近紅外自體熒光成像對(duì)術(shù)中甲狀旁腺實(shí)時(shí)識(shí)別的初步研究

張穎超 陳承坤 伍波 于凡 鄧先兆 郭伯敏 康杰 樊友本

在過去的30年里，全世界甲狀腺癌(thyroid cancer,TC)的發(fā)病率顯著增長(zhǎng)[1]。據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)，甲狀腺癌新發(fā)病例56.7萬，占女性腫瘤負(fù)荷的5.1%[2]。在甲狀腺手術(shù)量激增的同時(shí)，術(shù)中甲狀旁腺(parathyroid gland,PG)誤切或血運(yùn)損傷這一最常見且較嚴(yán)重的手術(shù)并發(fā)癥難題亟待解決。它導(dǎo)致了甲狀旁腺功能減退(hypoparathyroidism,HypoPT)，主要特征是低鈣血癥，其中暫時(shí)性HypoPT的發(fā)生率為6.9%～49%，永久性為0.4%～33%[3]，需長(zhǎng)期口服鈣劑或活性維生素D，劑量控制不佳則造成高鈣或低鈣血癥，遠(yuǎn)期則可能出現(xiàn)異位鈣化或腎結(jié)石等[4]。在甲狀腺全切術(shù)中，保留所有的PGs是一個(gè)非常重要的手術(shù)目標(biāo)，但由于甲狀腺疾病的程度、PG的數(shù)目特別是解剖位置和血供的差異，很難全部發(fā)現(xiàn)和完整保留。盡管手術(shù)技巧、納米炭負(fù)顯影、亞甲藍(lán)染色、快速冰凍病理、自體移植等各個(gè)方面均已有相當(dāng)廣泛的的研究，但最佳的PG保護(hù)方法仍沒有定論，現(xiàn)階段主要依靠手術(shù)醫(yī)生的肉眼辨識(shí)，要求醫(yī)師有相當(dāng)豐富的專業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)累積。近期研究發(fā)現(xiàn)，PG組織暴露于近紅外光下表現(xiàn)出增強(qiáng)的自體熒光(autofluorescence,AF)，文獻(xiàn)報(bào)道識(shí)別率可達(dá)到90%以上[5-6]，無需注射造影劑，客觀且直觀，檢測(cè)到的腺體數(shù)量增加到3.5枚(肉眼識(shí)別2.6枚)[7]。本研究擬初步探索近紅外自體熒光(near-infrared autofluorescence imaging,NIRAF)成像對(duì)術(shù)中PG實(shí)時(shí)識(shí)別的臨床效果。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2020年6～8月在我院甲狀腺外科行甲狀腺手術(shù)的病人59例，其中男性21例，女性38例。年齡22～80歲，平均年齡(53.1±13.6)歲。雙側(cè)甲狀腺手術(shù)20例，單側(cè)39例。病理診斷為甲狀腺乳頭狀癌46例，嗜酸細(xì)胞癌2例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫8例，甲狀腺腺瘤2例，濾泡性腫瘤1例。病人既往均無頸部外傷及放療病史。手術(shù)由同一治療組醫(yī)師完成，手術(shù)醫(yī)師均具有10年以上甲狀腺專科手術(shù)經(jīng)歷。根據(jù)術(shù)前專家超聲/穿刺及術(shù)中冰凍切片，對(duì)惡性腫瘤病人行中央?yún)^(qū)清掃，部分病人附加側(cè)區(qū)清掃。

二、方法

1.甲狀腺手術(shù)：均采用開放術(shù)式，取頸部正中切口，切開皮膚后，常規(guī)游離皮瓣，切開頸白線直達(dá)甲狀腺固有被膜，上下鈍性分離，暴露甲狀腺。超聲刀離斷甲狀腺峽部，“脫帽法”處理甲狀腺上極。牽引甲狀腺，暴露甲狀腺背側(cè)。然后緊貼甲狀腺固有被膜精細(xì)化解剖PG并保留其血供。甲狀腺及氣管旁淋巴結(jié)清掃后，觀察甲狀腺床。手術(shù)標(biāo)本送檢前再次檢查是否有PG誤切。

