布魯氏菌病患者尿液差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

楊文濤，張建中，吳翠萍，王 磊，趙 利，倪秀瑩，藍(lán) 峰，姜 海，肖 迪

布魯氏菌病(Brucellosis，簡(jiǎn)稱(chēng)布病)是由布魯氏菌侵入機(jī)體所引發(fā)的傳染—變態(tài)反應(yīng)性傳染病，是在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播的一種人獸共患病，世界衛(wèi)生組織將布病列為7種最容易被忽視的疾病之一[1]。經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道，布病可通過(guò)分娩、哺乳、性交、輸血及骨髓移植等途徑在人與人之間傳播[2]。人患布病后，可發(fā)生多器官受損，在急性期因誤診或治療不當(dāng)可轉(zhuǎn)為慢性布病，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量，在我國(guó)乃至全球范圍內(nèi)疾病負(fù)擔(dān)巨大。人畜間布病疫情在全世界170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道，每年新發(fā)病例約有50萬(wàn)例，布病流行國(guó)家的患病率超過(guò)每10/10萬(wàn)人[3]。近年多有未直接接觸家畜的學(xué)生、兒童及離退休人員發(fā)病，表明布病已經(jīng)由主要的職業(yè)接觸感染向非職業(yè)的食源性感染轉(zhuǎn)變，通過(guò)食用生鮮羊奶導(dǎo)致的食源性暴發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)有發(fā)生[4]。

目前，布病診斷依賴(lài)血清免疫學(xué)檢查結(jié)合病原學(xué)細(xì)菌分離實(shí)驗(yàn)。常用的血清學(xué)檢查方法有虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)等。隨著國(guó)家對(duì)布病的重視，快速檢測(cè)技術(shù)已取得長(zhǎng)足進(jìn)步，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、膠體金免疫層析法等檢測(cè)方法逐步開(kāi)始使用，但現(xiàn)有技術(shù)仍存在一定缺陷，對(duì)臨床診斷存在較大的漏診和誤診率[5]。實(shí)時(shí)熒光PCR是目前病原體檢測(cè)應(yīng)用廣泛和穩(wěn)定的分子診斷技術(shù)，在新突發(fā)性傳染病相關(guān)病原體感染的實(shí)驗(yàn)室確證中具有不可替代的地位和作用[6]。但在病原體分子檢測(cè)領(lǐng)域存在突出問(wèn)題：核心探針技術(shù)無(wú)自主知識(shí)產(chǎn)品，需要發(fā)展具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)且性能更好的核心探針技術(shù)；布魯氏菌熒光PCR檢測(cè)產(chǎn)品尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化試劑，且無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程。針對(duì)國(guó)家高致病性傳染病應(yīng)急處置的重大需求，創(chuàng)建新突發(fā)傳染病診斷方法、診斷試劑應(yīng)急研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化技術(shù)平臺(tái)，形成快速響應(yīng)體系迫在眉睫[7]。

繼二維凝膠電泳-質(zhì)譜可視化差異蛋白發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)技術(shù)之后，基于高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)系統(tǒng)(UPLC-MS/MS)的定量差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已發(fā)展成熟，可實(shí)現(xiàn)快速、高通量地獲得樣本中差異表達(dá)的蛋白，在發(fā)現(xiàn)診斷標(biāo)志物、確定疫苗相關(guān)抗原、發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點(diǎn)、闡述致病機(jī)理方面具有廣泛的應(yīng)用[8-9]。尿液是一種易獲得、患者接受度高的檢測(cè)分析物，已成為多種疾病或生理特征監(jiān)測(cè)與檢測(cè)的標(biāo)本[10]。迄今國(guó)內(nèi)外尚無(wú)采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在人尿液標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)及確定布病診斷標(biāo)示分子的報(bào)道。本研究將采用高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行布病相關(guān)尿液定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，通過(guò)專(zhuān)業(yè)軟件檢索確認(rèn)差異表達(dá)的蛋白，并通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行蛋白信號(hào)通路分析和生物標(biāo)志物篩選分析，從而獲得蛋白表達(dá)“全景圖”，發(fā)現(xiàn)潛在的診斷布病的標(biāo)志蛋白，挖掘關(guān)鍵蛋白的相關(guān)生物信息，在蛋白水平上為今后布病診斷、監(jiān)測(cè)及治療提供分子線索。

