīng)。

圖1 天麻素聯(lián)用異鉤藤堿對(duì)MPP+處理的PC12細(xì)胞凋亡(A)和caspase-3/7活性(B)的影響Fig.1 Effects of gastrodin and/or isorhynchophylline on apoptosis (A) and caspase-3/7 activity (B) in MPP+-treated PC12 cells注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與MPP+組比較，§P<0.05；與天麻素或異鉤藤堿單用組比較，§P<0.05；GAS：天麻素；IRN：異鉤藤堿，下同。Note:*P<0.05 vs control;§P<0.05 vs MPP+;§P<0.05 vs GAS or IRN alone;GAS:Gastrodin;IRN:Isorhynchophylline.

2.2 天麻素聯(lián)用異鉤藤堿對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖的影響

MTS分析結(jié)果顯示(見圖2)：與空白對(duì)照組比較，MPP+組細(xì)胞增殖活性顯著減少(P<0.05)；與MPP+組比較，天麻素聯(lián)合異鉤藤堿組細(xì)胞增殖活性顯著增加(均P<0.05)，且天麻素聯(lián)合異鉤藤堿對(duì)細(xì)胞增殖活性的提高作用可部分被PD98059或LY294002單獨(dú)預(yù)處理逆轉(zhuǎn)，DPI則完全逆轉(zhuǎn)天麻素聯(lián)合異鉤藤堿對(duì)細(xì)胞增殖活性的提高作用。

圖2 天麻素聯(lián)合異鉤藤堿對(duì)MPP+處理的PC12細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of gastrodin combined with isorhynchophylline on cells proliferation in MPP+-treated PC12 cells

2.3 天麻素、異鉤藤堿單用及聯(lián)用對(duì)MPP+處理PC12細(xì)胞線粒體跨膜電位和Cyt-c釋放的影響

如圖3所示，與空白對(duì)照組比較，MPP+組PC12細(xì)胞JC-1紅/綠比值顯著降低(P<0.05)，而細(xì)胞培養(yǎng)上清液中cyct-C含量顯著增加(P<0.05)。與MPP+組比較，天麻素組JC-1紅/綠比值顯著增加(P<0.05)，而細(xì)胞培養(yǎng)上清液中cyct-C含量顯著減少(P<0.05)。異鉤藤堿組JC-1紅/綠比值顯著增加(P<0.05)，而細(xì)胞培養(yǎng)上清液中cyct-C含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。天麻素聯(lián)合異鉤藤堿對(duì)JC-1紅/綠比值的增加效應(yīng)和對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中cyct-C含量的降低效應(yīng)明顯強(qiáng)于二者單獨(dú)處理組(均P<0.05)。天麻素聯(lián)合異鉤藤堿對(duì)JC-1紅/綠比值的增加效應(yīng)和對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中cyct-C含量的降低效應(yīng)可部分被PD98059、LY294002或LiCl單獨(dú)預(yù)處理逆轉(zhuǎn)，而PD98059、LY294002和LiCl聯(lián)合預(yù)處理則完全逆轉(zhuǎn)這些藥理效應(yīng)。

圖3 天麻素、異鉤藤堿單用及聯(lián)用對(duì)JC-1紅/綠比值(A)和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中cyct-C含量(B)的影響Fig.3 Effects of gastrodin and/or isorhynchophylline on JC-1 aggregates/JC-1 monomers ratio (A) and supernatant cytochrome c concentration (B) in MPP+-treated PC12 cells

2.4 天麻素聯(lián)合異鉤藤堿對(duì)NAD+含量和NAD+/NADH比值的影響

如圖4A和B所示，與空白對(duì)照組比較，MPP+組NAD+含量和NAD+/NADH比值顯著降低(均P<0.05)；與MPP+組比較，天麻素聯(lián)合異鉤藤堿組NAD+含量和NAD+/NADH比值顯著增加。天麻素聯(lián)合異鉤藤堿對(duì)NAD+含量和NAD+/NADH比值的增加效應(yīng)可部分被PD98059、LY294002或LiCl單獨(dú)預(yù)處理逆轉(zhuǎn)，而PD98059、LY294002和LiCl聯(lián)合預(yù)處理則完全逆轉(zhuǎn)天麻素聯(lián)合異鉤藤堿對(duì)NAD+含量和NAD+/NADH比值的增加效應(yīng)。

圖4 天麻素聯(lián)合異鉤藤堿對(duì)MPP+處理的PC12細(xì)胞NAD+含量(A)和NAD+/NADH比值(B)的影響Fig.4 Effects of gastrodin combined with isorhynchophylline on NAD+ concentration (A) and NAD+/NADH ratio(B) in MPP+-treated PC12 cells

2.5 天麻素、異鉤藤堿單用及聯(lián)用對(duì)MPP+處理PC12細(xì)胞Akt磷酸化水平的影響

我們以前研究發(fā)現(xiàn)，天麻素增加了MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平[8]，異鉤藤堿減少了GSK-3β磷酸化水平[7]，Akt是調(diào)控GSK-3β磷酸化的關(guān)鍵上游信號(hào)分子[9]。因此，我們進(jìn)一步觀察天麻素、異鉤藤堿單用及聯(lián)用對(duì)MPP+處理PC12細(xì)胞Akt磷酸化水平的影響。Western blot結(jié)果顯示(如圖5A和B)：與空白對(duì)照組比較，MPP+組Akt磷酸化水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與MPP+組比較，天麻素單獨(dú)組Akt磷酸化水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)，異鉤藤堿單獨(dú)組和天麻素聯(lián)合異鉤藤堿組PC12細(xì)胞Akt磷酸化水平均顯著增加(均P<0.05)。而天麻素聯(lián)合異鉤藤堿組PC12細(xì)胞Akt磷酸化水平與異鉤藤堿單獨(dú)組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。表明天麻素聯(lián)合異鉤藤堿活化Akt的藥物組分是異鉤藤堿，而不是天麻素。

