豬鏈球菌2型強(qiáng)弱毒株對BALB/c小鼠腸道菌群影響的差異

許 格，王小敏，王俁棋，徐 鵬

豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是養(yǎng)豬業(yè)中最常見的病原菌之一，對養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成了極大的危害。豬鏈球菌亦可感染人類，引起多種致命疾病，如腦膜炎和鏈球菌中毒性休克綜合征，對人和動物的生命安全與健康構(gòu)成了重大威脅[1]。豬鏈球菌可分為29個血清型，豬鏈球菌2型(SS2)被認(rèn)為是流行最廣、最致命的血清型[1-2]。要引起疾病，豬鏈球菌就必須首先定殖于宿主，然后逃離宿主的免疫系統(tǒng)，使感染持續(xù)和傳播。豬是豬鏈球菌的主要宿主，研究表明豬鏈球菌的主要定殖和進(jìn)入位點(diǎn)是豬的上呼吸道，還可定殖于斷奶仔豬的胃腸道，所以胃腸道也成為豬鏈球菌感染的次要部位[3]。

腸道微生物不僅影響機(jī)會致病菌的生長，而且廣泛影響宿主的免疫狀態(tài)和功能[3-5]。腸道微生物在宿主防御和急性炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色，但影響宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育的特定微生物分子或組分仍在發(fā)現(xiàn)和研究中[5]。中性粒細(xì)胞是細(xì)菌感染早期激活的免疫細(xì)胞，可通過吞噬、胞外誘捕網(wǎng)等方式殺菌，對于豬鏈球菌感染的發(fā)生與發(fā)展十分重要，而腸道微生物對于中性粒細(xì)胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[6]。另外，有研究表明，BALB/c小鼠感染SS2后增加了糞便中變形桿菌等條件致病菌的比例，存在腸道微生態(tài)失調(diào)[3]。由此可見，腸道微生物可能影響著SS2的感染過程。本研究擬利用BALB/c小鼠感染模型，比較分析SS2強(qiáng)弱毒株對BALB/c小鼠結(jié)腸糞便中微生物菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 27只18日齡的SPF級BALB/c雌性小鼠(13±1)g購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，作為試驗(yàn)動物。

1.2 菌株 豬鏈球菌2型強(qiáng)菌株SS2-1和弱毒株HA0609均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離、保存和饋贈。

1.3 動物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為3組：空白對照組(Mock組)、SS2-1組和HA0609組，每組各9只。Mock組小鼠腹腔注射200 μL ddH2O, SS2-1組和HA0609組分別腹腔注射200 μL含有4×107CFU的SS2-1和HA0609。小鼠飼養(yǎng)條件清潔干凈，光照12 h/黑夜12 h晝夜循環(huán)，室溫約20 ℃。每天對小鼠攝食量、飲水量、行動活躍程度、體重、皮毛光澤度以及小鼠死亡進(jìn)行觀察和記錄，連續(xù)觀察至攻菌后的第7 d。各組小鼠于攻菌后的第7 d，頸椎脫臼處死后無菌條件下采集肺臟和結(jié)腸糞便置于無菌凍存管中。肺臟樣本立即進(jìn)行荷菌量測定，結(jié)腸糞便樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 肺臟荷菌量測定 采用菌落計(jì)數(shù)法測定小鼠臟器荷菌量，即無菌條件下取小鼠肺臟，稱重后進(jìn)行組織研磨勻漿，使用PBS梯度稀釋涂板后計(jì)數(shù)，以Log10 CFU/g表示。