1 材料與方法

1.1 樣本信息 布病患者樣本來(lái)自于已通過(guò)血清學(xué)檢查確診，試管凝集試驗(yàn)(SAT)滴度為1∶100及以上或血培養(yǎng)中分離到布魯氏菌加之臨床表現(xiàn)或有流行病學(xué)史明確確診的人群。非布病患者樣本來(lái)源為非布魯氏菌感染、無(wú)臨床表現(xiàn)、無(wú)流行病學(xué)史的人群。兩組各10例樣本，按統(tǒng)一要求采集晨起中段尿液50 mL，采集后凍存-80 ℃。所有尿液樣本采集均經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)審核。

1.2 樣本前處理

1.2.1 尿液蛋白提取和定量 將樣本從-80 ℃冰箱中取出后，12 000 g 4 ℃離心10 min，取上清3.5 mL，加入8倍體積-20 ℃預(yù)冷含20%三氯乙酸(TCA)的丙酮溶液，混勻后將樣本置于-20 ℃過(guò)夜；12 000 g 4 ℃離心30 min后，棄上清，向沉淀中加入8倍體積-20 ℃預(yù)冷丙酮，振蕩混勻后置于-20 ℃ 4 h；12 000 g 4 ℃離心30 min后, 棄上清，室溫下靜止2～3 min使沉淀干燥。用8 mol/L尿素溶解蛋白沉淀，震蕩混勻后BCA試劑盒(Thermo Fisher Scientific, USA)測(cè)定蛋白濃度。

1.2.2 溶液內(nèi)酶解 向提取的蛋白溶液中，加入200 mmol/L 三(2-羧乙基)膦(TCEP)，混勻后室溫放置1 h進(jìn)行還原，再加入375 mmol/L碘乙酰胺(IAA)，混勻后避光放置30 min進(jìn)行烷基化。向處理好的樣本中加入6倍體積-20 ℃預(yù)冷丙酮，混勻后-20 ℃過(guò)夜放置，8 000 g 10 min 后棄上清，室溫下靜置2～3 min 使沉淀干燥，沉淀中加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3混勻，按胰酶和蛋白1∶50質(zhì)量比加入胰酶，混勻后37 ℃水浴過(guò)夜。

1.2.3 肽段除鹽和定量 向樣本中加入10%三氟乙酸(TFA)后，用C18 除鹽柱(Thermo Fisher Scientific, USA)對(duì)肽段進(jìn)行純化，氮?dú)獯蹈蓸颖尽?duì)所有樣本用肽段定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific, USA)進(jìn)行定量。

