桃金娘水提物對小鼠經(jīng)口給藥急性和亞急性毒性研究

王河，黃鑫，陳少鋒，楊增艷，梁麗清，譚蓓蓓

(1. 廣西中醫(yī)藥大學附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530200；2. 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，廣西 南寧 530007)

桃金娘(拉丁學名：Rhodomyrtustomentosa)，又稱崗菍、山菍、菍子樹等，為桃金娘科植物，桃金娘屬矮小常綠灌木，在我國主要分布在南部各省，尤為廣西、廣東、臺灣等地常見。系我國民間常用中藥材，其全株和果實均可入藥，具有活血通絡、收斂解毒、補虛止血等功效[1]?！秹阉庍x篇》[2]中記載，桃金娘根具有調(diào)龍路、火路，祛濕毒之功用；用于痹病(發(fā)旺)，黃疸(黃標)，崩漏(病淋勒)，頭痛(巧尹)和腰肌勞損等。但其臨床應用多停留在民間傳統(tǒng)經(jīng)驗基礎上，尤為基層畜牧獸醫(yī)藥用常見，用作治療牛勞役過度、豬腸炎、豬牛風濕軟腳、牛閹割后出血不止、仔豬和犢牛白痢等疾病[3]。桃金娘作為一種重要的中藥植物，具有悠久的臨床應用歷史。近年來它的藥用價值和營養(yǎng)特性廣受國內(nèi)外研究人員的重視?，F(xiàn)代研究證明，其富含多酚類、黃酮類、三萜類和多糖類化合物[4]，且具有抗氧化[5]、抗炎[6-7]、抗菌[8-9]、抗癌[10]等生物活性，但其毒理學研究尚未有報道，安全性也未經(jīng)科學驗證。為探討桃金娘根水提物的臨床安全性，本研究利用小鼠進行了急性毒性和亞急性毒性試驗，為桃金娘的開發(fā)利用和安全性提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

桃金娘鮮根采自廣西南寧市武鳴區(qū)大明山，由廣西民族醫(yī)藥研究院黃瑞松教授鑒定為桃金娘科植物桃金娘屬的地下根。藥材切片后自然晾干，粉碎成粗粉。稱取250 g藥粉，加8倍量水浸泡過夜，沸水提取2 h，過濾；濾渣加4倍量水，沸水提取2 h，過濾，合并濾液，水浴濃縮至5 g/mL濃度溶液，所得提取液置2～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物

SPF級KM小鼠雌雄各半，體重18～22 g，購自廣西醫(yī)科大學(廣西實驗動物中心)，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2014-0002。將小鼠置于26 ℃室溫，相對濕度60%左右的環(huán)境下，自然光照晝夜更替，給予標準動物飼料和純化水喂養(yǎng)。試驗前，全部小鼠在實驗室條件下適應性馴養(yǎng)7 d。

1.3 主要試劑

戊巴比妥鈉(北京諾博萊德)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(T-Bil)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)測定試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司。

1.4 急性經(jīng)口毒性預試驗

取小鼠18只，雌雄各半，并隨機分成單日給藥1次試驗組、2次給藥試驗組和3次給藥試驗組，每組6只，禁食不禁水14 h后，以單位體重單次最大灌胃量(0.04 mL/g)給予桃金娘水提物(200 g/kg)，給小鼠灌胃。連續(xù)觀察7 d，試驗動物均無死亡，無法測出桃金娘水提物的LD50。

1.5 急性經(jīng)口毒性試驗

將24只小鼠，雌雄各半分籠飼養(yǎng)，隨機分成雌性、雄性空白組，雌性、雄性給藥組，每組6只。禁食不禁水14 h后，給藥組小鼠以單位體重給藥，最大灌胃體積(0.04 mL/g)經(jīng)口給予桃金娘水提物(200 g/kg)，以6 h為間隔連續(xù)給藥3次，空白組給予等體積的純化水處理，建立陰性對照。給藥后30 min內(nèi)對所有動物進行密切觀察;前4 h內(nèi)至少30 min觀察1次；24 h后每天觀察1次，連續(xù)14 d。所有的觀察包括小鼠皮毛、眼睛和黏膜的變化，以及給藥后的運動和精神狀況。此外，還觀察抽搐、震顫、流涎、嗜睡、昏迷和死亡情況。每天記錄攝食量，每周末記錄小鼠體重。

1.6 亞急性經(jīng)口毒性試驗

將48只小鼠隨機分成4組：桃金娘水提物高劑量組(9.1 g/kg)、中劑量組(4.55 g/kg)、低劑量組(2.27 g/kg)和空白對照組(純化水)。每組12只，雌雄各半分籠飼養(yǎng)。每組小鼠以最大灌胃體積(0.04 mL/g)給予對應的藥物經(jīng)口給藥，每日1次，連續(xù)給藥28 d。給藥后每天監(jiān)測小鼠的生活狀況，記錄死亡率和食物消耗量，觀察小鼠的中毒跡象。每周末記錄各組小鼠體重[11]。