1.5 測序和數(shù)據(jù)分析 將攻菌后第7 d采集的小鼠結(jié)腸糞便(如遇小鼠死亡，則取死亡當(dāng)日結(jié)腸內(nèi)糞便)，組內(nèi)每3只小鼠的糞便進(jìn)行混樣，空白對照組樣本標(biāo)記為Mock，豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株攻菌組標(biāo)記為SS2-1，豬鏈球菌2型弱毒株攻菌組標(biāo)記為HA0609。所有樣品干冰保存送至成都凱來博生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA的高通量測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析 測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體過濾得到有效數(shù)據(jù)后，對每個樣本測序量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；按照Vsearch、QIIME2等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU聚類、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、物種組成及差異分析等。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism6.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 豬鏈球菌2型小鼠模型實(shí)驗(yàn) 感染后2 d，BALB/c小鼠攝食量、飲水量和活躍程度下降，SS2-1組第3 d和第4 d各有3只和2只小鼠死亡，HA0609組第4 d有1只小鼠死亡。由圖1可知，Mock組的肺臟中未檢測到活菌，SS2-1組菌量顯著高于HA0609組(P<0.01)。

圖1 各組BALB/c 小鼠臟器的荷菌量

2.2 不同組別微生物OTUs的比較 一般認(rèn)定2個序列相似度為97%時屬于一個菌屬，當(dāng)相似度為99%時，認(rèn)定其是一個菌種。本文采用相似度為97%為一個OTU[7]，對樣品進(jìn)行OTU統(tǒng)計(jì)，Mock組、HA0609組和SS2-1組分別獲得1 125個，1 167個和1 383個(圖2)。

圖2 豬鏈球菌2型強(qiáng)弱毒株對BALB/c小鼠腸道微生物基因OTU分布的影響

2.3 豬鏈球菌2型強(qiáng)弱毒株對BALB/c小鼠腸道微生物群落Alpha多樣性的影響 Chao1和Observed species指數(shù)用于衡量樣本微生物群落的豐富度，Chao1指數(shù)越大，OTU數(shù)目越多，樣本數(shù)比較多。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量樣本微生物群落的多樣性，Shannon值越大說明群落多樣性越高，Simpson指數(shù)越大，即種類越均一，豐富度越低。Faith’s PD、Pielou’s evenness和Good’s coverage指數(shù)分別表征基于進(jìn)化的多樣性、均勻度和覆蓋度。由圖3可知，HA0609組與Mock組差異較小，而SS2-1組與Mock組差異較顯著。SS2-1組樣本物種數(shù)較多，但種類相對均一?？梢?，相對于Mock組和HA0609組，豬鏈球菌強(qiáng)毒株SS2-1 對小鼠腸道微生物群落的豐富度、多樣性等均有較顯著的影響。

圖3 豬鏈球菌2型強(qiáng)弱毒株對BALB/c小鼠腸道微生物多樣性指數(shù)的影響

2.4 豬鏈球菌2型強(qiáng)弱毒株對BALB/c小鼠腸道微生物群落Beta多樣性的影響 Beta多樣性是對不同生態(tài)系統(tǒng)之間的多樣性進(jìn)行比較，用以表示生物種類對環(huán)境異質(zhì)性的反應(yīng)[8]。兩點(diǎn)在坐標(biāo)軸上的投影距離越近，物種豐度組成就越相似。如圖4所示，三組樣品點(diǎn)的遠(yuǎn)近均能明顯的區(qū)分，這也表明三組的微生物物種存在著一定的覆蓋，但其多樣性亦存在差異。

左圖點(diǎn)的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)可分別表示該物種對樣本在這兩個維度上差異的貢獻(xiàn)大??；兩個坐標(biāo)軸括號中的百分?jǐn)?shù)分別為所有樣本在該維度上的物種豐度組成差異占總差異的比值。