圖5 天麻素或/和異鉤藤堿對(duì)MPP+處理的PC12細(xì)胞Akt磷酸化的影響Fig.5 Effects of gastrodin and/or isorhynchophylline on Akt phosphorylation in MPP+-treated PC12 cells

3 討論與結(jié)論

以改善運(yùn)動(dòng)癥狀為核心的多巴胺替代治療目前仍是PD治療的基石，但受到遠(yuǎn)期療效和并發(fā)癥的制約[10]。 “神經(jīng)保護(hù)”已成為延緩PD進(jìn)展的重要治療策略[11]。PD是由多種因素導(dǎo)致的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜疾病，而聯(lián)合用藥誘導(dǎo)的生物靶標(biāo)之間的協(xié)同作用可能是改善PD復(fù)雜病理的有效手段。中藥復(fù)方天麻鉤藤飲能明顯改善PD患者癥狀，我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，天麻素和異鉤藤堿分別是天麻和鉤藤的抗PD的主要活性成分[9]。

在PD患者腦中已經(jīng)檢測(cè)到許多凋亡的神經(jīng)元和氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的重要因素[12]，而多巴胺能神經(jīng)元過(guò)度凋亡在PD的進(jìn)展中都起關(guān)鍵作用，PD的各種病因最終可經(jīng)細(xì)胞凋亡這一共同通路導(dǎo)致PD發(fā)病[13]。MPTP通過(guò)腦血屏障被膠質(zhì)細(xì)胞攝取氧化后生成MPP+，中腦多巴胺能神經(jīng)元通過(guò)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取MPP+后，在線粒體內(nèi)抑制線粒體復(fù)合物I活性，導(dǎo)致中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡，MPTP/MPP+是誘導(dǎo)PD模型的有效藥物[14]。本研究顯示，MPP+增加PC12細(xì)胞凋亡和caspase-3/7活性，天麻素或者異鉤藤堿單獨(dú)均能顯著抑制PC12細(xì)胞凋亡和caspase-3/7活性，天麻素和異鉤藤堿聯(lián)用的抑制作用明顯強(qiáng)于二者單獨(dú)抑制作用。

近年來(lái)隨著對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)PD的進(jìn)行性發(fā)展與線粒體密切相關(guān)[15]。線粒體功能障礙導(dǎo)致線粒體外膜通透性增加，線粒體內(nèi)Cyt-c釋放到細(xì)胞質(zhì)，并與凋亡蛋白酶激活因子1結(jié)合形成多聚體，激活caspase-9和caspase-3，導(dǎo)致靜息狀態(tài)的核酸內(nèi)切酶活化，最終引起DNA斷裂和細(xì)胞凋亡[16]，而多巴胺能神經(jīng)元凋亡可導(dǎo)致PD的發(fā)生。本研究顯示，MPP+降低PC12細(xì)胞JC-1紅/綠比值，增加細(xì)胞培養(yǎng)上清液cyct-C含量，而天麻素和異鉤藤堿聯(lián)合應(yīng)用對(duì)JC-1紅/綠比值的增加和細(xì)胞培養(yǎng)上清液cyct-C降低的效應(yīng)明顯強(qiáng)于二者單獨(dú)應(yīng)用，提示天麻素和異鉤藤堿聯(lián)合應(yīng)用的神經(jīng)保護(hù)作用與改善線粒體功能障礙有關(guān)。ERK1/2、Akt和GSK-3β信號(hào)通路在天麻素和異鉤藤堿聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用。

煙酸進(jìn)入體內(nèi)后可以在酶的作用下生成NAD+和NADP+。NAD+是呼吸鏈的重要組成之一，參與生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，提高細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH的含量可緩解神經(jīng)退行性疾病[17]。Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的促存活信號(hào)通路，Akt磷酸化水平增加可對(duì)抗神經(jīng)元凋亡并促進(jìn)神經(jīng)元存活，Akt已被證實(shí)參與PD發(fā)病過(guò)程[18]。有研究表明，PD患者黑質(zhì)致密部Akt水平降低[19]。本研究顯示，MPP+降低PC12細(xì)胞NAD+含量和NAD+/NADH比值，而天麻素和異鉤藤堿聯(lián)合應(yīng)用提高了PC12細(xì)胞NAD+含量和NAD+/NADH比值。異鉤藤堿單獨(dú)或與天麻素聯(lián)合均增加了PC12細(xì)胞Akt磷酸化水平。Akt在天麻素和異鉤藤堿聯(lián)合應(yīng)用提高細(xì)胞NAD+含量和NAD+/NADH比值中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究明確了天麻素與異鉤藤堿聯(lián)用具有協(xié)同作用，可以更好的抑制PD相關(guān)的神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能與改善線粒體功能有關(guān)，但是聯(lián)用體外協(xié)同神經(jīng)保護(hù)作用需要在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以及其協(xié)同神經(jīng)保護(hù)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。