1.7 血清生化檢測

每個試驗結束時(急性經(jīng)口毒性試驗第15天，亞急性經(jīng)口毒性試驗第29天)，對所有動物腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg,麻醉后摘眼球取血，血樣放置在普通離心管中，室溫下靜置30 min，待血液凝固后，置4 ℃高速冷凍離心機，以4 500 r/min離心15 min，取上清液置全自動生化分析儀進行肝功能和腎功能相關指標含量分析。

1.8 病理檢查

分別在試驗結束時對急性和亞急性毒性試驗的小鼠進行尸檢。采血結束后，小鼠沿腹部中線解剖切除心、肝、脾、肺、腎五大重要器官，觀察各臟器質(zhì)地以及有無肉眼可見的病理變化，濾紙吸干器官表面血液后稱重。根據(jù)公式計算臟器指數(shù)[12]：

相對器官重量(臟器指數(shù))=(絕對器官重量/死前體重)×100%。

如果肉眼觀察有病變且臟器指數(shù)與空白組比較有顯著差異，則進一步做病理切片檢查。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA檢驗，LSD多重比較。結果用“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果

2.1 生命體征和行為分析

在整個急性和亞急性經(jīng)口毒性試驗研究過程中，小鼠均未出現(xiàn)死亡。急性試驗組給予桃金娘水提物后前4 h，所有小鼠糞便呈暗棕色與藥物顏色相近，個別小鼠出現(xiàn)便溏現(xiàn)象，且該組小鼠表現(xiàn)為倦怠、活動減少、不思飲食，4 h后上述癥狀慢慢消失，第2天恢復正常與空白組生活狀況無差異。2個試驗組小鼠未出現(xiàn)因給藥而產(chǎn)生的嚴重中毒事件發(fā)生。整個觀察過程中，所有小鼠的皮毛、呼吸系統(tǒng)，內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)均未出現(xiàn)明顯異常。

2.2 攝食量和體重變化

給藥后每隔7 d對各組小鼠攝食量和體重做1次統(tǒng)計分析，急性和亞急性經(jīng)口毒性試驗中各給藥組和空白組的小鼠體重均有逐漸增長趨勢，與空白組相比給藥組的體重變化無顯著差異(P>0.05)。兩項試驗中，給藥組的攝食量與空白組比較，除亞急性經(jīng)口給藥試驗在第2周高劑量雄性組差異顯著(P<0.05)外，其余各組均無顯著差異(P>0.05)，詳見表1～表3所示。

表1 桃金娘水提物急性經(jīng)口毒性試驗對小鼠體重及攝食量影響(n=6)

表2 桃金娘水提物亞急性經(jīng)口毒性試驗對小鼠體重的影響(n=6) g

表3 桃金娘水提物亞急性經(jīng)口毒性試驗對小鼠攝食量的影響(n=6) g/d

2.3 宏觀臟器病變觀察和臟器指數(shù)

在急性和亞急性兩項經(jīng)口毒性試驗中，各組小鼠的臟器質(zhì)地均勻、色澤鮮艷和外形正常，給藥組未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病理變化。與空白組比較，給藥組的臟器指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，如表4、表5所示。

表4 桃金娘水提物急性經(jīng)口毒性試驗小鼠臟器指數(shù)(n=6)

表5 桃金娘水提物亞急性經(jīng)口毒性試驗小鼠臟器指數(shù)(n=6)

2.4 血清生化檢測

急性經(jīng)口毒性試驗空白組與給藥組的生化檢測參數(shù)結果見表6，給藥組和空白組間生化指標差異不顯著(P>0.05)；亞急性經(jīng)口毒性試驗空白組與各劑量給藥組的生化檢測參數(shù)結果見表7，各組間生化指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表6 急性經(jīng)口毒性試驗血液學指標(n=6)

表7 亞急性經(jīng)口毒性試驗血液學指標(n=6)

3 討論

長期以來植物藥在我國民間具有悠久的使用歷史和豐富的臨床經(jīng)驗，其在人類疾病救治、健康保健以及畜牧業(yè)中具有非常廣闊的開發(fā)前景[13]。然而在沒有現(xiàn)代科學研究基礎來充分支持藥用植物的安全性和有效性的前提下，使用該植物治療疾病潛在著很大的安全隱患。因此，通過科學的毒性研究方案來驗證藥用植物的安全性是非常有必要且重要的[12]。急性經(jīng)口毒性試驗作為一項最基本的對受試物進行風險評估的試驗，既可用于急性化學品接觸的危險分類，又可提供治療期內(nèi)經(jīng)口接觸受試物，可能潛在的危害健康信息，大部分化學品和中藥材的安全性評價都會首先進行急性經(jīng)口毒性試驗[14]。然而，急性毒性得到的試驗信息臨床應用有限，因為即使在極少的劑量下也會發(fā)生積累性中毒效應。因此，同時開展多劑量、重復給藥28 d的亞急性經(jīng)口毒性研究更有助于評價植物藥的安全性。