2.5 豬鏈球菌2型強(qiáng)弱毒株對BALB/c小鼠腸道微生物科水平的影響 圖5為不同組別在科水平上腸道微生物的組成和結(jié)構(gòu)，科水平上共得到20個主要的細(xì)菌科。三組的優(yōu)勢菌科存在差異，其中SS2-1組的優(yōu)勢菌科是Lactobacillaceae(乳桿菌科)、S24-7(擬桿菌門S24-7菌科)、Rikenellaceae(理研菌科)、Bacteroidaceae(擬桿菌科)和Lachnospiraceae(毛螺菌科)；HA0609組的優(yōu)勢菌科是Lactobacillaceae(乳桿菌科)、S24-7(擬桿菌門S24-7菌科)、Enterococcaceae(腸球菌科)、Burkholderiaceae(伯克氏菌科)；Mock組的優(yōu)勢菌科是Lactobacillaceae(乳桿菌科)、S24-7(擬桿菌門S24-7菌科)、Enterococcaceae(腸球菌科)、Bacteroidaceae(擬桿菌科)和Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)。三組有著共同的優(yōu)勢菌科為Lactobacillaceae(乳桿菌科)和S24-7(擬桿菌門S24-7菌科)，但所占比例顯著不同。SS2-1組相對于HA0609組和Mock組，Lactobacillaceae(乳桿菌科)、Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)和Enterococcaceae(腸球菌科)減少，Rikenellaceae(理研菌科)、Lachnospiraceae(毛螺菌科)、Ruminococcaceae(瘤胃菌科)、F16(F16菌科)和Coriobacteriaceae(紅蝽菌科)顯著增多。

圖5 BALB/c小鼠腸道微生物科水平物種組成分析柱狀圖

2.6 聚類熱圖(Heatmap 圖)分析 在屬水平上，使用平均豐度前50位的屬的豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖(圖6)。熱圖通過顏色梯度及相似程度反映不同組別或不同樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。由聚類結(jié)果可知，SS2-1組、HA0609組和Mock組存在差異。相對于Mock組，SS2-1組和HA0609組的Enterococcus(腸球菌屬)、Akkermansia(艾克曼菌屬)、Lactococcus(乳球菌屬)、Butyricimonas(丁酸弧菌屬)相對豐度降低，Alistipes、Ruminococcus(瘤胃球菌屬)、Roseburia(羅氏菌屬)、Butyricicoccus(丁酸球菌屬)、Pediococcus(片球菌屬)和Coprobacillus(糞芽孢菌屬)相對豐度升高。

圖6 BALB/c小鼠腸道微生物屬水平熱圖

2.7 LEfSe(LDA Effect Size)分析 為了進(jìn)一步分析豬鏈球菌強(qiáng)弱毒株感染組和Mock組間的差異，我們使用LEfSe多級物種差異判別及組間差異比較，挖掘潛在的鑒別生物標(biāo)志[9](圖7)。從門到屬(從內(nèi)圈到外圈)主要分類等級上，相對于Mock組，感染組的差異物種為Proteobacteria(變形桿菌門)、Alphaproteobacteria(α-變形桿菌綱)和Burkholderiales(伯克氏菌目)。

圖7 基于LEfSe的組間差異分析

3 討 論

腸道菌群是宿主必不可少的組成部分，被譽(yù)為機(jī)體自身的“黑匣子”，影響著宿主的消化吸收能力、免疫力等方面，與代謝性疾病、感染性疾病、癌癥等密切相關(guān)[3,8,10-11]。研究表明，腸道微生物在肺炎鏈球菌感染過程中能夠增強(qiáng)肺炎鏈球菌的傳播、炎癥反應(yīng)和器官損傷等[3,9]。豬鏈球菌2型通常定殖在口咽部和胃腸道黏膜表面，而黏膜形成的物理和免疫屏障對侵入機(jī)體的病原體發(fā)揮阻擋和排除作用。因而，豬鏈球菌2型感染后的內(nèi)環(huán)境失衡也是豬鏈球菌2型定殖在宿主體內(nèi)的條件之一[3]。研究表明，鏈球菌感染后影響了小鼠腸道微生物的多樣性和構(gòu)成，增加了變形桿菌等條件致病菌的比例，增強(qiáng)了疾病發(fā)生的可能性[3]。本文為避免外界環(huán)境對腸道菌群的影響，選用結(jié)腸中的糞便，采用Illumina Miseq測序技術(shù)研究豬鏈球菌2型強(qiáng)弱毒株感染對小鼠腸道菌群多樣性的影響。結(jié)果表明，各組樣本的測序覆蓋率均達(dá)到0.99以上，測序覆蓋率較高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠；SS2-1組群落豐富度、多樣性與HA0609組和Mock組顯著不同。具體表現(xiàn)為，SS2-1組小鼠的腸道菌群OTU數(shù)量與Alpha多樣性高于HA0609組和Mock組，HA0609組與Mock組相似度最為接近。