1.3 高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)分析 肽段定量后，每個(gè)樣本取1 μg肽段使用EASY-nLCTM1000色譜儀(Thermo Fisher Scientific, USA)進(jìn)行分離。流動(dòng)相A液為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈80%)。色譜分析柱: PepMap 100, nanoViper C18,100 ?, 3 μm, 75 μm×25 cm，預(yù)柱: PepMap 100, nanoViper C18,100 ?, 5 μm, 100 μm×2 cm。流速為300 nL/min。液相梯度設(shè)置：0～45 min, B液4%～15%；45～73 min，B液15%～25%;73～100 min, B液25%～40%; 100～105 min, B液40%～95%;105～120 min, B液95%。使用Q-ExactiveTMPlus質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific, USA)Full MS/ddMS2(TopN)串聯(lián)模式采集數(shù)據(jù)，具體參數(shù)為:全掃描一級(jí)譜圖范圍300～1 800 m/z，分辨率70 000，最大積分時(shí)間100 ms，離子目標(biāo)值3×106個(gè)。而后選擇10個(gè)最強(qiáng)母離子進(jìn)行二級(jí)數(shù)據(jù)采集，高能碰撞解離，分辨率17 500，最大積分時(shí)間60 ms，離子目標(biāo)值2×105個(gè)，設(shè)置串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為30 s。應(yīng)用 Xcalibur 軟件(version 4.1, Thermo Fisher Scientific, USA)記錄譜圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 為避免人為造成蛋白表達(dá)呈現(xiàn)差異，本研究采取以下方法確保數(shù)據(jù)的可靠性：為保證樣本處理一致性，同組尿液樣本同批次進(jìn)行樣本前處理；為保證定量準(zhǔn)確性，對(duì)所有酶切后的尿液蛋白肽段樣本進(jìn)行再定量，每個(gè)樣本均取1 μg肽段進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)分析；為保證色譜質(zhì)譜檢測(cè)的穩(wěn)定性，檢測(cè)樣本前高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行校正,并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用保留時(shí)間校正液對(duì)樣本出峰時(shí)間和雜質(zhì)峰進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

1.4.2 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析 將10例布病患者與10例非布病患者的尿液樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)比，采用Proteome Discoverer(version 2.4, Thermo Fisher Scientific, USA)軟件檢索Proteomes-Homo sapiens(Human)數(shù)據(jù)庫(kù)(20 600條蛋白序列，下載日期2020年8月26日)。選擇兩個(gè)酶解漏切位點(diǎn)；半胱氨酸脲甲基化(carbamidomethyl)為固定修飾，蛋氨酸氧化(oxidation)為可變修飾；肽質(zhì)量偏差為10 ppm，離子片段偏差為0.02 Da，用反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)去除假陽(yáng)性。

1.4.3 生物信息學(xué)分析 將歸一化處理后蛋白定量數(shù)據(jù)中蛋白水平FDR閾值設(shè)置為0.01，剔除任意缺失的數(shù)據(jù)，對(duì)歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，篩選組內(nèi)變異系數(shù)小于0.3的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并以非布病患者為對(duì)照得到蛋白表達(dá)的差異倍數(shù)(Fold Change)。將| Fold Change(log2)|>1.5，且BH法校正P<0.05定義為差異表達(dá)蛋白，同時(shí)對(duì)僅在一組中檢測(cè)到并在組內(nèi)無(wú)任意缺失的蛋白定義為特異表達(dá)蛋白或缺失表達(dá)蛋白。使用“悟空”平臺(tái)(https://www.omicsolution.org/wkomics/main/)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)和GO富集分析。應(yīng)用商業(yè)化生物信息分析軟件IPA(Ingenuity pathway analysis)對(duì)獲得的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行典型通路分析(Canonical pathways)和生物標(biāo)志物篩查分析(Biomarker filter)。

2 結(jié) 果

2.1 高分辨液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)采集 使用UPLC-MS/MS采集尿液樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，總離子流圖(Total Ion Chromatography，TIC)見(jiàn)圖1。本研究中質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集靈敏度高，TIC圖顯示所有樣本峰強(qiáng)度均大于1E10，同組的TIC圖總離子流強(qiáng)度變化趨勢(shì)基本一致，同組樣本的出峰時(shí)間偏差較小。

