姜辣素提取工藝及其對亞硝酸鹽的清除作用研究

李米 陳尚龍 張建萍 劉輝

摘要 采用纖維素酶法輔助提取姜辣素，確定姜辣素最優(yōu)提取工藝條件;將提取出的姜辣素用于清除亞硝酸鹽，確定最優(yōu)清除條件。結(jié)果表明，姜辣素最優(yōu)提取工藝條件為酶添加量1.4%、料液比1∶40、酶解溫度65? ℃、酶解時間85 min，在該條件下平均提取率為2.61%;姜辣素清除亞硝酸鹽的最優(yōu)反應(yīng)條件為添加5 μg/mL亞硝酸鈉溶液2.0 mL，姜辣素濃度15 mg/mL、反應(yīng)溫度80? ℃、反應(yīng)時間20 min、姜辣素添加量4.5 mL，在該條件下平均清除率為98.74%。

關(guān)鍵詞 生姜;姜辣素;提取率;亞硝酸鹽;清除率

中圖分類號 TS-201.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）13-0175-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.044

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Extraction Process of Gingerols and Its Nitrite Scavenging Effect

LI Mi，CHEN Shang long，ZHANG Jian ping et al

（Key Laboratory of Food Resources Development and Quality Safety in Jiangsu Province，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou，Jiangsu 221008）

Abstract The optimum extraction conditions of gingerol were determined by cellulase assisted extraction，and the optimal removal conditions were determined when gingerol was used for nitrite removal.The results showed that the optimum extraction conditions of gingerol were as follows： enzyme dosage 1.4%，solid liquid ratio 1∶40，the digestion temperature was 65? ℃ for 85 min.Under these conditions，the average extraction rate was 2.61%.The optimal reaction conditions were： adding 2.0? mL 5 μg/ mL sodium nitrite solution，15 mg /? mL gingerol concentration，80 ℃，20 min reaction time and 4.5 mL gingerol addition.Under these conditions，the average removal rate was 98.74%.

Key words Ginger;Gingerol;Extraction rate;Nitrite;Clearance rate

生姜具有藥食同源的特征，生姜在提升食物風(fēng)味的同時，還具有抗氧化、抗腫瘤等作用，對于治療嘔吐、感冒、咳嗽有顯著的效果[1-2]。根據(jù)劉丹等[3]的研究，構(gòu)成生姜姜辣素的物質(zhì)種類豐富，將姜酚、姜酮酚、姜烯酚等具有辛辣味的非揮發(fā)性成分統(tǒng)稱為姜辣素。其中，姜酚常常會因為失去水分而形成姜烯酚或者發(fā)生反應(yīng)生成姜酮[4-6]。由于生姜中的纖維素含量較高，因此在提取姜辣素時，如何突破生姜細(xì)胞壁纖維素結(jié)構(gòu)的制約是一大難題。酶法輔助提取可以溶解和軟化生姜的細(xì)胞壁，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得疏松，從而提高姜辣素的提取率。

亞硝酸鹽是一種常用的食品添加劑，適量的亞硝酸鹽可使食品的顏色和光澤得到長時間保持，延長儲存時間。但是過量的亞硝酸鹽導(dǎo)致人體缺氧，造成頭暈、昏迷，甚至喪失生命[7-8];亞硝酸鹽可以促進(jìn)蛋白質(zhì)羰基和二硫鍵的形成，進(jìn)而造成肉類蛋白質(zhì)的氧化[9-10];還可以生成亞硝胺，具有致癌作用[11]。亞硝酸鹽的清除方法有多種，其中蔥、姜、蒜等菜蔬的提取溶液對該物質(zhì)具有較強(qiáng)的清除作用。

目前，有關(guān)于采用酶法輔助提取姜辣素，研究其對亞硝酸鹽的清除作用鮮有報道。筆者以生姜為原料，采用纖維素酶法輔助提取姜辣素，研究最優(yōu)提取工藝及其清除亞硝酸鹽的最優(yōu)條件，以期為天然亞硝酸鹽清除劑的開發(fā)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜（購自徐州市世紀(jì)華聯(lián)超市）：清洗干凈后切成薄片，于電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，用粉碎機(jī)磨成粉，過網(wǎng)篩備用。