人體腸道菌群以擬桿菌門和厚壁菌門為主，其次是變形菌門、放線菌門等[12]。人體和動物體內(nèi)有益的細(xì)菌主要為酪酸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等；致病菌主要為大腸桿菌、腸球菌、變形桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等。王小敏等[3]研究表明，SS2-1感染小鼠后，小鼠自身增加厚壁菌門和擬桿菌門等有益菌的比例，但同時也增加了變形桿菌等條件致病菌的比例。本文證實(shí)SS2-1組、HA0609組和Mock組有著共同的優(yōu)勢菌科，即Lactobacillaceae和S24-7，但所占比例不同。SS2-1組相對于HA0609組和Mock組，益生菌Lactobacillaceae和Prevotellaceae減少，具有致病性或潛在致病性的Rikenellaceae和Coriobacteriaceae增多，但潛在有益菌Lachnospiraceae和益生菌Ruminococcaceae亦有增多?？梢?，相對于HA0609組和Mock組，SS2-1感染小鼠后，菌群結(jié)構(gòu)改變，益生菌或潛在益生菌所占比例有增多亦有減少，致病菌或潛在致病菌增多，存在腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象，這一現(xiàn)象與王小敏等[3]的結(jié)果相一致。

相對于Mock組，感染組的致病菌Enterococcus、有益菌Akkermansia、Lactococcus和Butyricimonas相對豐度降低，Alistipes、Ruminococcus、Roseburia相對豐度升高。Akkermansia具有潛在的抗炎作用，能夠調(diào)節(jié)宿主的代謝紊亂，可以根據(jù)宿主的健康狀況幫助或傷害宿主[13-14]。Lactococcus具有良好的改善腸道屏障功能和抵抗致病微生物的作用[14]。Butyricimonas產(chǎn)生丁酸，丁酸是結(jié)腸能量的首選來源，對腸黏膜修復(fù)及結(jié)腸炎和結(jié)腸癌的預(yù)防起作用，然而，也有研究表明分離自健康人腸道內(nèi)的丁酸鹽產(chǎn)生菌能夠伴隨腸道菌群結(jié)構(gòu)的加速失衡加重實(shí)驗(yàn)動物的腸道炎癥[15-16]。Alistipes是一種容易導(dǎo)致腸道炎癥的致病菌[14]。由此說明，相對于Mock組，感染組的有益菌豐度降低，致病菌有降低亦有升高；產(chǎn)丁酸或丁酸鹽的Roseburia豐度升高，Butyricimonas豐度降低，可見豬鏈球菌2型感染后，產(chǎn)丁酸或丁酸鹽的菌豐度此消彼長，有降低亦有升高。

本研究通過LEfSe分析篩選差異性物種。結(jié)果表明，SS2-1組和HA0609組的差異物種為Proteobacteria、Burkholderiales和Alphaproteobacteria，而相對于HA0609組，SS2-1組的差異物種為致病菌變形桿菌門下的Alphaproteobacteria。這與王小敏等[3]發(fā)現(xiàn)SS2-1感染小鼠后，小鼠糞便菌群中變形桿菌這一致病菌的比例升高相一致。

綜上，豬鏈球菌2型感染后可改變小鼠結(jié)腸糞便的菌群結(jié)構(gòu)，弱毒株HA0609組與Mock組菌群豐富度和多樣性更為接近。強(qiáng)毒株SS2-1感染對小鼠結(jié)腸糞便菌群的豐富度和多樣性影響更為明顯，益菌所占比例減少，致病菌或潛在致病菌增多，腸道菌群失調(diào)。另外，變形桿菌門下的Alphaproteobacteria作為強(qiáng)毒株SS2-1組的差異物種，推測其可作為強(qiáng)毒株感染的潛在鑒別生物標(biāo)志，但仍需更深入的研究。

利益沖突：無