2.PG辨識(shí)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：默認(rèn)PG分別位于甲狀腺背側(cè)的左上、左下、右上、右下，且各有一個(gè)，即理論上雙側(cè)甲狀腺手術(shù)應(yīng)找到4個(gè)PG，單側(cè)者則應(yīng)為2個(gè)。故本研究將檢出PG總數(shù)158枚。先進(jìn)行PG肉眼辨識(shí)，由兩名高年資手術(shù)醫(yī)師同時(shí)確認(rèn)方為陽性；再進(jìn)行NIRAF辨識(shí)，除檢測(cè)到AF外，還需符合PG常見大小、形態(tài)等相關(guān)特點(diǎn)才可判斷為陽性。當(dāng)肉眼和NIRAF判別情況不一致時(shí)，對(duì)可疑組織再采用免疫膠體金(佰奧達(dá)PTH免疫檢測(cè)儀及檢測(cè)試劑)驗(yàn)證是否PG。

3.NIRAF成像方式與探測(cè)時(shí)機(jī)：(1)NIRAF成像設(shè)備：設(shè)備整體觀見圖1。打開設(shè)備開關(guān)，進(jìn)入控制界面，探頭與設(shè)備主體進(jìn)行無線或有線連接。關(guān)閉無影燈(僅亮手術(shù)室環(huán)境燈)，長(zhǎng)按調(diào)節(jié)按鈕，打開激發(fā)光，探測(cè)端垂直于手術(shù)區(qū)，距離10～15 cm左右，在顯示器上進(jìn)行動(dòng)態(tài)顯像。術(shù)野呈灰色，PG自發(fā)熒光呈現(xiàn)亮色或白色。(2)PG尋找及識(shí)別時(shí)間節(jié)點(diǎn)：分別在甲狀腺被膜解剖前及標(biāo)本切除后進(jìn)行兩次識(shí)別，必要時(shí)據(jù)手術(shù)醫(yī)師的需求可增加成像次數(shù)。若離體標(biāo)本檢出PG，經(jīng)免疫膠體金確認(rèn)后則行同側(cè)胸鎖乳突肌自體移植。

A:整體觀;B:激光探頭(自上而下依次為探測(cè)端、激發(fā)光調(diào)節(jié)按鈕、握持端)

4.免疫膠體金快速檢測(cè)PTH流程:用含有0.1 ml生理鹽水的1ml注射器穿刺可疑PG組織3～5次，1ml生理鹽水洗滌注射器及針頭3～5次，加入試劑進(jìn)樣孔，10 min后將試劑條插入機(jī)器檢測(cè)孔，讀取結(jié)果。PTH >63.99 pg/ml，即判定為PG組織。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1.PG總體識(shí)別結(jié)果見圖2。59例病人，共計(jì)切除79葉甲狀腺，將檢出上位、下位、總PG分別為79、79、158枚，實(shí)際分別檢出74、70、144枚，PG檢出率分別為93.6%、88.6%、91.1%。兩種方法均未辨識(shí)到的PG有14枚。

圖2 PG組織辨識(shí)流程

2.兩種方法檢出率的比較見表1。NIRAF成像與肉眼對(duì)于上位PG的檢出率分別為93.7%(74/79)、88.6%(70/79)，下位PG分別為87.3%(69/79)、84.8%(67/79)，總體的PG檢出率分別為90.5%(143/158)、86.7%(137/158)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 59例病人的PG檢出情況及兩種方法檢出率比較

3.兩種方法準(zhǔn)確率的比較見表2。NIRAF成像與肉眼對(duì)于PG識(shí)別準(zhǔn)確率分別為98.6%(143/145)、100%(137/137)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 兩種方法準(zhǔn)確率比較(Fisher確切概率法)

4.PG誤切與自體移植的情況：本研究中6例病人進(jìn)行了PG的同側(cè)胸鎖乳突肌自體移植，同時(shí)進(jìn)行右側(cè)上位及下位PG移植1例，進(jìn)行右側(cè)下位PG移植3例，右側(cè)上位、左側(cè)下位PG移植各1例。PG總體移植率4.4%(7/158)。移植的原因：1枚PG術(shù)中全程未檢出，導(dǎo)致誤切，離體組織中僅由NIRAF辨識(shí)到。6枚PG術(shù)中找到，其中4枚因操作或腫瘤/PG位置特殊導(dǎo)致PG血供離斷，主動(dòng)自體移植；2枚則因術(shù)中解剖變化，PG保護(hù)不佳致手術(shù)誤切，后移植。