本研究的目的是，評價桃金娘地下根部分水提物經(jīng)口給藥后，對小鼠的急性和亞急性毒性作用，進而評價該藥是否會對人類造成危害。結果表明，桃金娘水提物在急性和亞急性試驗中，各組小鼠體重均呈增長趨勢，且整個治療過程中小鼠的精神狀態(tài)和生活狀況表現(xiàn)良好。除高劑量雄性組第2周攝食量下降顯著外，其余各給藥組與空白對照組小鼠之間的增重和攝食量沒有顯著差異。事后分析認為，可能是灌胃時刺激了小鼠食道造成的。在急性毒性試驗中，按單位體重給藥，給予小鼠最大單劑量200 g/kg，單日多次給藥后小鼠無死亡，無法測出LD50，提示桃金娘水提物潛在有毒物質(zhì)的可能性很低，且單日最大給藥量為600 g/kg，相當于60 kg體重成年人臨床日劑量的310倍。根據(jù)急性經(jīng)口毒性試驗數(shù)據(jù)使用分析，當LD50>5 000 mg/kg時，該受試物可歸為最低毒性等級，因此，桃金娘水提取物的急性毒性分類可歸類為第4類[15]，具有較低的急性毒性危害。

相對器官重量是評價藥物是否存在毒性的高度敏感指標之一[16]。心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟是人類和嚙齒類動物對攝入的物質(zhì)產(chǎn)生代謝反應的首要器官。因此，評價這五大器官的相對器官重量有助于診斷受試物對代謝器官是否產(chǎn)生損害。在急性和亞急性經(jīng)口毒性研究中，給藥組和空白對照組小鼠的相對臟器指數(shù)未出現(xiàn)顯著性差異，各組間內(nèi)臟的大體觀察其形狀大小、顏色和質(zhì)地也沒有差異。初步認定桃金娘水提取物對心、肝、脾、肺和腎基本無毒。

血液生化指標是判斷機體健康狀況的一項重要依據(jù)[17]。肝臟是機體重要的解毒器官，腎臟則是重要排毒器官，通過分析肝功能和腎功能的變化是判定植物藥安全性的重要指標。ALT主要存在肝組織中，而AST除了存在于肝臟外，還存在于心肌、骨骼肌、大腦和腎臟中[16]，ALT和AST均為重要的肝細胞內(nèi)酶，正常情況下血清中的含量極低，當肝臟受損、肝細胞受到破壞時，酶外滲進入血液從而導致血清中的ALT、AST水平升高。因此，檢測血清中該酶含量高低是評價肝細胞損傷和壞死程度的重要標志[18]。T-Bil由肝臟、脾臟和骨髓中的血紅蛋白分解形成。而發(fā)生溶血、肝炎或肝損傷均可引起血清中的膽紅素水平升高[19]。同時肝臟也是蛋白質(zhì)合成的主要場所，當肝細胞受損，肝臟分泌功能障礙時會引起血清中TP、ALB和GLO水平的降低。本次研究數(shù)據(jù)顯示，亞急性經(jīng)口毒性試驗中給藥組雄性小鼠的血清AST數(shù)值有所升高，但仍在正常線性范圍(4～800 U/L)，且急性和亞急性經(jīng)口毒性試驗的各給藥組肝功能指標，與空白對照組比較均無顯著性差異，因此桃金娘水提物在兩項毒性研究中未影響小鼠肝細胞功能以及肝臟分泌功能。

尿素是機體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物，當腎實質(zhì)受損時血清尿素濃度會升高，而發(fā)生中毒性肝炎時血清尿素則會降低；當腎臟功能受到損害，腎功能失代償時血清肌酐水平上升，同時腎功能減退時常伴隨著尿酸增高，因此尿素、肌酐和尿酸是作為毒性研究中評價腎功能損害的指標[20]。在急性和亞急性經(jīng)口毒性試驗中，血清中尿素、肌酐和尿酸水平?jīng)]有明顯變化，且給藥組與空白對照組比較無顯著性差異，因此可以認為桃金娘水提物無小鼠腎毒性。上述結果表明，桃金娘水提物在體重、器官重量、血清生化檢查和宏觀的器官病理檢查方面均未發(fā)現(xiàn)毒性現(xiàn)象，可認為該植物藥急性毒性小，安全性高。

綜上所述，按照經(jīng)口全身毒性藥物分類等級，桃金娘根水提取物可歸類為第4類，即最低毒性等級。其單日最大給藥量達到600 g/kg，相當于成年人體最低臨床日劑量的310倍，且對任何小鼠均未引起毒性反應。在亞急性經(jīng)口毒性試驗中每日給藥劑量為9.1、4.55、2.27 g/kg，連續(xù)28 d，雖然雄性小鼠AST指標有所升高但仍在參考數(shù)值范圍以內(nèi)，其他考察指標未出現(xiàn)與中毒有關的反應，提示桃金娘根水提取物的耐受性好，安全性高。本次研究僅為急性毒性研究，為確定桃金娘根水提取物的口服安全治療劑量，可能還需進行慢性毒性研究。