圖1 布病患者(A)和非布病患者(B)尿液樣本的總離子流圖

2.2 蛋白鑒定與數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 應(yīng)用Proteome Discoverer軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)檢索，采用label-free定量分析方法將布病患者與非布病患者尿液樣本原始數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到定性和定量蛋白的數(shù)據(jù)。蛋白數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖顯示了在每個(gè)采集時(shí)間點(diǎn)，譜圖與肽段的匹配(Peptide spectrum matching, PSM)的強(qiáng)度分布的集中范圍在105～1010(圖2A)，共采集到164 616條PSMs。樣本豐度圖顯示組內(nèi)樣本蛋白相應(yīng)肽段的豐度有較好的一致性，保證了定量分析時(shí)組間的可比性和定量的準(zhǔn)確度(圖2 B)。UPLC-MS/MS分析定性鑒定了1 817個(gè)蛋白(unique peptide≥1)，其中定量鑒定到1 732個(gè)蛋白，蛋白定量數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量控制后將其中873個(gè)蛋白用于后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析。經(jīng)差異倍數(shù)及顯著性水平篩選后，最終得到185個(gè)與布病相關(guān)的尿液差異表達(dá)蛋白，其中13個(gè)蛋白上調(diào)、172個(gè)蛋白下調(diào)，使用火山圖來(lái)確定兩組之間差異表達(dá)蛋白變化的意義。

圖2 散點(diǎn)圖(A)和樣本豐度圖(B)

和程度(圖3)。

圖3 差異表達(dá)蛋白火山圖

2.3 GO富集分析 使用GO二級(jí)術(shù)語(yǔ)的基因本體論分析，根據(jù)蛋白質(zhì)在3個(gè)主要類(lèi)別(細(xì)胞成分、分子功能和生物過(guò)程)中的參與情況對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)。185個(gè)差異表達(dá)蛋白主要為細(xì)胞外外泌體、質(zhì)膜和細(xì)胞外空間的成分；分子功能分類(lèi)表明，大多數(shù)差異表達(dá)蛋白的細(xì)胞功能與鈣離子結(jié)合、肝素結(jié)合及蛋白質(zhì)均與二聚活性有關(guān)；差異表達(dá)蛋白主要參與的生物過(guò)程包括細(xì)胞黏附、血管生成及細(xì)胞外基質(zhì)組織等(圖4)。布病患者中缺失表達(dá)的胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)功能分類(lèi)分析表明，該蛋白與骨骼系統(tǒng)發(fā)育、骨化和血小板脫顆粒等生物進(jìn)程有關(guān)。

圖4 差異表達(dá)蛋白GO富集分析(前15條)

2.4 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘 商業(yè)化軟件IPA是分析和挖掘多組學(xué)數(shù)據(jù)的生物信息分析平臺(tái)。IPA整合了已有公共數(shù)據(jù)庫(kù)、已知的生物學(xué)知識(shí)，經(jīng)幾百名科學(xué)家人工閱讀生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)、總結(jié)科研成果，構(gòu)建了包含700多萬(wàn)條生物信息的IPA支持?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，并不斷更新。IPA廣泛應(yīng)用在多組學(xué)研究、靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證、機(jī)制研究、生物網(wǎng)絡(luò)分析、生物標(biāo)記物研究等研究領(lǐng)域，具有分析全面、數(shù)據(jù)可靠的特點(diǎn)。本研究應(yīng)用IPA軟件對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行典型通路分析和生物標(biāo)志物篩查分析，以確保數(shù)據(jù)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性和準(zhǔn)確性。本研究在尿液樣本中共發(fā)現(xiàn)185個(gè)與布病相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，其中有1個(gè)蛋白在IPA數(shù)據(jù)庫(kù)中未匹配成功，因此對(duì)其余的184個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。這些差異表達(dá)蛋白參與疾病和功能排名前五的是：細(xì)胞妥協(xié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、癌癥、組織損傷和異常(圖5A)。這些差異表達(dá)蛋白參與了肝纖維化/肝星狀細(xì)胞活化、糖酵解、GP6 信號(hào)通路、LXR/RXR 激活和動(dòng)脈硬化信號(hào)等45個(gè)經(jīng)典通路(圖5B)。其中預(yù)測(cè)對(duì)糖酵解、GP6信號(hào)通路、LXR/RXR激活、葡萄糖生成及IL-15生產(chǎn)等共12個(gè)通路有抑制作用，預(yù)測(cè)對(duì)LPS/IL-1介導(dǎo)的RXR功能抑制通路有激活作用。本研究中發(fā)現(xiàn)IGF2蛋白在布病患者中表達(dá)缺失，其參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、器官形態(tài)和生物發(fā)育3種疾病和功能，重疊上下游調(diào)節(jié)因子后顯示有16個(gè)下游調(diào)節(jié)因子和6個(gè)上游調(diào)節(jié)因子(圖6)。對(duì)184個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物標(biāo)志物篩選分析，發(fā)現(xiàn)有30個(gè)蛋白已作為多種疾病的效應(yīng)、診斷、預(yù)測(cè)指標(biāo)，其余的154個(gè)差異表達(dá)蛋白目前尚未作為其他疾病的生物標(biāo)志物；此外有17個(gè)差異表達(dá)蛋白是本研究在人的尿液中首次發(fā)現(xiàn)并呈現(xiàn)布病表達(dá)差異的蛋白(表1)。