5.NIRAF成像與肉眼PG識(shí)別差異性與一致性比較見表3。就甲狀腺被膜解剖前這一重要階段而言，配對(duì)χ2檢驗(yàn)，NIRAF的檢出率為55.7%(88/158)，肉眼為31.6%(50/158)，NIRAF檢出率顯著高于肉眼(P<0.05)；Kappa=0.514，P<0.05，Kappa在0.41～0.6之間，一致性中等。最終識(shí)別結(jié)果，配對(duì)χ2檢驗(yàn)提示兩種方法的識(shí)別結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Kappa=0.750，P<0.05，Kappa在0.61～0.8之間，有較高度的一致性。

表3 兩種方法識(shí)別差異性與一致性比較(枚)

6.NIRAF成像的PG位置預(yù)見性及優(yōu)越性見表3。甲狀腺被膜解剖前，NIRAF檢出率為55.7%(88/158)，肉眼為31.6%(50/158)，有38枚(24.1%，38/158)PG為NIRAF先于肉眼提前發(fā)現(xiàn)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NIRAF成像可在術(shù)中進(jìn)行PG的實(shí)時(shí)識(shí)別(圖3)，而不受解剖階段的限制。同時(shí)，對(duì)于與胸腺組織、脂肪組織混雜或難以區(qū)分的PG，或組織破碎、解剖辨識(shí)困難的離體組織，NIRAF成像更為直觀且客觀(圖3G～J)。

討論

研究發(fā)現(xiàn)，PG與背景組織平均熒光強(qiáng)度的比率為4.78，且在所有情況下均大于1[6]，故PG在近紅外光下表現(xiàn)為低熒光背景上的高熒光點(diǎn)。NIRAF成像的實(shí)際益處，需要回答兩個(gè)問題：術(shù)中是否通過熒光對(duì)比提高了外科醫(yī)生識(shí)別PG的能力，降低誤切和自體移植率；是否保護(hù)了PG功能，降低甲狀腺全切術(shù)后低鈣血癥的發(fā)生率。

A：甲狀腺被膜解剖前-室燈下術(shù)野；B：甲狀腺被膜解剖前-NIRAF成像；C：甲狀腺被膜解剖后-室燈下術(shù)野；D：甲狀腺被膜解剖后-NIRAF成像；E：甲狀腺床-室燈下術(shù)野；F：甲狀腺床-NIRAF成像；G：離體標(biāo)本-室燈下術(shù)野；H：離體標(biāo)本-NIRAF成像；I：胸甲韌帶旁腺室燈下術(shù)野；J：胸甲韌帶旁腺NIRAF成像

一組前瞻性研究報(bào)道，173例甲狀腺術(shù)中發(fā)現(xiàn)98.6%(496/503)的PG存在AF，137例甲狀旁腺術(shù)中發(fā)現(xiàn)AF的比例為96.4%(451/468)。550例標(biāo)本經(jīng)病理驗(yàn)證，NIRAF預(yù)測(cè)PG的敏感度、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為98.5%、97.2%、95.1%和99.1%，總體準(zhǔn)確性為97.6%(537/550)[5]。其他多中心研究也發(fā)現(xiàn)NIRAF檢測(cè)PG中AF的總體靈敏度為98%(584/594)[8]。其準(zhǔn)確性甚至可達(dá)到100%[6]。259張疑似PG組織的NIRAF圖像均經(jīng)肉眼檢查證實(shí)[9]。本研究中，NIRAF成像的PG檢出率為90.5%，準(zhǔn)確率為98.6%，NIRAF與肉眼識(shí)別結(jié)果的一致性較高。這可能是由于本研究嚴(yán)格規(guī)定以PG大小、形狀、常見位置特點(diǎn)為前提判斷AF(+)，減少了假陽性率，然而很可能降低了檢出率；肉眼識(shí)別PG的準(zhǔn)確性達(dá)到了100%，一方面得益于三級(jí)醫(yī)院甲狀腺中心手術(shù)醫(yī)師的技能與經(jīng)驗(yàn)豐富，另一方面是我們規(guī)定了兩名高年資手術(shù)醫(yī)師同時(shí)確認(rèn)PG才判定陽性的前提。但值得肯定的是NIRAF辨識(shí)PG的良好可行性，不遜于甚至優(yōu)于肉眼識(shí)別的能力，可達(dá)到甲狀腺?？苾?yōu)秀手術(shù)醫(yī)生肉眼識(shí)別的水平，且它的應(yīng)用將外科醫(yī)師術(shù)中識(shí)別PG的信心從4.1分提高到4.4分(0～5分)[10]。故預(yù)計(jì)將對(duì)經(jīng)驗(yàn)相對(duì)不足的?？粕踔练菍？漆t(yī)師產(chǎn)生更好的輔助效果，提高辨識(shí)率，縮短學(xué)習(xí)曲線，實(shí)現(xiàn)更好的PG原位保留。