纖維素酶（10萬U/g），和氏璧生物科技有限公司;香草醛（≥ 99%），西隴科學(xué)化工;無水乙醇、亞硝酸鈉（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺（均為分析純），阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海慧泰儀器制造有限公司;L550醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;HH-M4恒溫水浴鍋，上海赫田科學(xué)儀器有限公司;UV-2550紫外分光光度計，日本島津;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;195（A65412906）真空冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO公司;FA2004B電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司;723C可見分光光度計，上海欣茂儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 姜辣素的提取。

采用纖維素酶法輔助提取姜辣素，稱取粉碎過篩的生姜粉0.1 g，加入一定質(zhì)量的纖維素酶，將其溶解在一定體積的蒸餾水中，置于水浴鍋內(nèi)，在一定溫度下提取一定時間，添加無水乙醇，于55 ℃萃取和沉淀25 min，之后置于離心機(jī)內(nèi)，于4 000 r/min離心15 min，抽濾，得上清液備用。

1.3.2 香草醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。制作200 μg/mL香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.01 g香草醛置于容器中，量取50 mL無水乙醇對其進(jìn)行充分溶解。分別量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL容量瓶中，用無水乙醇進(jìn)行定容，充分搖勻。以無水乙醇為空白，在280 nm條件下測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 姜辣素提取率的測定。取“1.3.1”得到的上清液1 mL于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，充分搖勻后于280 nm測定，按下式計算姜辣素的提取率：

T（%）=（2.003×C×N×V）/（106×M）×100

式中，T為姜辣素的提取率，%;C為樣品吸光值對應(yīng)的香草醛濃度，μg/mL;N為樣品的稀釋倍數(shù);M為生姜粉的質(zhì)量，g;V為樣品的體積， mL;2.003為香草醛與姜辣素之間的換算系數(shù)。

1.3.4 姜辣素粗提物粉末的制備。將姜辣素上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，溫度調(diào)至50 ℃蒸發(fā)除去乙醇。剩余溶液置于冷凍干燥機(jī)中冷凍，得到姜辣素粉末。

1.3.5 亞硝酸鹽清除率的測定。

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的姜辣素粉末，量取一定體積的蒸餾水對其進(jìn)行充分溶解，配成一定濃度的姜辣素溶液。取一定體積的姜辣素溶液，量取5 μg/mL NaNO2溶液2.0 mL加入其中，置于水浴鍋內(nèi)，在不同溫度條件下反應(yīng)一定時間。取出后立即量取0.4%對氨基苯磺酸2.0 mL加入其中，充分混勻，靜置5 min，然后量取0.2% 鹽酸萘乙二胺溶液1.0? mL加入其中，靜置15 min，使其進(jìn)行充分反應(yīng)。取1 mL該溶液置于10 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，充分搖勻后于538 nm條件下測定吸光值（A），同時以蒸餾水代替NaNO2溶液作為空白對照進(jìn)行測定，吸光值用A01表示，以蒸餾水代替姜辣素溶液作為空白對照進(jìn)行測定，吸光值用A02表示，姜辣素對亞硝酸鹽的清除率按下式計算[12]：

Q（%）=（A02+A01-A）/A02×100

式中，Q為亞硝酸鹽的清除率，%;A為樣品的吸光值;A01為以蒸餾水代替NaNO2溶液空白對照的吸光值;A02為蒸餾水代替姜辣素溶液空白對照的吸光值。

1.4 纖維素酶法輔助提取姜辣素的最優(yōu)工藝條件研究

1.4.1 單因素試驗。

1.4.1.1 酶添加量對提取效果的影響。

稱取生姜粉末0.1 g，酶添加量分別為0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%（以生姜粉質(zhì)量計，即分別添加纖維素酶0.000 6、0.001 0、0.001 4、0.001 8、0.002 2 g），將其溶解于8.5 mL蒸餾水中，即料液比為1∶85 （生姜粉質(zhì)量∶蒸餾水體積，g/ mL），置于恒溫水浴鍋內(nèi)，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為85 min，確定最佳酶添加量。

1.4.1.2 料液比對提取效果的影響。

稱取生姜粉末0.1 g，纖維素酶添加量為1.4%，分別將其溶解在料液比為1∶25、1∶40、1∶55、1∶70、1∶85（g/mL）的蒸餾水中，置于恒溫水浴鍋內(nèi)，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為85 min，確定最佳料液比。