表1 人尿液中首次檢測(cè)到的17個(gè)差異表達(dá)蛋白

A：疾病和功能分布；B：信號(hào)通路分布

圖6 IGF2的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及上下游調(diào)節(jié)因子(橙色代表上游調(diào)節(jié)因子，藍(lán)色代表下游調(diào)節(jié)因子)

3 討 論

基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為研究生物標(biāo)志物的熱門(mén)工具，疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)有助于疾病的診斷、預(yù)后效果的評(píng)估以及藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，對(duì)臨床應(yīng)用和疾病監(jiān)測(cè)有著重要的意義。本研究采用UPLC-MS/MS對(duì)布病患者尿液進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)，采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)靈敏度高、樣本定量一致性較好，為發(fā)現(xiàn)布病感染相關(guān)的生物標(biāo)志分子提供了準(zhǔn)確和可比的蛋白數(shù)據(jù)。本研究是生物標(biāo)志分子的發(fā)現(xiàn)階段，獲得了大量的差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)，通過(guò)數(shù)據(jù)深度挖掘在蛋白表達(dá)差異倍數(shù)、生物標(biāo)志物應(yīng)用和參與的經(jīng)典信號(hào)通路分析方面發(fā)現(xiàn)更具研究意義的蛋白，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對(duì)所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，獲得切實(shí)可用的生物標(biāo)志分子，為開(kāi)發(fā)基于尿液的布魯氏菌感染診斷試劑提供靶標(biāo)抗原。

本研究共定性鑒定到1 817個(gè)蛋白，定量鑒定到1 732個(gè)蛋白。相較于非布病患者，布病患者尿液中有13個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，172個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。研究表明，機(jī)體感染病原體后，病原體與宿主免疫系統(tǒng)之間的持續(xù)相互作用會(huì)啟動(dòng)復(fù)雜的免疫反應(yīng)，以通過(guò)多種抗寄生物效應(yīng)子功能阻止病原體感染和生長(zhǎng)，包括抑制侵襲和細(xì)胞粘附，抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用[11]。與布病感染相關(guān)差異蛋白的GO富集分析中, 其中一些功能條目支持了目前研究認(rèn)為的可能與布病感染相關(guān)的分子生物學(xué)過(guò)程, 包括細(xì)胞黏附、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等。此外，基于IPA數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究發(fā)現(xiàn)17個(gè)蛋白在已有的人尿液相關(guān)研究中未見(jiàn)報(bào)道，這些差異表達(dá)蛋白可以對(duì)現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行補(bǔ)充。