據(jù)報(bào)道，32%(162/503)的PG在外科醫(yī)生被膜解剖前，僅被NIRAF識(shí)別，而未被肉眼識(shí)別[5]。甲旁亢術(shù)中20%(12/59)的病人使用術(shù)中NIRAF成像幫助識(shí)別了肉眼未檢出的PG[10]?？傮w而言，手術(shù)全過程中77%(245/320)的PG可在肉眼識(shí)別之前先由NIRAF發(fā)現(xiàn)[9]。由于AF通過上覆組織的穿透性只有幾毫米，在甲狀腺被膜解剖前可能無法檢測(cè)到來自所有PG的AF信號(hào)，但隨著解剖的深入，暴露愈加充分，這些PG隨后被檢測(cè)到。本組病例在外科醫(yī)生被膜解剖前，通過AF可以識(shí)別55.7%(88/158)的PG，最終識(shí)別率達(dá)90.5%(143/158)。當(dāng)被脂肪和結(jié)締組織覆蓋時(shí)，可能影響干擾肉眼識(shí)別，采用熒光輔助早期識(shí)別，目的是盡早判別PG大致方位以便于尋找保護(hù)其潛在的血供，盡可能避免無意識(shí)的PG損傷或血流離斷，防患于未然，故提前預(yù)判PG位置可能比最終識(shí)別的PG數(shù)目更重要。

PG誤切、血運(yùn)損傷或自體移植可導(dǎo)致術(shù)后低鈣血癥[3，11]，甲狀腺手術(shù)中發(fā)生PG誤切的比例為5.2%～21.6%[12]，暫時(shí)性低鈣血癥的發(fā)生率為5%～35%，永久性低鈣血癥的發(fā)生率為0.5%～4.4%[13-14]。有前瞻性多中心RCT研究表明，241例甲狀腺全切術(shù)中應(yīng)用NIRAF，將術(shù)后暫時(shí)性低鈣發(fā)生率從22%降到9%，而PG自體移植和誤切率分別從13.3%降到3.3%和11.7%降到2.5%[15]。其他對(duì)照研究表明，NIRAF組PG誤切、移植率和術(shù)后低鈣血癥發(fā)生率分別為1.1%，2.1%和5.3%，而肉眼識(shí)別組分別為7.2%，15%和20.9%[9]。在5%(7/137)的病人中，NIRAF在甲狀腺手術(shù)標(biāo)本中鑒別到被誤切的PG，從而挽救性進(jìn)行了PG自體移植[5]。本研究中PG總體移植率4.4%(7/158)，其中2例類似，為手術(shù)醫(yī)師肉眼未察覺的誤切；另有1枚PG術(shù)中全程肉眼和熒光均未檢出，在手術(shù)標(biāo)本中由NIRAF意外發(fā)現(xiàn)。故對(duì)于缺乏解剖標(biāo)志參考、組織成分混雜的離體組織，NIRAF可以清晰客觀地展示是否存在AF，對(duì)誤切或甲狀腺床未找到的PG進(jìn)行“撿漏”，指導(dǎo)自體移植，作為PG功能保護(hù)的“最后一道防線”?？傊?，應(yīng)用NIRAF識(shí)別PG，提高了識(shí)別率及原位保留率，并降低自體移植率及術(shù)后低鈣血癥發(fā)生率。

A：離體標(biāo)本-離體組織正面，NIRAF見自體熒光(藍(lán)色箭頭均指示甲狀旁腺)；B：離體標(biāo)本-離體組織反面，NIRAF熒光不明顯；C：甲狀腺床-室燈下術(shù)野；D：甲狀腺床-NIRAF成像(綠色箭頭均指示線結(jié))； E：甲狀腺床-室燈下術(shù)野；F：甲狀腺床-NIRAF成像(黃色箭頭均指示線結(jié))