1.4.1.3 酶解溫度對提取效果的影響。

稱取生姜粉末0.1 g，纖維素酶添加量為1.4%，將其溶解在5.5 mL蒸餾水中，料液比為1∶55，置于水浴鍋內(nèi)，分別在25、35、45、55、65 ℃下提取85 min，確定酶解溫度。

1.4.1.4 酶解時間對提取效果的影響。

稱取生姜粉末0.1 g，纖維素酶添加量為1.4%，將其溶解在5.5 mL蒸餾水中，料液比為1∶55，置于恒溫水浴鍋內(nèi)，酶解溫度為55 ℃，分別提取25、55、85、115、145 min，確定酶解時間。

1.4.2 正交試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計4因素3水平L9（34）的正交試驗（表1），篩選最佳工藝條件。

1.5 姜辣素清除亞硝酸鹽的最優(yōu)條件研究

1.5.1 單因素試驗。

1.5.1.1 姜辣素濃度對清除效果的影響。

分別制作濃度為5、10、15、20、25 mg/mL的姜辣素溶液，取3.5 mL加入2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，混勻后置于水浴鍋內(nèi)，溫度調(diào)至55 ℃，加熱15 min，確定最佳濃度。

1.5.1.2 溫度對清除效果的影響。配制15 mg/mL姜辣素溶液，取3.5 mL加入2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，充分混合后置于水浴鍋內(nèi)，溫度分別調(diào)至40、55、70、85、100 ℃，反應(yīng)時間為15 min，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.5.1.3 時間對清除效果的影響。

配制15 mg/mL姜辣素溶液，取3.5 mL加入2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，充分混合后置于水浴鍋內(nèi)，溫度調(diào)至70 ℃，反應(yīng)時間分別為5、10、15、20、25 min，確定最佳反應(yīng)時間。

1.5.1.4 姜辣素添加量對清除效果的影響。

配制15 mg/mL姜辣素溶液，分別取1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mL，加入2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，混合均勻后置于70 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)15 min，確定姜辣素的最佳添加量。

1.5.2 正交試驗。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計4因素3水平L9（34）正交試驗，篩選姜辣素清除亞硝酸鹽的最佳條件（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 香草醛標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)“1.3.2”方法，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由圖1可知，回歸方程為y=0.069 3x-0.013 4，R2=0.999 3。

2.2 纖維素酶法輔助提取姜辣素的最優(yōu)工藝條件

2.2.1 單因素試驗結(jié)果。

2.2.1.1 酶添加量對提取效果的影響。由圖2可知，當(dāng)酶添加量為1.4%時，提取率最高。當(dāng)酶添加量較低時，難以完全提取出姜辣素，提取率較低。酶添加量高于1.4%時，提取率反而下降，這是由于對纖維素酶的提取量達(dá)到飽和狀態(tài)[13]。因此，選擇1.4%作為最優(yōu)酶添加量。

2.2.1.2 料液比對提取效果的影響。由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶55時，提取率最高，提取效果最好。當(dāng)料液比小于1∶55 時，隨著料液比的增大，提取率逐漸增大。當(dāng)料液比大于1∶55時，提取率反而下降，這是由于當(dāng)料液比達(dá)到1∶55時，已經(jīng)基本達(dá)到飽和，添加過量的蒸餾水不僅會降低提取率，還會吸收熱量，增加熱能的消耗，增大了其他工藝的難度[14-16]。因此，選擇1∶55作為最優(yōu)料液比。

2.2.1.3 酶解溫度對提取效果的影響。由圖4可知，當(dāng)酶解溫度為55 ℃時，提取率最高。這是由于當(dāng)溫度較低時，酶解作用不徹底，因此提取率較低。當(dāng)溫度逐漸達(dá)到纖維素酶的最適溫度時，酶解作用完全，并且高溫條件下，分子運動速度大大提升，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，能夠提取出更多的姜辣素。然而，當(dāng)溫度大于55 ℃時，酶的活性降低，提取效果有所減弱[17]。因此，選擇55 ℃作為最優(yōu)酶解溫度。

2.2.1.4 酶解時間對提取效果的影響。由圖5可知，當(dāng)酶解時間為115 min時，提取率最高，提取效果最好。這是由于纖維素酶的活力隨著酶解時間的增加逐漸提升，酶解作用完全，能夠提取出更多的姜辣素，由此提取率提高[18]。當(dāng)酶解到達(dá)一定時間，姜辣素幾乎完全被提取出來，再延長時間，提取率反而有所下降。因此，選擇115 min作為最優(yōu)酶解時間。