布病患者尿液差異表達(dá)蛋白中IGF2、CD300分子樣家族成員f(CD300LF)、血清類(lèi)粘蛋白1和2(ORM1,ORM2)、富含亮氨酸α-2-糖蛋白1(LRG1)、SH3結(jié)構(gòu)域谷氨酸富集樣蛋白3(SH3BGRL3)、半胱氨酸豐富跨膜BMP調(diào)節(jié)劑1(CRIM1)和谷氨酸氨連接酶(GLUL)是更具潛力的診斷布病的候選標(biāo)示蛋白。

IGF2有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和新陳代謝的作用[12]。細(xì)菌感染后，細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖刺激單核巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、白細(xì)胞介素等，均可促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌，間接促成IGF2及其受體合成及分泌[13]。本研究發(fā)現(xiàn)IGF2在健康人尿液中正常表達(dá)[14]，并已經(jīng)用于威爾姆斯腫瘤、大腸癌、卵巢癌的診斷標(biāo)志物，但在布病患者尿液樣本中缺失表達(dá)，提示IGF2在尿液中缺失表達(dá)可能是布魯氏菌感染后的特異性表現(xiàn)，可作為潛在的布病診斷生物標(biāo)志物。人患布病的主要臨床表現(xiàn)是發(fā)熱、疲勞、關(guān)節(jié)痛和肌肉疼痛[15]，常見(jiàn)并發(fā)癥有骨關(guān)節(jié)炎[16-17]和血液系統(tǒng)并發(fā)癥[18]等。IGF2在體內(nèi)參與了骨骼系統(tǒng)的發(fā)展和血小板脫粒等生物進(jìn)程，提示尿液中IGF2的缺失表達(dá)可能對(duì)布病臨床并發(fā)癥有一定的預(yù)測(cè)作用。CD300家族的成員在白細(xì)胞膜上表達(dá)，該家族由7個(gè)基因組成，命名為CD300a到CD300g，可通過(guò)成對(duì)的觸發(fā)和抑制功能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[19]。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是一類(lèi)異質(zhì)性白細(xì)胞，被認(rèn)為是關(guān)鍵的抗原提呈細(xì)胞和免疫應(yīng)答的重要啟動(dòng)者[20]。CD300分子現(xiàn)已被證明其在體外和體內(nèi)都能調(diào)節(jié)DC的功能[21]。本研究中CD300LF表達(dá)上調(diào)8.57倍，但在已有的人尿液相關(guān)研究中CD300LF蛋白未見(jiàn)報(bào)道，提示CD300LF上調(diào)可能是診斷布病感染的重要尿液標(biāo)志蛋白。

潛在生物標(biāo)記物表達(dá)水平的改變經(jīng)常是非特異性的，并且可能在多種傳染性疾病中都會(huì)發(fā)生改變，這可能是炎癥介導(dǎo)的急性期反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[22]。ORM1和ORM2是與急性炎癥相關(guān)的蛋白，ORM蛋白主要的肝細(xì)胞中表達(dá)[23]。目前經(jīng)過(guò)驗(yàn)證ORM1的上調(diào)與乳腺癌有關(guān)[24]，腦脊液中ORM1的上調(diào)與慢性疲勞綜合癥有關(guān)[25]，血清中ORM1的上調(diào)與COVID-19相關(guān)[26]。本研究中ORM1和ORM2表達(dá)上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)分別為6.14和4.22，并參與了LXR/RXR激活、動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)、FXR/RXR激活和急性時(shí)相反應(yīng)信號(hào)等信號(hào)通路。有研究表明RXR與FXR的異二聚體和RXR與LXR的異二聚體均可參與免疫反應(yīng)[27-28]，進(jìn)一步的提示ORM1和ORM2可能是布病診斷及感染后調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫反應(yīng)的重要蛋白。LRG1是參與蛋白相互作用、細(xì)胞粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)菌感染的急性炎癥的蛋白[29]。LRG1在人血清中含量豐富，主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生，并與腫瘤發(fā)生和血管生成有關(guān)[30]。已有研究顯示LRG1的表達(dá)與亨廷頓病、帕金森病癡呆、肝癌、進(jìn)行性核上性癱瘓疾病有關(guān)，但目前并未作為任何疾病的標(biāo)志物。本研究中LRG1表達(dá)上調(diào)5.46倍，提示LRG1有潛力作為布病診斷候選標(biāo)示蛋白。