有研究發(fā)現(xiàn)，年齡、性別、BMI、PG大小和PG位置(上/下)與AF表現(xiàn)無相關(guān)性，甚至越小的PG越易被肉眼忽略，而被NIRAF捕捉到[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)，NIRAF成像對(duì)于上位、下位PG的檢出無明顯差異。此外，探測(cè)到了手術(shù)區(qū)域的非特異性熒光顯影：在離體組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，同一標(biāo)本正反兩面成像效果不同(圖4A、B)，術(shù)中多次發(fā)現(xiàn)線結(jié)有明顯的熒光成像(圖4C、D)；甲狀旁腺區(qū)域呈現(xiàn)片狀熒光顯影，組織指向性不強(qiáng)(圖4E、F)；皮膚毛孔、手術(shù)器械存在反光現(xiàn)象。這可能與介質(zhì)反光、PG包膜不完整有關(guān)，造成假陽性。被覆組織的厚度也影響了NIRAF成像效果：部分病例甲狀腺腺體本身或腫瘤較大，離斷上極后，甲狀腺背側(cè)無法完全暴露，可能影響AF的充分探測(cè)，造成假陰性。可以借助拉鉤向?qū)?cè)拉開腺體，側(cè)向探測(cè)，旋轉(zhuǎn)手術(shù)床以升高便于探測(cè)甲狀腺床。故NIRAF(+)的定義應(yīng)該為“AF信號(hào)比周圍組織亮，并且符合PG的典型大小和形狀標(biāo)準(zhǔn)”。因此，雖然在甲狀腺和其他頸部組織中可檢測(cè)到AF，但由于信號(hào)的亮度、形狀和大小的不匹配，很少會(huì)與PG的AF混淆。對(duì)于大多數(shù)腺瘤而言，熒光也是均勻的，少數(shù)情況出現(xiàn)不均勻的斑片狀，可能與病理表現(xiàn)的PG組織硬化或部分退化有關(guān)[16]。

每次NIRAF的探測(cè)過程一般需耗時(shí)2～3分鐘，術(shù)中需進(jìn)行2～4次探查，且需關(guān)閉手術(shù)室燈光，理論上造成手術(shù)暫時(shí)中斷及手術(shù)時(shí)間輕微延長(zhǎng)，但既往報(bào)道表明，應(yīng)用NIRAF與常規(guī)手術(shù)的平均手術(shù)時(shí)間基本一致[9]，甚至可以節(jié)省手術(shù)時(shí)間。在傳統(tǒng)的甲狀腺手術(shù)中,外科醫(yī)生必須持續(xù)集中精力以避免損傷這些微小、難以區(qū)分的PG腺體,往往無意切除和自體移植反而會(huì)延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間。因此，NIRAF在提高外科醫(yī)生尋找辨認(rèn)PG信心、改善預(yù)后的同時(shí)，并不明顯造成手術(shù)時(shí)間延長(zhǎng)。

Paras等[17]首次報(bào)道了PG在近紅外光下的自熒光特性，國(guó)外研究多集中于臨床應(yīng)用及效果評(píng)估。基于組織含量的差異，猜測(cè)可能與鈣敏感受體或者維生素D受體有關(guān)。

國(guó)內(nèi)對(duì)于NIRAF的研究剛剛起步[18-20]。本研究病例數(shù)也相對(duì)偏少，未進(jìn)行雙側(cè)甲狀腺術(shù)后低鈣血癥的詳細(xì)分析。初步結(jié)果表明，NIRAF與肉眼識(shí)別有較好的一致性，肯定了其高靈敏度、無需造影劑、實(shí)時(shí)、客觀、直觀等優(yōu)越性，也在具體操作過程中對(duì)于拍攝角度、距離、陽性確認(rèn)方式等細(xì)節(jié)把握更加精準(zhǔn)，簡(jiǎn)化了操作流程，在此基礎(chǔ)上將進(jìn)行更為高質(zhì)量的RCT研究，充分發(fā)揮NIRAF對(duì)于PG的預(yù)判優(yōu)勢(shì)及進(jìn)行離體PG的挽救性移植，更好地輔助佐證肉眼定位PG腺體，明顯減少術(shù)后HypoPT。