2.2.2 正交試驗結(jié)果。根據(jù)極差值可知這4個因素對姜辣

素提取效果的影響程度，由表3可知，影響程度由高到低依

次為料液比、酶添加量、酶解溫度、酶解時間。方差分析表明，4個因素對提取效果的影響程度均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。由此確定纖維素酶法輔助提取姜辣素的最優(yōu)工藝條件為酶添加量1.4%，料液比1∶40，酶解溫度65 ℃，酶解時間85 min。在該條件下重復(fù)試驗3次，平均提取率為2.61%。

2.3 姜辣素清除亞硝酸鹽的最優(yōu)反應(yīng)條件

2.3.1 單因素試驗結(jié)果。

2.3.1.1 姜辣素濃度對亞硝酸鹽清除效果的影響。由圖6可知，當(dāng)姜辣素濃度為15 mg/mL時，對亞硝酸鹽的清除率最高，清除效果最好。當(dāng)濃度低于15 mg/mL時，清除率果隨著姜辣素濃度的升高而提高，當(dāng)濃度高于15 mg/mL時，清除率反而降低，清除效果逐漸減弱。因此，選擇15 mg/mL作為最優(yōu)姜辣素濃度。

2.3.1.2 溫度對亞硝酸鹽清除效果的影響。由圖7可知，當(dāng)溫度高于70 ℃時，清除率變化不大。當(dāng)溫度低于70 ℃時，清除率隨著溫度的升高而增大，這是由于較高的反應(yīng)溫度使分子運動的速度大大提升，促進(jìn)了姜辣素與亞硝酸鹽發(fā)生反應(yīng)，從而提高了亞硝酸鹽的清除率。因此，選擇70 ℃作為最優(yōu)反應(yīng)溫度。

2.3.1.3 時間對亞硝酸鹽清除效果的影響。由圖8可知，當(dāng)反應(yīng)時間為15 min時，姜辣素對亞硝酸鹽清除率最高，清除效果最好。當(dāng)時間小于15 min時，清除率隨著時間的推移而提高。這是由于當(dāng)反應(yīng)時間為15 min時，姜辣素與亞硝酸鹽的反應(yīng)較為徹底，因此對亞硝酸鹽的清除率達(dá)到最高，超過15 min，對亞硝酸鹽的清除率反而有所降低。因此，選擇15 min作為最優(yōu)反應(yīng)時間。

2.3.1.4 姜辣素添加量對亞硝酸鹽清除效果的影響。由圖9可知，當(dāng)姜辣素添加量為3.5 mL時，清除率最高，清除效果最好。當(dāng)姜辣素添加量小于3.5 mL時，清除率隨著添加量的增大而提高，當(dāng)添加量大于3.5 mL時，清除率反而降低。因此，選擇3.5 mL作為最優(yōu)姜辣素添加量。

2.3.2 正交試驗結(jié)果。根據(jù)極差值可以看出姜辣素濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、姜辣素添加量這4個因素對清除效果的影響程度，由表4可知，影響程度由高到低依次為反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、姜辣素添加量、姜辣素濃度。方差分析表明，4個因素對清除效果的影響程度均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。由此確定姜辣素清除亞硝酸鹽的最優(yōu)反應(yīng)條件為姜辣素濃度15 mg/mL，反應(yīng)溫度80 ℃，反應(yīng)時間20 min，姜辣素添加量4.5 mL。在該條件下試驗重復(fù)3次，平均清除率為98.74%。

3 結(jié)論

近年來，許多天然源植物提取物陸續(xù)被證明可作為有效的亞硝酸鹽清除劑與亞硝胺合成阻斷劑，主要活性成分包括酚類、還原糖和多糖類、維生素類、氧化還原酶類等多種化學(xué)類型[19-23]。該試驗采用纖維素酶法輔助提取姜辣素，確定了姜辣素的最優(yōu)提取工藝條件及姜辣素清除亞硝酸鹽的最優(yōu)反應(yīng)條件。在最優(yōu)工藝條件下姜辣素平均提取率為2.61%，亞硝酸鹽的平均清除率可達(dá)98.74%，說明姜辣素可作為一種高效的亞硝酸鹽清除劑應(yīng)用于食品工業(yè)。

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