有研究在潰瘍性結(jié)腸炎患者尿液中檢測(cè)到SH3BGRL3上調(diào)，SH3BGRL3在尿路上皮癌中的高表達(dá)與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加和生存率降低有關(guān)[31]。本研究中發(fā)現(xiàn)SH3BGRL3表達(dá)上調(diào)8.66倍。CRIM1是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的拮抗因子，可抑制BMPs前蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腂MPs，并且可以抑制成熟的BMPs呈遞到細(xì)胞表面的過(guò)程[32]。本研究中CRIM1表達(dá)下調(diào)10倍(差異倍數(shù)為0.10)。谷氨酰胺連接酶在氨解毒、酸堿平衡和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[33]，并參與了血管生成過(guò)程中的病理性細(xì)胞遷移[34]。本研究中GLUL表達(dá)下調(diào)12.5倍(差異倍數(shù)為0.08)。因此，人尿液中蛋白SH3BGRL3表達(dá)上調(diào)、CRIM1表達(dá)下調(diào)和GLUL表達(dá)下調(diào)，可能對(duì)布病感染以及臨床并發(fā)癥的預(yù)測(cè)有指示作用。

布魯氏菌最重要的特征是能夠在吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖。布魯氏菌主要毒力因子包括脂多糖(LPS)、T4SS分泌系統(tǒng)和BvrR/BvrS系統(tǒng)，它們可以與宿主細(xì)胞表面相互作用，形成早、晚BCV(含空泡的布魯氏菌)，并在細(xì)菌繁殖時(shí)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)相互作用[35]。目前對(duì)布魯氏菌致病機(jī)制研究表明布魯氏菌含有不同的毒力因子，可降低抗原提呈細(xì)胞的吞噬能力與抗原提呈能力，延緩細(xì)胞成熟，抑制細(xì)胞凋亡，減少相關(guān)細(xì)胞因子的釋放[36]。本研究中CD58等5個(gè)差異表達(dá)蛋白參與抑制樹(shù)突狀細(xì)胞成熟信號(hào)通路，表明這些差異表達(dá)蛋白可能延緩了細(xì)胞成熟，降低了機(jī)體對(duì)布病感染的免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子是免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和分化的重要調(diào)節(jié)因子，細(xì)菌和病毒感染、炎性細(xì)胞因子和抗原受體的結(jié)合都能誘導(dǎo)NF-κB的激活[37]。有文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)布魯氏菌強(qiáng)弱毒株侵染小鼠巨噬細(xì)胞后可以不同程度地激活NF-κB通路，而布魯氏菌LPS對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活的影響不大[38]。但本研究中顯示布病感染后EGF等5個(gè)差異表達(dá)蛋白參與抑制NF-κB信號(hào)通路，提示布病感染后導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)蛋白表達(dá)差異，從而影響對(duì)不同信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，因此人感染布病后對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響有待進(jìn)一步研究。

目前傳染病的常規(guī)診斷主要依賴(lài)于對(duì)致病病原生物的檢測(cè)以及臨床癥狀的檢查，但也可以通過(guò)宿主標(biāo)志物的分析實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體感染的敏感的和早期的診斷[39]。另外，臨床中應(yīng)用多個(gè)蛋白標(biāo)志物往往比單個(gè)標(biāo)志物在疾病機(jī)理，診斷和治療等方面可以提供更全面的信息[40]。本研究基于非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)潛在的布病相關(guān)標(biāo)志蛋白，為布病臨床診斷、監(jiān)測(cè)及治療提供了技術(shù)支撐。

利益沖突：無(wú)